藏藥寨卡有效部位的分離鑒定及其抗腫瘤活性研究

1、藏藥寨卡有效部位的分離鑒定及其抗腫瘤活性研究作者：李艷，江南，羅霞，清源，許曉燕，楊志榮【摘要】目的分離鑒定藏藥寨卡的有效部位并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行初步研究。方法采用甲醇萃取、酸性氧化鋁層析柱層析和譜圖 分析對(duì)寨卡有效部位進(jìn)行分離提取和鑒定，采用s180荷瘤小鼠模型和 ct-26荷瘤小鼠模型，探討寨卡有效部位提取物的抗腫瘤活性。結(jié)果 提取分離得到了寨卡中有抗腫瘤活性的有效部位，并經(jīng)譜圖分析鑒定 該部位為硫代葡萄糖昔類。經(jīng)抑瘤實(shí)驗(yàn)表明，其能明顯抑制s180荷瘤 小鼠和ct-26荷瘤小鼠的腫瘤增殖。結(jié)論硫代葡萄糖昔是寨卡抑制腫 瘤增殖的有效部位，具有一定的抗腫瘤活性?！娟P(guān)鍵詞】寨卡；有效部位；硫代葡

2、萄糖昔abstract:objectiveto extract and identify the active fraction of the seeds of tibet medicine thlaspi arvense linn. and to study its antitumor activities methodsthe active fraction of thlaspi arvense linn was extracted and identified by nethanol-extraction, tarta1203 colum chromatography, tlc and

3、hplc.the anti-tumor effect was observed on the mouse model ofs180 and ct-26.resultsthe active fraction of thcaspi aruenselinn. was glucosinolate, and it could evidently inhibit the tumor propagation of the two kinds of animal modelsconclusionglucosinolate is the active fraction of thlaspi arvense li

4、nn and it has good antitumor effectskey words:thlaspi arvense linn; active fraction; glucosinolate寨卡是一味常用藏藥，為十字花科植物薪莫thlaspi arvense linn.的干燥成熟種子。在傳統(tǒng)藏醫(yī)藥應(yīng)用中，寨卡主要用于治療目赤 腫痛、流淚、肺熱、咳嗽、腎熱、淋病、消化不良、嘔吐等病癥。目 前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)寨卡開展的系統(tǒng)研究甚少，僅通過(guò)初步的植物化學(xué)研 究知其含黑芥子昔(sinigrin)脂肪油、揮發(fā)油、卵磷脂等成分，因 此，開展寨卡有效部位分離提取和藥效研究，對(duì)藏藥寨卡的藥物開發(fā) 具有良好的

5、指導(dǎo)作用和應(yīng)用價(jià)值。十字花科植物已被大量研究證實(shí)具有非常突出的抗腫瘤活性，主 要原因是其富含抗癌活性成分前體 硫代葡萄糖昔 (glucosinolate)類物質(zhì)。硫代葡萄糖昔在一些十字花科植物屮的含 量大約占干重的1%,在一些植物種子中的含量達(dá)到10% 1, 2。當(dāng)十 字花科植物因收割、加工、咀嚼等或植物水解而使其細(xì)胞破碎吋，內(nèi) 源性黑芥子酶釋放出來(lái)，使硫代葡萄糖昔水解為異硫氧酸鹽(isothiocyanates, itcs)硫氧酸鹽(thiocyanates)和丿睛(nitriles) 而發(fā)揮抗腫瘤作用3, 4o本實(shí)驗(yàn)室在前期已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)寨卡粗提物具有明顯的抑制腫瘤 增殖活性的作用，且發(fā)現(xiàn)等

6、劑量的寨卡粗提物與芥子昔純品相比，抑 瘤活性更強(qiáng)；根據(jù)現(xiàn)有資料，本實(shí)驗(yàn)室推測(cè)寨卡抗腫瘤有效部位可能 為硫代葡萄糖莒類物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，本文擬開展對(duì)寨卡有效部位進(jìn) 行提取、分離和鑒定的研究，并對(duì)有效部位抗腫瘤活性進(jìn)行驗(yàn)證。1儀器與材料1.1儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司，senco r201),層 析柱(上海滬西分析儀器廠有限公司，4)25 mmx 300 mm),蠕動(dòng)泵 (watson marlow 504u), iiplc： waters 1525, waters 2487, spd-10av 紫外檢測(cè)器，aichrom色譜柱，色譜工作站(天津)，凝膠成像系統(tǒng) (bio-rad,

