RNA干擾分化抑制因子-1基因表達(dá)對食管鱗狀細(xì)胞癌增殖與凋亡的影響-臨床醫(yī)學(xué)論文

1、符合吆喝道何人也如野人也人大方哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈吃不吃不瞅不睬vb 曾達(dá)武，方明霞，劉豫瑞【摘要】目的研究針對分化抑制因子-1的siRNA(si-Id-1)對人食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)細(xì)胞增殖和凋亡影響的可能機制。方法陽離子脂質(zhì)體法介導(dǎo)si-Id-1轉(zhuǎn)染ESCCTE-1細(xì)胞株，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并計算轉(zhuǎn)染率，RT-PCR檢測Id-1的mRNA表達(dá)水平;免疫印跡法檢測Id-1的蛋白表達(dá)水平;細(xì)胞增殖實驗檢測轉(zhuǎn)染前后TE-1細(xì)胞增殖能力變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的周期變化和凋亡指數(shù)。結(jié)果si-Id-1轉(zhuǎn)染前后的TE-1細(xì)胞株Id-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平有明顯差異(P&

2、lt;0.05);轉(zhuǎn)染后的TE-1細(xì)胞較其親代細(xì)胞增殖能力降低，凋亡程度增強(P<0.05);轉(zhuǎn)染后的TE-1細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。結(jié)論利用脂質(zhì)體將si-Id-1轉(zhuǎn)染至ESCC的TE-1細(xì)胞是切實可行的;si-Id-1可以有效沉默TE-1細(xì)胞Id-1的表達(dá)，從而抑制ESCC細(xì)胞增殖?！娟P(guān)鍵詞】抑制因子，免疫;癌，鱗狀細(xì)胞;食管腫瘤;RNA，小分子干擾;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞增殖在我國，食管癌具有高發(fā)病率及高病死率，以手術(shù)為主輔以放射治療或化學(xué)治療的綜合治療可提高患者生存率，但仍有90%的患者死于轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)1，因此尋求新的切實有效的

3、食管癌治療方法或策略迫在眉睫。分化抑制因子(inhibitorofDNAbindingordifferentiation,Id-1)可在食管癌、肝癌等腫瘤中表達(dá)，參與腫瘤血管發(fā)生、促進(jìn)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移2-4;而小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)可有效沉默目標(biāo)基因，而不影響正?；?。該研究針對si-Id-1對人食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)TE-1細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響，探討其對ESCC增殖和凋亡影響的可能機制。1材料與方法1.1主要試劑Id-1-siRNA、Lipofectamine2000(廣州銳博生物公司)，人食管鱗狀細(xì)胞癌ESCCTE-1細(xì)胞(上海

4、拜力生物公司，ATCC來源)，TrizolReagent(美國Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(美國Fermentas公司)，兔抗人Id-1多克隆抗體、Western印跡熒光試劑(美國SantaCruz公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁株氏會社產(chǎn)品)，Taq酶(北京天庚生化公司)，AnnexinV/PI凋亡試劑盒(美國Beckman公司)。1.2分組空白對照組：正常培養(yǎng)TE-1細(xì)胞組;轉(zhuǎn)染試劑組：僅加入Lipofectamine2000組;轉(zhuǎn)染對照組：轉(zhuǎn)染非特異性序列NContml-05815的細(xì)胞組;轉(zhuǎn)染實驗組：轉(zhuǎn)染si-Id-1組。1.3.1TE-1細(xì)胞培養(yǎng)和脂質(zhì)體介導(dǎo)的si

5、RNA轉(zhuǎn)染效率ESCCTE-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，于37、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。以105mL-1的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)，細(xì)胞80%融合后，用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。3組siRNA均由廣州銳博生物公司設(shè)計與合成。Si-Id-1-001(19bp)：5'-UGAGCAAGGUGGAGAUUCUdTdT-3'3'-dTdTACUCGUUCCACCUCUAAGA-5'Si-Id-1-002(19bp)：5'-CAUGAACGGCUGUUACUCAdTdT-3'

6、3'-dTdTGUACUUGCCGACAAUGAGU-5'Si-Id-1-003(19bp)：5'-GUUGGAGCUGAACUCGGAAdTdT-3'3'-dTdTCAACCUCGACUUGAGCCUU-5'另外，本實驗還將標(biāo)記FAM的siRNA同時轉(zhuǎn)染至TE-1細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染6，24，48和60h后通過熒光倒置顯微鏡觀察含有熒光的細(xì)胞所占比例以及轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞形態(tài)變化，據(jù)此估計siRNA的轉(zhuǎn)染效率。1.3.2RT-PCR檢測Id-1的mRNA表達(dá)用Trizol一步法提取TE-1細(xì)胞總RNA，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，紫外分光光度計測純度并定量

