木質(zhì)素降解研究（終搞）

1、歩談匹工大琴anhui university of science & technology本科畢業(yè)論文木質(zhì)素降解的研究ligini degradation of research學(xué)院（部）：化學(xué)工程學(xué)院 專業(yè)班級：學(xué)生姓名：指導(dǎo)教師：2012年3月26日木質(zhì)素降解的研究摘要評述了木質(zhì)生物降解的最新研究進(jìn)展，主要包 括木質(zhì)素的生物降解機(jī)制、降解木質(zhì)素的微生物種 類及其產(chǎn)生的和關(guān)酶類、微生物的代謝調(diào)控和分子 生物學(xué)。此外，對木質(zhì)素降解生物的實(shí)際應(yīng)用和應(yīng) 用前景也進(jìn)行了評論。關(guān)鍵詞：木質(zhì)素；生物降解；秸桿；白腐真菌；環(huán)境保護(hù)ligini degradation of researchabs

2、tractthe quality of the wood that the solution of the born down new grind investigate into the exhibition, the lord will including wood grain life quality that machine system, drop down solution of grain of wood solution microscopic things kind of class and its production was born of enzyme in close

3、, microscopic content of the generation x the control and points the son born to learn things. the outside, to wood quality grain drop solution which shall be born of border with and should be before using the scene also into the line evaluation theory.keywords： wood qualitative element; born conten

4、t drop solution; straw pole; white-rot fungus really; the environment the care摘耍2緒論1 -1. 簡介-2l1基木概念21.2單體與結(jié)構(gòu)31.3發(fā)展前景32. 木質(zhì)素的降解簡略421概況-4-2.2木質(zhì)索的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)-4 -3.木質(zhì)索降解微牛物的種類-5 -3.1種重要木質(zhì)索降解酶5i. 木質(zhì)素過氧化物酶(lip)5ii. 乍孟過氧化物酶(mnp)-7 -iii. 漆酶93.2二種木質(zhì)索降解酶協(xié)同作川-10 -4應(yīng)用全景-10 -4.1木質(zhì)索降解酶的全景10 -4.2木質(zhì)索降解酶的特性124.3木質(zhì)素的降解微生物的酶

5、活性調(diào)控機(jī)理-13 -4.4木質(zhì)素的4：物降解的應(yīng)用16結(jié)論-17-參考文獻(xiàn)18謝辭2緒論木質(zhì)素資源十分豐富，是植物光合作用制造的總量僅次于纖維素的有 機(jī)化合物，估計(jì)全球的木質(zhì)素年產(chǎn)量可達(dá)1500億t。然而，木質(zhì)素資源并 沒有得到有效的利用，大量的木質(zhì)素作為造紙工業(yè)的副產(chǎn)物而排放，不僅 是資源的一大浪費(fèi)，而且嚴(yán)重污染環(huán)境。采用物理和化學(xué)處理法，可減少 約50%的木質(zhì)素排放，但治理成木高，易造成二次污染。利用生物技術(shù)降 解木質(zhì)素，可以減少環(huán)境污染，變廢為寶，實(shí)現(xiàn)資源再利用。因此，認(rèn)識 木質(zhì)索的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和了解其生物降解的研究進(jìn)展，對丁木質(zhì)索資源的合理 化利用將具有一定的指導(dǎo)意義。1.簡介1.1基本

6、概念木質(zhì)素（lignin）是由四種醇單體（對香豆醇、松柏醇、5-疑基松柏醇、芥子醇）形成的一種復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分z-,具有使細(xì)胞相連的 作用。在植物組織屮具有增強(qiáng)細(xì)胞壁及黏合纖維的作用。其組成與性質(zhì)比較復(fù)雜，并具 有極強(qiáng)的活性。不能被動物所消化，在土壤中能轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)。如果簡單定義木質(zhì)素的 話，可以認(rèn)為木質(zhì)素是對疑基肉桂醇類的酶脫氫聚合物。它含有一定量的甲氧基，并有 某些特性反應(yīng)。木質(zhì)素是由聚合的芳香醇構(gòu)成的一類物質(zhì)，存在于木質(zhì)組織中，主要作 用是通過形成交織網(wǎng)來硬化細(xì)胞壁。木質(zhì)素主要位于纖維素纖維之間，起抗壓作用。在 木本植物中，木質(zhì)素占25%,是世界上第二位最豐富

