單分子檢測(cè)技術(shù)（課堂PPT）

1、單分子檢測(cè)單分子檢測(cè)Single Molecules Detection 高等分析化學(xué)與實(shí)驗(yàn)高等分析化學(xué)與實(shí)驗(yàn)2Outline of my presentationvIntroductionHistory and background Single Molecules Detection(SMD)vSMD in modern chemistry Electrochemical Detection Fluorescence Spectroscopy Localized Surface Plasmon Resonance(LSPR) A33Push your research into extre

2、mes! Extremely small space (sub micrometer to nanometer) Extremely low concentration (pico molar, femto molar 10-15, atto molar) Dynamic environment (binding, conformation changing, diffusion)Single Molecules D4定義定義v1.1. 單分子檢測(cè)技術(shù)是檢測(cè)靈敏度達(dá)到分子水平的單分子檢測(cè)技術(shù)是檢測(cè)靈敏度達(dá)到分子水平的一系列高靈敏檢測(cè)技術(shù)。一系列高靈敏檢測(cè)技術(shù)。v2.2.單分子檢測(cè)是分析化學(xué)家長(zhǎng)

3、期以來(lái)夢(mèng)寐以求的單分子檢測(cè)是分析化學(xué)家長(zhǎng)期以來(lái)夢(mèng)寐以求的一一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的前沿領(lǐng)域項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的前沿領(lǐng)域,達(dá)到了分子檢測(cè)靈敏達(dá)到了分子檢測(cè)靈敏度的極限度的極限,是物質(zhì)低含量監(jiān)測(cè)技術(shù)中最后一個(gè)里程是物質(zhì)低含量監(jiān)測(cè)技術(shù)中最后一個(gè)里程碑。碑。v特點(diǎn)：檢測(cè)空間尺度在納米數(shù)量級(jí)特點(diǎn)：檢測(cè)空間尺度在納米數(shù)量級(jí), ,檢測(cè)的分子數(shù)檢測(cè)的分子數(shù)目或相關(guān)事件一般在幾個(gè)目或相關(guān)事件一般在幾個(gè)( (次次) )到幾千個(gè)到幾千個(gè)( (次次) )的范的范圍。圍。5背景背景 我們?yōu)槭裁葱枰獑畏肿訖z測(cè)？我們?yōu)槭裁葱枰獑畏肿訖z測(cè)？ 對(duì)超靈敏度檢測(cè)技術(shù)的需求！對(duì)超靈敏度檢測(cè)技術(shù)的需求！ 例：例：AIDS的研究的研究 未檢出未檢出不

4、存在不存在6 2 3光學(xué)方法光學(xué)方法, ,包包括表面增強(qiáng)拉括表面增強(qiáng)拉曼光譜、共聚曼光譜、共聚焦熒光顯微法焦熒光顯微法等等掃描探針顯微掃描探針顯微方法方法, ,包括掃包括掃描隧道顯微鏡描隧道顯微鏡等等 研究方法研究方法 1化學(xué)方法化學(xué)方法, ,包包括電化學(xué)檢括電化學(xué)檢測(cè)，化學(xué)發(fā)測(cè)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等光檢測(cè)等7 共同特征共同特征123單分子檢測(cè)的研究方法單分子檢測(cè)的研究方法高空間分辨能高空間分辨能力；力；單分子性質(zhì)單分子性質(zhì)和行為的捕和行為的捕獲能力；獲能力；能收集微弱信能收集微弱信號(hào)并放大檢測(cè)號(hào)并放大檢測(cè), ,并做相應(yīng)的分并做相應(yīng)的分析處理以獲取析處理以獲取可信的信息?？尚诺男畔?。8單分子電化學(xué)檢