7、。然后以mRNA為模板，Oligo(dT)18為引物，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)總體積為20L，RT-PCR反應(yīng)條件為42孵育60min，70中止10min。Id-1的PCR反應(yīng)引物由上海生物工程公司設(shè)計和合成，擴增片段大小為416bp。上游引物(Id1-P1)：5'-CAGCACGTCATCGACTACATCA-3'下游引物(Id1-P2)：5'-GAATCCCACCCCCTAAAGTCTC-3'以-肌動蛋白(-actin)的一段擴增序列為內(nèi)對照，擴增片段大小為556bp。上游引物(-actin-P1)：5'-AAAGACCTGTACGCCAACACAG-

8、3'下游引物(-actin-P2)：5'-TTTTAGGATGGCAAGGGACTTC-3'反應(yīng)體系：1×mol/L，Taq酶1.25U，反應(yīng)總體積25L。反應(yīng)條件：94預(yù)變性5min;9430s5730s7245s，共30個循環(huán);72最后延伸7min。最后的PCR擴增產(chǎn)物用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描。目的基因的表達(dá)指數(shù)=目的基因條帶的積分密度值/內(nèi)對照條帶的積分密度值裂解30min，離心，取上清并采用BCA進(jìn)行蛋白定量。各組采用同樣的蛋白量上樣，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1h，加Id-1抗體(11000)4過夜，洗去未結(jié)合的一

9、抗，以Westernblot試劑盒加二抗DAB染色。，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24，48和72h分別停止孵育，并向相應(yīng)的培養(yǎng)板孔內(nèi)加入10g/L的CCK-8溶液10L，繼續(xù)培養(yǎng)24h。酶標(biāo)儀在450nm的波長條件下測定各孔吸光度值。細(xì)胞生長抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值1.3.5流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡siRNA轉(zhuǎn)染TE-1細(xì)胞48h，胰酶消化并收集各組細(xì)胞，離心，棄上清，PBS洗滌，加緩沖液使其濃度為1×106mL-1，取100L細(xì)胞懸液于5mL流式管中，加入AnnexinV/FITC5L和20g/mL的碘化丙啶溶液10L，混勻后于室溫

10、避光孵育15min，在反應(yīng)管中加400LPBS，用WinMDI2.9對結(jié)果進(jìn)行分析處理。1.4統(tǒng)計學(xué)處理每組實驗均重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS15.0軟件分析。單因素方差分析采用q檢驗，以P<0.05表示差別有統(tǒng)計學(xué)意義。福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2009年11月第43卷第6期曾達(dá)武等：RNA干擾分化抑制因子-1基因表達(dá)對食管鱗狀細(xì)胞癌增殖與凋亡的影響2結(jié)果2.1Id-1siRNA轉(zhuǎn)染至TE-1細(xì)胞后Id-1mRNA的表達(dá)轉(zhuǎn)染后2448h含綠色熒光的細(xì)胞數(shù)最多，60h后含綠色熒光的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，提示TE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染時間為2448h(圖1)。通過熒光標(biāo)記FAM的陽性對照轉(zhuǎn)染

11、效率，可預(yù)測本實驗siRNA的轉(zhuǎn)染效率>80%。RT-PCR聚丙烯酰胺電泳及凝膠圖像分析系統(tǒng)灰度掃描結(jié)果均提示，空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑組和轉(zhuǎn)染對照組Id-1mRNA均存在表達(dá)，但各組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義;3組轉(zhuǎn)染實驗組Id-1mRNA的表達(dá)水平明顯降低，灰度掃描值與空白對照組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2，表1)。3條序列在轉(zhuǎn)染后48h均發(fā)揮明顯的Id-1基因的沉默效應(yīng)，尤以si-Id-1-001最為明顯。2.2Id-1siRNA轉(zhuǎn)染至TE-1細(xì)胞后Id-1蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Id-1蛋白表達(dá)明顯低于空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑組和轉(zhuǎn)染對照組。Image-ProPlus圖像分析顯示

12、：si-Id-1組細(xì)胞Id-1完全不表達(dá)，與空白對照組比較差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3，表2)。2.3CCK-8法測定Id-1siRNA干擾Id-1基因?qū)E-1細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染后的24，48和72h轉(zhuǎn)染實驗組細(xì)胞的吸光度值均顯著低于空白對照組、轉(zhuǎn)染對照組和轉(zhuǎn)染試劑組(P<0.05)。表1Id-1RT-PCR平均灰度掃描比值表2Id-1Westernblot平均灰度比值表3不同時間點si-Id-1對TE-1細(xì)胞增殖的抑制2.4流式細(xì)胞技術(shù)檢測TE-1細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡與轉(zhuǎn)染對照組、轉(zhuǎn)染試劑組相比，轉(zhuǎn)染實驗組處于G0/G1期的細(xì)胞和處于S期的細(xì)胞比較差別均有統(tǒng)計學(xué)

