血栓藥效探究思路及方法

1、血栓藥效探究思路及方法(江西省婦幼保健院，江西 南昌330006) g摘要：對血栓的形成原因著手，闡述了血栓的藥效 研究思路與方法。關(guān)鍵詞：血栓；形成；藥效中圖分類號：r364. 1+5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：a文章編號： 1673-2197 (2009) 01-0116-02血栓是指機(jī)體血液中，由于血小板凝集或血液凝固等而 在心血管內(nèi)形成的固體。血栓癥是一類嚴(yán)重危及人類健康及 生命的的心血管疾病。現(xiàn)就其成因及藥效研究闡述如下。1血栓形成的原因19世紀(jì)中期，virchowl首先提出血栓形成的三大因 素：血液高凝、血流滯緩及血管壁損傷，經(jīng)過百年來臨床及 多種檢測手段的驗證，virchow的理論已得到公認(rèn)。1

2、. 1血管高凝凝血是由系列凝血因子相繼酶解激活，最終生成凝血酶 和形成纖維蛋白的復(fù)雜過程，即所謂“凝血瀑布”。生理條 件下，體內(nèi)還存在與凝血系統(tǒng)相對的抗凝血系統(tǒng)，以保證在 少量凝血因子被激活的可能下，不致發(fā)生連鎖凝血正反饋反 應(yīng)。血液中重要的抗凝血因子主要有肝素、抗凝血酶iii (at-iii)、蛋白c系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物(tfpi)等。血液凝固性增加表現(xiàn)為機(jī)體凝血功能亢進(jìn)或抗凝功能降低， 是血栓形成的直接原因之一。1.2血流異常血流是影響血栓形成及其性質(zhì)的重要因素，如在血流緩 慢的靜脈所形成的血栓，稱為紅色血栓；而在血流較快的動 脈形成的血栓，稱為白色血栓。血流異常主要涉及血液黏度 增高

3、和血流方式的異常。1.3血管內(nèi)膜受損生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗血栓形成的功 能。正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞既能生成和釋放使血管松弛的物 質(zhì)，如前列環(huán)素（pgi2）和內(nèi)皮松弛因子（edrf）；又能 生成和釋放抑制血小板粘附和聚集的物質(zhì)，如pgi2、edrf 和6-酮-pge1、13軽十八碳二烯酸；以及多種抗凝血酶的 物質(zhì)，如硫酸乙酰肝素、抗凝血酶（at）、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白 （tm）和tfpio此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞還能合成和分泌組織型 纖溶酶原活化劑（t-pa）和尿激酶型纖溶酶原活化劑（u-pa）, 二者可與纖溶酶的集合在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，使纖溶活性增 高，以清除正常血液循環(huán)中形成的少量纖維蛋白。此

4、外，血 管內(nèi)皮細(xì)胞還可產(chǎn)生纖溶酶原活化劑抑制劑（pai）,使已形 成的血栓不被溶解，有利于血栓形成2。在炎癥和致動脈 粥樣硬化等多種因素的刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞可出現(xiàn)凋亡。 凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞不但失去抗血栓形成的功能，還能通過 磷脂酰絲氨酸（ps）表達(dá)增加失去膜磷脂不對稱性和抗凝膜 成分丟失，進(jìn)而促進(jìn)血栓形成。內(nèi)皮細(xì)胞可因物理、化學(xué)、 生物、免疫等因素受到損傷，造成功能失衡，結(jié)果使內(nèi)皮細(xì) 胞的抗栓功能減弱，引起血栓形成。2研究思路根據(jù)血栓形成的三大因素：血液髙凝、血流滯緩及血管 壁損傷，其藥效研究分為以下三個方面。2. 1降低血液高凝狀態(tài)凝血過程按照啟動方式及參與的凝血因子可分為內(nèi)源 性凝血途徑