7、的有機(jī)物（纖維素是第一位）。12單體與結(jié)構(gòu)cftjc、ho c c 妙創(chuàng)*as殆構(gòu)ho c c c時児葷矗給構(gòu)木質(zhì)素單體的分子結(jié)構(gòu)木質(zhì)素是出四種醉單體（對香豆醉、松柏醇、5-甕基松柏醉、芥子醇）形成的一種 復(fù)朵酚類聚合物。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一，具有使細(xì)胞相連的作用。木質(zhì)素是一種含許 多負(fù)電集團(tuán)的多環(huán)高分子有機(jī)物，對土壤屮的高價金屬離子有較強(qiáng)的親和力。因單體不同，可將木質(zhì)素分為3種類型：由紫丁香基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的紫丁 香基木質(zhì)索（syringyl lignin, s-木質(zhì)素），由愈創(chuàng)木基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的愈 創(chuàng)木基木質(zhì)素（guajacyl lignin, g-木質(zhì)素）和出對

8、-釋基苯基內(nèi)烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成 的對-輕基苯基木質(zhì)素（hydroxy-phenyl lignin, 11-木質(zhì)素）；裸了植物主要為愈創(chuàng)木 基木質(zhì)素（g）,雙子葉植物主要含愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質(zhì)索（g-s），單子葉植物則 為愈創(chuàng)木基-紫丁香基-對-羥基苯基木質(zhì)素（g-s-h） o從植物學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)，木質(zhì)素就是 包圍于管胞、導(dǎo)管及木纖維等纖維束細(xì)胞及厚壁細(xì)胞外的物質(zhì)，并使這些細(xì)胞具有特定 顯色反應(yīng)（加間苯三酚溶液一滴，待片刻，再加鹽酸一滴，即顯紅色）的物質(zhì)；從化學(xué) 觀點(diǎn)來看，木質(zhì)素是由高度取代的苯基丙烷單元隨機(jī)聚合而成的高分子，它與纖維素、半纖維素一起，形成植物骨架的主要成分，在數(shù)量上僅次于纖維索。

9、木質(zhì)索填充于纖維 素構(gòu)架屮增強(qiáng)植物體的機(jī)械強(qiáng)度，利于輸導(dǎo)組織的水分運(yùn)輸和抵抗不良外界環(huán)境的侵 襲。木質(zhì)素在木材等硬組織中含量較多，蔬菜中則很少見含有。一般存在于豆類、麥聯(lián)、 可可、巧克力、草莓及山莓的種子部分之中。其最重要的作用就是吸附膽汁的主要成分 膽汁酸，并將其排除體外。1. 3發(fā)展前景隨著人類對環(huán)境污染和資源危機(jī)等問題的認(rèn)識不斷深入，天然高分子所具有的可再 生、可降解等性質(zhì)口益受到重視。廢弄物的資源化與可再生資源的利用，是當(dāng)代經(jīng)濟(jì)與 社會發(fā)展的重大課題，也是對當(dāng)代科學(xué)技術(shù)提出的新要求。在自然界中，木質(zhì)素的儲量 僅次于纖維素，而且每年都以500億噸的速度再生。制漿造紙工業(yè)每年要從植物中分離

10、 出人約1.4億噸纖維素，同時得到5000萬噸左右的木質(zhì)素副產(chǎn)品，但迄今為止，超過 95 %的木質(zhì)素仍以“黑液”直接排入江河或濃縮后燒掉，很少得到有效利用?；茉吹目谝婵萁?、木質(zhì)素的豐富儲量、木質(zhì)素科學(xué)的飛速發(fā)展決定木質(zhì)素的經(jīng) 濟(jì)效益的可持續(xù)發(fā)展性。木質(zhì)素成本較低，木質(zhì)素及具衍生物具有多種功能性，可作為 分散劑、吸附劑/解吸劑、石油回收助劑、瀝青乳化劑，木質(zhì)素對人類可持續(xù)發(fā)展最為 重大貢獻(xiàn)就在于提供穩(wěn)定、持續(xù)的有機(jī)物質(zhì)來源，其應(yīng)用前景十分廣闊。研究木質(zhì)素性能和結(jié)構(gòu)的關(guān)系，利用木質(zhì)素制造可降解、可再生的聚合物。木質(zhì)素 的物化性能和加工性能、工藝成為日前木質(zhì)素研究的障礙。2.木質(zhì)素的降解簡略2.