13、意義(P<0.05)。Annexin/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，空白對照組、轉(zhuǎn)染對照組和轉(zhuǎn)染試劑組的凋亡率較低，而轉(zhuǎn)染實驗組TE-1細(xì)胞的凋亡率為7.9%(P<0.05，表4)。表4siRNA轉(zhuǎn)染對TE-1細(xì)胞周期和凋亡的影響3討論前期已對Id-1在ESCC組織中的表達(dá)作用做過研究，證實其具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡作用，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的正調(diào)節(jié)蛋白6。而RNAi技術(shù)以其高穩(wěn)定性、高效率性、高特異性及高傳遞性等特點，已成為腫瘤基因治療的研究熱點;靶基因的二級結(jié)構(gòu)是影響siRNA沉默效率的主要因素之一，siRNA的干擾活性與其和靶基因mRNA的可結(jié)合性密切相關(guān)，針對靶基因的不同

14、序列，siRNA的抑制作用差異很大7-8。將根據(jù)RT-PCR結(jié)果優(yōu)選出來的si-Id-1-001進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并檢測各組蛋白的表達(dá)，從轉(zhuǎn)染后Westernblot的結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組無Id-1蛋白表達(dá)，與對照組比較，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這與Li等的研究結(jié)果一致9。上述結(jié)果表明，利用脂質(zhì)體人工合成的si-Id-1是可行和有效的，可能為研究Id-1對食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其作用機制提供一個可靠的工具。采用CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h后si-Id-1組細(xì)胞增殖速度明顯減慢，其增殖能力均受到抑制?？梢?，si-Id-1的瞬時轉(zhuǎn)染能顯著抑制E

15、SCC細(xì)胞的增殖速度，這一結(jié)果與Hui等的研究一致2。經(jīng)流式細(xì)胞監(jiān)測轉(zhuǎn)染后TE-1細(xì)胞的細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染試驗組轉(zhuǎn)染48h后G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例減少，由此可以推斷si-Id-1可抑制人食管癌TE-1細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致G0/G1期阻滯，細(xì)胞不能進(jìn)入S期合成DNA，從而達(dá)到抑制細(xì)胞快速增殖的作用。細(xì)胞增殖大多是由DNA合成的開始階段細(xì)胞周期的G1/S所控制，這是阻斷細(xì)胞增殖最關(guān)鍵的時相，siRNA有可能在G1/S期轉(zhuǎn)換的決定性“檢查點”抑制了TE-1細(xì)胞的進(jìn)一步增殖，與Swarbrick及Zhang等的研究一致10-11。采用AnnexinV/PI雙染凋亡細(xì)胞檢

16、測本實驗中各組細(xì)胞凋亡指數(shù)，評價siRNA瞬時轉(zhuǎn)染對TE-1細(xì)胞凋亡能力的影響。本研究發(fā)現(xiàn)ESCCTE-1細(xì)胞經(jīng)si-Id-1轉(zhuǎn)染48h后凋亡率明顯增加，說明體外RNAi技術(shù)下調(diào)Id-1基因表達(dá)，并對細(xì)胞凋亡起誘導(dǎo)作用。Id-1靶向的siRNA通過抑制TE-1細(xì)胞Id-1mRNA和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制TE-1細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而抑制TE-1細(xì)胞的快速增殖，誘導(dǎo)其凋亡。由此可見，Id-1基因可能參與TE-1細(xì)胞的增殖和凋亡，si-Id-1可能為抑制ESCC增殖提供一種基因治療方法。然而，應(yīng)用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染存在脂質(zhì)體毒性、轉(zhuǎn)染效率低、基因沉默效應(yīng)短暫等不足，還需要構(gòu)建帶篩選標(biāo)記的si

17、RNA表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，以獲得較長時間的基因沉默效應(yīng)和更為理想的干擾效果。通過體外實驗優(yōu)選出來的si-Id-1-001序列還有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實驗，以確定其是否能通過下調(diào)ESCC細(xì)胞Id-1的表達(dá)打斷ESCC惡性變的進(jìn)程，實現(xiàn)降低ESCC惡性度甚至逆轉(zhuǎn)的目標(biāo)，以期為臨床治愈ESCC提供新的方法和思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1MarietteC,PiessenG,TribouletJP.Therapeuticstrategiesinesophagealcarcinoma:roleofsurgeryandothermodalitiesJ.LancetOncol,2007,8(6):544-553.J.

18、IntJCancer,2006,119(3):508-514.-mediatedvascularendothelialgrowthfactorup-regulationinhepatocellularcarcinomaJ.ClinCancerRes,2006,12(13):6910-6919.4劉豫瑞,方明霞,曾達(dá)武.Id-1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義J.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2009,43(1):32-36.5BassBL.RNAintefrerence,theshortanswerJ.Nature,2001,411(6836):428-429.6劉豫瑞,莊則豪,李友炳,等.id-1，ki-67及Bal-2在食管鱗癌中的表達(dá)及意義J.中華消化內(nèi)鏡雜志,2005,10(5):327-330.erference:atoolforqueryingnervoussystemfunctionandanemergingherapyJ.Neuron,2007,53(6):781-788.8WesetrhoutEM,BerkhoutB.Asystemat