5、和外源性凝血途徑。體內(nèi)抗凝系統(tǒng)大致可分為兩 方面：細(xì)胞抗凝機(jī)制和體液抗凝機(jī)制。細(xì)胞抗凝機(jī)制是單核 -巨噬細(xì)胞系統(tǒng)對激活的凝血因子、組織因子、凝血酶原復(fù) 合物及可溶性纖維蛋白的吞噬作用。體液抗凝系統(tǒng)中較重要 的有at-iii.蛋白c抗凝體系等。2.2改變血流速度2. 2. 1抑制血小板活化病理情況下，血小板在病變血管部位蓄積致血管閉塞， 引起缺血性組織損傷和血栓栓塞癥，因此抑制血小板活化是 抗血栓的重要一步。調(diào)節(jié)血小板功能概括起來包括花生四烯 酸系統(tǒng)、環(huán)核昔酸系統(tǒng)和ca2+o2. 2. 2調(diào)節(jié)纖溶纖溶是指纖維蛋白、纖維蛋白原被纖溶酶水解的過程， 其主要作用是將沉積在血管外的纖維蛋白溶解，防止血栓

6、形 成。(1) 纖溶酶原激活劑。在體內(nèi)最基本的纖溶酶原激活 劑是組織型纖溶酶原激活劑和尿激酶型纖溶酶原激活劑。其 主要功能是將纖溶酶原激活成纖溶酶，啟動纖溶系統(tǒng)。(2) 纖溶抑制物。體內(nèi)纖溶抑制劑包括纖溶酶原激活 抑制劑和纖溶酶抑制劑兩類，對纖溶系統(tǒng)起著重要調(diào)節(jié)作 用。所以，提高纖溶酶原激活劑含量和減少纖溶抑制物含量, 對抗血栓有重要意義。2.3避免內(nèi)皮細(xì)胞受損在生理情況下，完整無損的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抗栓功 能。因此避免內(nèi)皮細(xì)胞受損，是研究抗栓藥物的重要內(nèi)容。 內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的與血栓有關(guān)的物質(zhì)主要有pgi2、edrf與 et、vwf、tm、硫酸乙酰肝素與at-iii.纖溶酶原激活劑與纖 溶抑制物

7、。3研究方法3. 1實驗動物的選擇各種血栓模型以大鼠最為常用，其次是兔和小鼠。對于 器官血栓，也可選用大鼠、犬或者兔。3.2動物模型3.2.1光化學(xué)引起的大鼠局部腦血栓模型3手術(shù)方法：麻醉后，仰臥固定大鼠。將大鼠頭部右側(cè)臥位,從左眼和左耳之中點，做突向耳側(cè)長約2. 5cm的弧形 切口，分離穎肌，自額弓前、后端剪斷并剪斷冠狀突。分離周圍軟組織暴露和顫弓相接的穎鱗骨。在顫弓與穎鱗骨交界的前下方用臺式牙科鉆車行顱骨鉆孔，用血管鉗擴(kuò)大骨窗暴 露左側(cè)mca近側(cè)段主干，保持硬膜完整。個別大鼠mca變 異，如無明確主干或在嗅束水平就已分離則放棄不用。完全 暴露大腦下靜脈和嗅束之間mca段后，先用濕生理鹽水棉

8、球 蓋住傷口待用，再做左側(cè)股靜脈插管備用。血栓形成方法：選用激光如he2ne和靜脈注射光敏劑 如血嚇嘛衍生物。經(jīng)投射孔徑將3mm的光導(dǎo)纖維引出并固定 于架上，投照孔徑對準(zhǔn)嗅束和大腦下靜脈間的mca,纖維遠(yuǎn) 端距mca約2mm,投照光能量密度大于640mw/ cm2。激光 照射mca同時，經(jīng)股靜脈插管緩慢注射12. 5mg/kg體重血嚇 咻衍生物，注射時間超過lmin,直接照射15mino在手術(shù)顯 微鏡(opton, west gemiony)下觀察到mca血流中斷并變 為白色，即為血栓形成。3.2.2開顱電凝阻斷模型4手術(shù)方法：麻醉后，固定大鼠，沿眶上緣作弧形切口， 分離眶內(nèi)結(jié)締組織后，可見視