5、測(cè)單分子電化學(xué)檢測(cè)v 溶液中分子在兩個(gè)電極間進(jìn)行反復(fù)循環(huán)氧化還溶液中分子在兩個(gè)電極間進(jìn)行反復(fù)循環(huán)氧化還原反應(yīng)原反應(yīng),形成回路和可測(cè)量的電流形成回路和可測(cè)量的電流,據(jù)此可進(jìn)行據(jù)此可進(jìn)行SMD.v 通過(guò)使用特制的納米微電極，將少量待測(cè)電通過(guò)使用特制的納米微電極，將少量待測(cè)電活性分子捕獲在納米微電極與基底之間；在擴(kuò)散活性分子捕獲在納米微電極與基底之間；在擴(kuò)散作用下，分子穿梭于微電極與基底之間，從而形作用下，分子穿梭于微電極與基底之間，從而形成電流，通過(guò)檢測(cè)形成的電流從而實(shí)現(xiàn)單分子的成電流，通過(guò)檢測(cè)形成的電流從而實(shí)現(xiàn)單分子的檢測(cè)。檢測(cè)。v可以確定半反應(yīng)電勢(shì)自由能及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可以確定半反應(yīng)電勢(shì)自由能及反

6、應(yīng)動(dòng)力學(xué)9單分子電化學(xué)檢測(cè)單分子電化學(xué)檢測(cè)v單分子的電化學(xué)檢測(cè)的兩個(gè)前提條件單分子的電化學(xué)檢測(cè)的兩個(gè)前提條件: v (1)要能獨(dú)立檢測(cè)發(fā)生在納米尺度空間的反應(yīng)要能獨(dú)立檢測(cè)發(fā)生在納米尺度空間的反應(yīng)變化變化,實(shí)現(xiàn)對(duì)有限個(gè)數(shù)分子的捕獲。（使用納米微實(shí)現(xiàn)對(duì)有限個(gè)數(shù)分子的捕獲。（使用納米微電極）電極）v (2)需要把反映單分子行為的微弱信號(hào)放大到需要把反映單分子行為的微弱信號(hào)放大到可以檢測(cè)的程度?？梢詸z測(cè)的程度。10單分子電化學(xué)檢測(cè)單分子電化學(xué)檢測(cè)檢測(cè)分子：三甲銨甲基二茂鐵檢測(cè)分子：三甲銨甲基二茂鐵 (Cp2FeTMA+)電解質(zhì)：電解質(zhì)：NaNO3電極：電極：Pt-Ir微電極，包裹在納米級(jí)厚微電極，包裹

7、在納米級(jí)厚 度的蠟鞘中。度的蠟鞘中。基底：導(dǎo)電基底基底：導(dǎo)電基底檢測(cè)方法：掃描電化學(xué)顯微鏡，并采用檢測(cè)方法：掃描電化學(xué)顯微鏡，并采用 正反饋工作模式實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大正反饋工作模式實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大, 檢測(cè)到檢測(cè)到pA級(jí)電流。級(jí)電流。結(jié)果：探針電流呈現(xiàn)離散變化。結(jié)果：探針電流呈現(xiàn)離散變化。 電流值為電流值為0. 5 pA、1. 0 pA和和0 pA的概率大的概率大,這這3個(gè)電流值分別對(duì)應(yīng)著在個(gè)電流值分別對(duì)應(yīng)著在探測(cè)空間中存在探測(cè)空間中存在1個(gè)、個(gè)、2個(gè)或個(gè)或0個(gè)電活性個(gè)電活性分子。分子。11單分子電化學(xué)檢測(cè)單分子電化學(xué)檢測(cè) 檢測(cè)分子本身檢測(cè)分子本身的電荷變化，是的電荷變化，是一種直接檢測(cè)；一種直接檢測(cè)；幾

8、乎不影響被測(cè)幾乎不影響被測(cè)對(duì)象；適合和其對(duì)象；適合和其他方法聯(lián)用他方法聯(lián)用優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn) 電極制備復(fù)電極制備復(fù)雜，合格率較雜，合格率較低；電極不一低；電極不一樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性不好。重現(xiàn)性不好。12單分子熒光檢測(cè)單分子熒光檢測(cè)v基本原理基本原理:在激光照射下在激光照射下,熒光分子從基態(tài)到激發(fā)熒光分子從基態(tài)到激發(fā)態(tài)態(tài),發(fā)射光子回到基態(tài)。根據(jù)熒光壽命和分子在激發(fā)射光子回到基態(tài)。根據(jù)熒光壽命和分子在激光束中停留時(shí)間光束中停留時(shí)間,可算出單個(gè)分子發(fā)射的最大光子可算出單個(gè)分子發(fā)射的最大光子數(shù)為數(shù)為105106。目前光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)收集、檢測(cè)。目前光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)收集、檢測(cè)光子的效率約為光子的效率約為1%或