11、 1概況綠色植物占地球陸地生物量的95%,其化學(xué)物質(zhì)組成主要是木質(zhì)素、纖維素 和半纖維索，它們占植物干重的比率分別為15%2%利12偸。農(nóng)作物秸桿是這類生 物質(zhì)資源的重要組成部分，全世界年產(chǎn)量為20多億噸，而我國為5億多噸。但 是，要充分、有效地利用這類資源卻相當(dāng)困難，這是由于秸稈產(chǎn)蚩隨季節(jié)變化， 且量大、低值、體積人、不便運(yùn)輸，人多數(shù)動物都不能消化其木質(zhì)纖維素，自然 降解過程乂極蟻慢，導(dǎo)致人部分秸稈以堆積、荒燒等形式直接傾入環(huán)境，造 成極大的環(huán)境污染和浪費(fèi)。存在于秸稈屮的非水溶性木質(zhì)纖維素很難被酸和 酶水解，主要是因纖維索的結(jié)晶度、聚合度以及環(huán)繞著纖維素與半纖維索締合 的木質(zhì)素鞘所致。木質(zhì)素

12、與半纖維素以共價鍵形式結(jié)合，將纖維素分子包埋在 其中，形成一種天然屏障，使酶不易與纖維素分了接觸，而木質(zhì)素的非水溶性、 化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，導(dǎo)致了福t的難降解性。所以，要徹底降解纖維素，必須 首先解決木質(zhì)素的降解問題。22木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)木質(zhì)素是由苯丙烷單元、9/5 up通過瞇鍵和碳碳鍵聯(lián)接的復(fù)雜的無定形高聚物，難以被酸水解，是天然高聚物中最難搞楚的個領(lǐng)域y其原因有兩個方面，一是木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)單元之間除腿鍵聯(lián)扌妾外還有cc鍵；另一方面是不可能把整個木質(zhì)素分子以其宀兀整狀態(tài)分離出來c典型木質(zhì)素是曲松柏醇(conifery alcohol)，芥 了 醇(sinapyl alcohol)和對一香豆醇(p

13、-coumaryl alcohol)這3種 不 同 的醇 作為先 體結(jié)構(gòu) 物 質(zhì)組成基木的結(jié)構(gòu)單元，這些木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元常常以它們的 糖昔形式貯存在細(xì)胞屮，一旦需要合成木質(zhì)素，它們便從這些 糖昔中釋放出來 這些木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元z間主耍是通過瞇 鍵和碳碳鍵的方式聯(lián)接醸鍵包扌舌酚瞇鍵、烷醸鍵和二芳醯 鍵。在酚瞇鍵中愈創(chuàng)木基-甘油-卩-芳基醯鍵（b-0-4）數(shù)量最多，占酚瞇鍵 的1/2左右，其次是愈創(chuàng)木基-甘油-a-芳基醴鍵（b-0-4） o而木質(zhì)素的c-c鍵的連接 類型主要有3-5, b-b, bt, -2和5-5fc圖i木質(zhì)素（：（：鍵的連接類型3.木質(zhì)素降解微生物的種類3. 1三種重要木質(zhì)素降解酶