7、gel doc xr)。1.2藥材寨卡采摘收集自卩l(xiāng)|川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣，經(jīng)四川 省中藥研究所中藥研究室鑒定為十字花科植物薪莫thlaspi arvense linn.的成熟種籽。1.3細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物s180 (小鼠腹水瘤細(xì)胞)，由四川省中藥研究所提供；ct-26(小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞，atcc編號(hào)：crl-2638),購(gòu)于南京凱基生物科技 發(fā)展有限公司。昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，1822 g,由四川 省屮藥研究所動(dòng)物室提供(川實(shí)動(dòng)質(zhì)第2002-33號(hào))；balb/c純種小 鼠，雄性2025 g,由四川省成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。1.4藥品與試劑芥子 (sinigrin),購(gòu)于si

8、gma公司；酸性氧化鋁，購(gòu)于上 海陸都化學(xué)試劑廠;甲醇、乙醇、pb(ac)2、ba (ac) 2和kn03等提取 試劑及層析分析試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；色譜試劑均為國(guó)產(chǎn)色譜純。2方法與結(jié)果2.1寨卡有效部位的制備32. 1. 1寨卡有效部位的提取將寨卡炒香，打粉，過(guò)40目篩，得到寨卡粉末。在充分?jǐn)嚢?下，將600 ml甲醇中加熱至微沸，緩慢加入200 g寨卡粉末，加料完 畢后繼續(xù)于微沸狀態(tài)下攪拌20-30 mine待整個(gè)體系冷卻，將其置于 冰浴中使懸浮物完全沉降，收集上清液。固體殘?jiān)?00 ml體積分?jǐn)?shù) 為70%的甲醇水溶液進(jìn)行第2次提取，保持微沸狀態(tài)下攪拌2030 min,冷卻后，將其置于冰浴

9、中使懸浮物完全沉降，收集上清液。合并 提取液,加入其體積1/50的pb(ac)2-ba(ac)2溶液(0. 5mol/l)沉 降提取液屮蛋白質(zhì)。抽濾，濾液于40°c旋蒸濃縮至體積不再減少，以 除去人部分甲醇，得棕色硫昔提取液。2. 1.2寨卡有效部位的分離和層析純化將“2. 1. 1”得到的濃縮提取液轉(zhuǎn)入經(jīng)蒸憾水平衡的酸性氧化 鋁柱中進(jìn)行純化，先用蒸憾水淋洗以洗凈提取液中的有色雜質(zhì)，再用1 000 ml 0. 1 mol/l kn03溶液淋洗，收集kn03溶液淋洗的全部洗脫 液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，至近干時(shí)加入約30 ml的無(wú)水乙醇，繼續(xù)濃縮 至干，得到白色固體。將固體樣品溶入150ml

10、甲醇中，達(dá)到平衡后濾 去不溶物以除去其屮的kn03o濾液繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，溶于少量無(wú) 菌水中，于-50°c下冷凍干燥，得到近似白色的固體粉末，即為寨卡有 效部位提取物(active fractions of pennycress, zaf),精密稱重, 計(jì)算得率。zaf得率(%)二zaf重量/寨卡藥材重量x100%2.2寨卡有效部位的譜圖分析2. 2. 1薄層層析法鑒定寨卡有效部位純度采用硅膠g板為層析板，展開條件為止丁醇：乙醇：氨水的 比例為5 ： 1 ： 2o按比例配制展開劑。將4批次寨卡有效部位提取物 (zaf)點(diǎn)樣后進(jìn)行薄層層析。層析完后在紫外光下顯色，并用凝膠成 像系統(tǒng)照