9、神經(jīng)孔，電凝切斷視神經(jīng)，在 視神經(jīng)孔外上方開窗，切開硬腦膜，即可看到大腦中動脈， 電凝并切斷大腦中動脈起始部至大腦下靜脈之間或者嗅束 內(nèi)側(cè)2至大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈，敷少許青霉 素鈉后逐層縫合穎肌和皮膚。術(shù)后用加熱墊維持動物體溫在 3738°c,蘇醒后送回原籠內(nèi)。3.2.3化學(xué)法血栓模型5手術(shù)方法：大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉(5 ml&#8226；kg)o常規(guī)氣管插管，行人工呼吸，然后開胸斷第 3、4肋骨，暴露心臟，打開心包膜，將吸有50%三氯化鐵溶 液的濾紙片貼于大鼠的冠狀動脈前降支根部，2 min后大鼠 腹腔注射氨甲苯酸(100 mg&#8226；kg)

10、, 60 min后取下濾紙 片。3. 2.4光一色素法動脈血栓模型6手術(shù)方法：大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，氣管插管、頸動脈 插管做血壓監(jiān)測。開腹，置腸系膜于生理鹽水恒溫槽中灌流, 在顯微鏡下觀察腸系膜微循環(huán)狀況，經(jīng)顯微一攝像一錄像系 統(tǒng)拍攝在正常狀況下微血管的流態(tài)。5m in后打開熒光顯微 鏡激發(fā)光光路，使特定波長的激發(fā)光照射在選定的目標(biāo)血管 段上，第6min通過靜脈插管注入熒光素鈉fina (2ml/kg), 并以此時刻作為血栓模型建立的起始時間。在顯微鏡下或監(jiān) 視器上觀察血栓生成的全過程并錄像，直至血栓完全栓塞目 標(biāo)血管。3. 2.5靜脈血栓模型7手術(shù)方法：動物麻醉劑864麻醉后，于右側(cè)腹股溝區(qū)

11、沿 股動、靜脈走行切開皮膚8 cm,鈍性分離皮下及肌肉組織， 充分暴露股靜脈，于遠(yuǎn)端上動脈夾后切開股靜脈，向心方向 安置自制螺旋銅絲進(jìn)入股靜脈內(nèi)并縫合，去靜脈夾，手術(shù)視 野檢查無滲血，術(shù)畢。3. 2.6小鼠角叉菜血栓模型8造模：精密稱取角叉菜膠，以生理鹽水配成4%濃度，給 大鼠稱重，于后足跖部皮下注射角叉菜膠，劑量為20 mg/ kg 體重。3.3檢測指標(biāo)的選擇(1) 內(nèi)皮細(xì)胞功能測定：6-酮-pgela、no與et-1、vwf、tm測定。(2) 血小板功能測定：血小板黏附、聚集、釋放功能 的測定、txb2測定。(3) 凝血因子和抗凝物質(zhì)測定：凝血時間測定、凝血 酶原時間、凝血酶時間測定、組織

12、因子測定、at-iii測定、 蛋白c活性測定、組織因子抑制物活性測定。(4) 纖維蛋白溶解活性的檢測：d-二聚體測定、組織 性纖溶酶原激活劑測定、纖溶酶原激活劑測定。(5) 血液流變性測定：黏度測定、紅細(xì)胞比容檢測、 紅細(xì)胞沉降率測定、紅細(xì)胞電泳時間測定、紅細(xì)胞變形性測 定。(6) 血栓相關(guān)指標(biāo)測定：血栓重量、長度與血栓形成 百分率、血栓形成時間、血流量、梗死面積或重量等。參考文獻(xiàn)：1 hansson p0, welinl, tibbin g. deep vein thrombosis and pul2monary embolism in the general population j arch intern med, 1997, 29 (3): 263 2 陳頌血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展j .chinese journal of thrombosis and hemostasis, 2001, 2 (7)： 88-90.3 管興志.光化學(xué)大鼠大腦中動脈血栓形成模型的 改進(jìn)j國外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊,2000, 8(5)： 278-280.4 張玉勛局灶性腦缺血大鼠模型的研究j 上 海實驗動物科學(xué)，1999, 19 (2)： 96-101.5 任開環(huán)重組水蛭素抗大鼠冠狀動脈血栓形成的 作用研究j 醫(yī)藥導(dǎo)報，2005, 24 (5)： 369-372.6