14、木質(zhì)素是造紙工業(yè)排放黑液cod和色度形成的主要原因，其結(jié)構(gòu)是由甲氧基取代的對-梵基肉桂酸聚合而成的界質(zhì)多晶三維多聚休，分子間多為穩(wěn)定的瞇鍵、c-c鍵, 是1=1前公認(rèn)的微生物難降解芳香化合物之一。自1934年boruff和buswell首次發(fā)現(xiàn)能 降解木質(zhì)素的微生物種群，人們對木質(zhì)素的生物降解進(jìn)行了大量研究，1983年和1984 年發(fā)現(xiàn)了木質(zhì)素過氧化物猶（lip）和鎰過氧化物酶（mnp）,由日木吉田首次在生漆中 發(fā)現(xiàn)的漆酶（laccase）,也始終引起著人們的關(guān)注。這三種酶被公認(rèn)為是木質(zhì)素重要 的降解酶。i 木質(zhì)素過氧化物酶（lip）1.1分布及種類lip是第一個從黃抱原毛平革菌（phaner

15、ochaetechrysosporium）發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素降解酶, 在木質(zhì)素降解中起關(guān)鍵性作用°lip的產(chǎn)生菌在自然界分布相當(dāng)廣泛，許多腐朽木材的 白腐菌、褐腐菌都可以產(chǎn)生lip,主要產(chǎn)生菌見表1表1 lip的主要產(chǎn)生菌屬名菌種名trametest. gibbosa? t. versicolxwphlehiap. hrispom, p. r(wliata < p. o(hmc(vf ulva p.p. adustacoriolusc. consom < c. hrsutusothersbl(rkan(lera aduata. (jirxsonilia sit <p hi

16、! a, (hysospcrium pridnosiffn. coriolopsis occidentalis. phdlinus pini、pohporus ostnp于ormis, ph(men)eh(ipte chry soporium t strejjt mnca viridosporu, pleurotus ostivatus t junpfi uhunia warabalima. fames lign osusi. ii結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)lip代表一系列含fe3+、嚇嚇環(huán)（ix）和血紅素附基的同t：酶，由不同微生物產(chǎn)生的酶的種類和理化性質(zhì)各不相同°lip是一種帶有糖基的胞外血紅蛋

17、白，晶體結(jié)構(gòu)已 有報道，確定血紅素（heme）埋在蛋白質(zhì)內(nèi)，可連接至少一個va。木質(zhì)素大分子不能接 近該酶的活性屮心，其結(jié)合位點(diǎn)是一段有序的糖殘基，位于接近活性屮心通道表面的 裂縫屮。光譜學(xué)研究表明lip有五種氧化狀態(tài)，自然狀態(tài)lip含有髙自旋fc3+,被h202 氧化兩個電子后形成lip 1（氧帶鐵嚇咻環(huán)自由基含+ fe4+ ） , lip i經(jīng)單電子還原 形成lip 11（氧帶鐵嚇啦環(huán)含fe4+），再經(jīng)一次單電子還原，冋到口然狀態(tài),his*?在活 性中心通道表面的裂縫的開口處,trpl70在酶蛋白表面，其電了傳遞可能有兩個不同的 途徑：底物- his82- ala83- asn84- hi

18、s47- heme 或底物-trp170- leu171- heme。lip的特點(diǎn)是能氧化富含電子的酚型或非酚型芳香化合物，在通過電子傳遞體攻 擊木質(zhì)素時，它能從苯酚或非酚類的苯環(huán)上奪取一個電子，將其氧化成自由基，繼而 以鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生許多不同的自由基，導(dǎo)致木質(zhì)素分子中主要鍵斷裂。此過程需要h202 的驅(qū)動，反應(yīng)如下：lip+ h2o2->lipi+h2olip 1+ sh2tsh + upiilip 11+ sh2 t sh + lip2sh+ 2木質(zhì)素t2木質(zhì)素自由基+ 2sh2其中，sh2為專一電子傳遞體。h2o2可出白腐菌胞內(nèi)h2o2產(chǎn)生酶系產(chǎn)生，且其胞內(nèi) 還存在過氧化物水解酶，保