11、像記錄。2.2.2 hplc法檢測(cè)寨卡有效部位含量采用hplc法對(duì)寨卡有效部位提取物(zaf)進(jìn)行檢測(cè)，采用 峰面積歸一化法檢驗(yàn)含量。iiplc的試驗(yàn)條件為：色譜柱為aiciirom, (5 lim,4.6mmx150miii)；流動(dòng)相組成為乙睛:水二20 : 80,柱溫 30°c, 流速1.0 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nmo數(shù)據(jù)采集由waters化學(xué)工作 站完成。 2.3寨卡有效部位提取物(zaf)對(duì)s180荷瘤小鼠瘤重 的影響無(wú)菌傳代后7 d的s180小鼠肉瘤細(xì)胞懸液，生理鹽水稀釋調(diào) 整濃度為2x107個(gè)/ml,接種于昆明種小鼠右前腋窩皮下，0.2 ml/ 只，24 h后

12、隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為模型對(duì)照組、zaf低劑 量組(25 mg/kg), zaf高劑量組(50 mg/kg),按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量腹腔 注射給藥，模型對(duì)照組給予等劑量生理鹽水，1次/d,連續(xù)10 do末 次給藥后24h,小鼠稱重，處死小鼠剝?nèi)×鰤K，精密稱重。采用統(tǒng)計(jì) 學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用土s表示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 用t檢驗(yàn)。2. 4寨卡有效部位提取物(zaf)對(duì)ct-26荷瘤小鼠瘤重的影 響2.4. 1 ct-26荷瘤小鼠的造模4, 5用pbc洗滌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ct-26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞，用胰 蛋白酶消化液消化，用無(wú)血清培養(yǎng)液吹打稀釋，以1 500 r/min的速 度離心5

13、min,收集細(xì)胞并以pbs配制成細(xì)胞懸液，生理鹽水稀釋調(diào) 整細(xì)胞濃度為1x106個(gè)/ml,接種于balb/c純種小鼠右前腋窩皮下, 0.2 ml/只。接種14 d后，小鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下摘取皮下 瘤體，立即置于消毒培養(yǎng)皿內(nèi)，用無(wú)菌生理鹽水洗滌，將瘤體剪成約 0. 1 cmxo. 1 cmxo. 1 cm大小的瘤塊，將瘤塊塞入滅菌后的套管針頭 部腔內(nèi)。選用68周齡，取標(biāo)準(zhǔn)體重的balb/c純種小鼠，右前肢外 側(cè)皮膚用碘酒消毒，將塞有瘤塊的套管針穿刺至皮下潛行一小段后， 用針芯將針腔內(nèi)的瘤塊推至皮下。接種后3 d即可出現(xiàn)皮下腫瘤結(jié)節(jié), 成功率100%o2.4.2對(duì)ct-26荷瘤小鼠瘤重的影

14、響取接種后已成瘤的balb/c純種小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為模型對(duì)照組、zaf低劑量組（25mg/kg）, zaf高劑 量組（50mg/kg）,接種5 d后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量腹腔注射給藥，模型對(duì) 照組給予等劑量生理鹽水，1次/d,連續(xù)21d。末次給藥24 h后，小 鼠稱重，處死小鼠剝?nèi)×鰤K，精密稱重。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處 理。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用土s表示。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組用t檢驗(yàn)。2.5結(jié)果2. 5.1寨卡有效部位分離提取得率經(jīng)4次重復(fù)提取實(shí)驗(yàn)，得 到4批次寨卡有效部位提取物（zaf）。在寨卡有效部位整個(gè)分離提取 過(guò)程得率約為0. 30%0結(jié)果見表1。表1 zaf得率（略）2. 5

15、.2譜圖分析鑒定寨卡有效部位薄層層析法檢測(cè)寨卡有效部位提取物（zaf）純度：將4批次的 zaf按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行點(diǎn)樣，薄層層析，并在紫外光下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見 圖1）。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可看出，4個(gè)不同批次的zaf都有一個(gè)在紫外光 下顯色、位置大致相同口顏色一致的熒光斑點(diǎn)，并且該點(diǎn)較為明亮。 說(shuō)明分離得到的zaf雖是混合物，但其化學(xué)成分比較單一，主要成分 相同，冃含量高，可視作一個(gè)有效部位。hplc法檢測(cè)寨卡有效部位提取物（zaf）含量：以芥了甘為標(biāo)準(zhǔn) 品，采用hplc法對(duì)zaf主耍成分的含量進(jìn)行檢測(cè)（采峰血積歸一化法 檢驗(yàn)純度）。結(jié)果顯示，zaf中的主要有效成分含量為85. 70% （以芥子 昔為對(duì)照品