9、或0.5%5%,故單個(gè)分子故單個(gè)分子仍可被檢測(cè)到數(shù)千光子信號(hào)。仍可被檢測(cè)到數(shù)千光子信號(hào)。v檢出限約為檢出限約為10-13mol/L，應(yīng)用最廣！，應(yīng)用最廣！13單分子熒光檢測(cè)單分子熒光檢測(cè)單分子的識(shí)別單分子的識(shí)別 1.光譜法；光譜法； 2.熒光壽命法，納秒級(jí)；熒光壽命法，納秒級(jí)； 3.光子爆發(fā)量光子爆發(fā)量(強(qiáng)度強(qiáng)度)，分子不同，分子不同,熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率等光物理性質(zhì)不同等光物理性質(zhì)不同,導(dǎo)致發(fā)射的光子數(shù)不同；導(dǎo)致發(fā)射的光子數(shù)不同； 4.時(shí)間分辨熒光各向異性。時(shí)間分辨熒光各向異性。14單分子熒光檢測(cè)單分子熒光檢測(cè) 操作基本無(wú)太操作基本無(wú)太大難度，易于實(shí)大難度，易于實(shí)現(xiàn)；檢測(cè)效率比現(xiàn)；檢測(cè)效

10、率比較高；可進(jìn)行實(shí)較高；可進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)時(shí)監(jiān)測(cè)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn) 測(cè)定生物大測(cè)定生物大分子如蛋白質(zhì)分子如蛋白質(zhì)和核酸需要進(jìn)和核酸需要進(jìn)行外部標(biāo)記行外部標(biāo)記15局域表面等離子體共振檢測(cè)局域表面等離子體局域表面等離子體是存在于金屬納米粒子或不連續(xù)是存在于金屬納米粒子或不連續(xù)的金屬納米結(jié)構(gòu)中的電荷密度震蕩。的金屬納米結(jié)構(gòu)中的電荷密度震蕩。局域表面等離子共振局域表面等離子共振是當(dāng)金屬納米粒子被入射光激是當(dāng)金屬納米粒子被入射光激發(fā)時(shí)發(fā)時(shí),因內(nèi)部自由電子的協(xié)同振蕩而產(chǎn)生的共振。因內(nèi)部自由電子的協(xié)同振蕩而產(chǎn)生的共振。1616光與金屬納米顆粒的相互作用過(guò)程：激發(fā)光攜帶一定強(qiáng)度的電場(chǎng)自由電子在電場(chǎng)中開(kāi)始振蕩激發(fā)電場(chǎng)和電子的

11、振蕩形成共振自由電子吸收能量被共振激發(fā)自由電子返回基態(tài)并釋放能量能量形式：熱能 + 發(fā)射光子(散射光)局域表面等離子體共振17LSPR傳感器v理論上所有的金屬、合金、半導(dǎo)體材料都可以做理論上所有的金屬、合金、半導(dǎo)體材料都可以做成成LSPR傳感器，常用金、傳感器，常用金、 銀、鉑等貴金屬。銀、鉑等貴金屬。LSPR的吸收光譜峰值處的吸收波長(zhǎng)取決于材料的吸收光譜峰值處的吸收波長(zhǎng)取決于材料的微觀結(jié)構(gòu)特性，如組成、的微觀結(jié)構(gòu)特性，如組成、 形狀、形狀、 大小、大小、 局域局域傳導(dǎo)率。傳導(dǎo)率。18LSPR傳感器19單分子電化學(xué)檢測(cè)單分子電化學(xué)檢測(cè) 無(wú)需標(biāo)記；無(wú)無(wú)需標(biāo)記；無(wú)污染、實(shí)時(shí)、高污染、實(shí)時(shí)、高靈敏度靈敏度優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn) 納米顆粒制納米顆粒制備復(fù)雜；信噪備復(fù)雜；信噪比低；對(duì)檢測(cè)比低；對(duì)檢測(cè)器要