16、），見圖2。圖3為芥子昔純晶對(duì)照hplc色譜。以上譜圖分析方法均為硫代葡萄糖昔分析方法。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看 出，寨卡有效部位的主耍化學(xué)成分單一，以芥子昔為純品對(duì)照時(shí)，出 峰時(shí)間基本一致，且含量高，由此證明寨卡有效部位主要化學(xué)成分確 為硫代葡萄糖昔類物質(zhì)，符合本文推測(cè)。2.5.3寨卡有效部位提取物（zaf）對(duì)s180荷瘤小鼠瘤重的 影響從表2可看出，zaf低、高劑量都能有效抑制s180腫瘤細(xì)胞的增 殖，小鼠瘤重低于模型對(duì)照組。其中，低劑量組具有顯著性差異 （p<0. 05）,高劑量組具有極顯著性差異（p<0.01）,表現(xiàn)出一 定的量-效關(guān)系；同時(shí)也可看出，同等劑量下，zaf

17、抑制s180腫瘤增 長(zhǎng)的效果較芥子甘純品好。2. 5. 4寨卡有效部位提取物(zaf)對(duì)ct-26荷瘤小鼠瘤重的 影響從表3可看出，zaf低、高劑量都能有效抑制ct-26腫瘤細(xì)胞的 增殖，小鼠瘤重低于模型對(duì)照組。其中，低劑量組具有顯著性差異 (p<o. 05),高劑量組具有極顯著性差異(p<0.01),表現(xiàn)出一 定的量-效關(guān)系。表2zaf對(duì)s180荷瘤小鼠瘤重的影響(略)表3zaf 對(duì)ct-26荷瘤小鼠瘤重的影響(略)3討論硫代葡萄糖昔是廣泛存在于十字花科植物中的抗腫瘤活性成分, 到目前為止已發(fā)現(xiàn)有近120種6o木文通過(guò)回流提取、甲醇萃取以 及酸性氧化鋁層析分離，從

18、寨卡中分離得到的有強(qiáng)抗腫瘤活性作用的 有效部位，經(jīng)譜圖分析鑒定為硫代葡萄糖昔(glucosinolate)的混合 物。整個(gè)提取過(guò)程屮，寨卡有效部位提取物(zaf)得率約為0. 30%, 而通過(guò)本文方法，其中硫代葡萄糖昔含量可以達(dá)到85%以上。硫代葡萄糖昔的生物活性作用是經(jīng)過(guò)水解之后的產(chǎn)物所表現(xiàn)岀 來(lái)的，研究發(fā)現(xiàn)，其降解產(chǎn)物異硫氧酸酯類物質(zhì)具有顯著的抗腫瘤活 性3o本文s180和ct-26腫瘤在體動(dòng)物模型研究實(shí)驗(yàn)表明，寨卡有 效部位提取物(zaf)對(duì)小鼠s180和ct-26實(shí)體瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑 制作用，并隨著給藥濃度的增加，小鼠瘤重明顯減小，表現(xiàn)出一定的 量-效關(guān)系，說(shuō)明硫代葡萄糖昔在小鼠胃腸道酶的作用下發(fā)生了降解, 其降解產(chǎn)物是異硫氧酸酯類物質(zhì)。另外，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中也可看出，zaf 比同劑量的芥子昔純品具有更好的抗腫瘤活性，可能與提取物為多種 硫代葡萄糖昔混合物，存在協(xié)同抗癌作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)鑒定了其抗腫 瘤有效部位，并通過(guò)兩種荷瘤動(dòng)物模型驗(yàn)證，為藏藥寨卡有效部位的 提取分離提供了途徑，為寨卡的抗腫瘤藥效研究提供了直接依據(jù)，將 為開發(fā)研制抗腫瘤單味藏藥打下堅(jiān)實(shí)的工作基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】1 季宇彬，武曉丹，鄒祥硫代葡萄糖昔的研究j 哈 爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005, 21 (5)： 551.2 ba