19、證其不會受到毒害。i. iii作用機(jī)制木質(zhì)素分子間主要鍵型是p - 0- 4,b-0-4模式復(fù)合物屮有a, b兩個苯環(huán)，均可被lip氧化。lip催化0- 4模型物的主要反應(yīng)是c 卩斷裂形成va和2-甲氧基苯酚。另一個重要的分支反應(yīng)是c。-氧化產(chǎn)物 的形成，結(jié)果表明：co-氧化產(chǎn)物是酚型c°-氧合芳香化合物時，可由漆 酶催化，酚氧化酶介導(dǎo)的氧化反應(yīng)降解；當(dāng)氧化產(chǎn)物是非酚型 氧合芳香化合物時，曲于其非各種氧化酶的底物，氧化降解非常困難。va 是lip的誘導(dǎo)劑，還可以保護(hù)lip不受h2o2的損害。對va的氧化目前認(rèn) 為主要是出lip催化，過氧化氫離子和h20同時參與芳香環(huán)的開裂。開環(huán) 產(chǎn)物

20、可被進(jìn)一步代謝co?。整個反應(yīng)中生成的甲氧基酚衍生物，由lip和漆 酶共同氧化，形成醞，在纖維二糖/醍還原酶系、芳香環(huán)開裂酶系的協(xié)同 作用下，生成酚，最后形成環(huán)開裂產(chǎn)物，進(jìn)入kerb循環(huán)，或者纖維二糖 酸內(nèi)脂的形式進(jìn)入磷酸戊糖途徑，最終代謝為co?。而非酚型的芳香醛酸， 由于其氧化還原電位太高，需先被芳香醛酸還原晦還原成和應(yīng)的醇，然后 才能被lip氧化成開環(huán)產(chǎn)物或醞。在木質(zhì)素的模式復(fù)合物屮，已被深入研 究的述有p - 1型，lip氧化其它鍵型如b-5、p-0-4模式復(fù)合物，產(chǎn) 物尚未被證實(shí)。i.iv基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)在分子生物學(xué)領(lǐng)域，研究較多的是p . chrysosporium> trei

21、metes versi col or、 bjerkandera adusta等。在p. chrysosporium中已經(jīng)克隆出至少7個相近的lip基因 家族，定名為lipa- lipj,同源性很高。核型分析表明，異源真核菌株約含10個染色 體，而lip基因至少被分布在兩個染色體上°lip序列排列緊密且高度保守，氨基酸相 似性53% 98%,每個lip基因編碼一個由343345個氨基酸組成的成熟蛋白質(zhì)，分子 量約36360 36607dao n端有一個21個氨基酸的信號肽，且有6或7個氨基酸的前體 肽。已測序的lip基因均含有8或9個內(nèi)含子，大小4978bp, 5'端非編碼區(qū)包

22、含一個tata框(-66 -81 bp)和一個caat框(-107-228bp)的調(diào)節(jié)序列。在基因表達(dá) 方面，其轉(zhuǎn)錄明顯受到c, n水平的彫響,lip的同工酶種類和數(shù)日隨培養(yǎng)條件變化而改變，至少有五種:hl、h2、h6、h8、h10。其分子量大小、等電點(diǎn)、光譜特性、穩(wěn)定性均 有差別，n端氨基酸序列也不相同。非限制性n源條件下，h8是主要的同工酶 具cdna 序列被命名為ml- 1,h2的表達(dá)也稍占優(yōu)勢，但h6的表達(dá)較限制性n源條件下大大下 降。在異源表達(dá)上，已得到許多重組lip,但重組lip的功能有所改變，如催化能力改 變，不再受mr?+抑制等。ii猛過氧化物酶(mnp)ii. i分布及種類m

23、np與lip 樣，都是代表一系列帶有糖基的胞外過氧化物酶，因二者都含有血 紅素，又稱血紅素過氧化物酶。mnp的主要產(chǎn)生菌見表2,主要是一些白腐真菌，多屬 擔(dān)子菌亞門，無隔擔(dān)子菌亞綱，無褶菌冃的多孔菌科。ll.ll 結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)mnp的品體結(jié)構(gòu)中包括17%的中性糖類和大量酸性氨基酸，血紅素上僅有一個mn2+的 結(jié)合位點(diǎn)，mnp能將其氧化，消耗一分子的h202,產(chǎn)生兩分子的mn3+。mn3+從mnp上 脫離后，如果沒有合適的螯合物與其結(jié)合，保證其穩(wěn)定性，其可以在溶液屮發(fā)生反應(yīng)， 生成mn02o在木質(zhì)素降解過程屮，mno2可保護(hù)lip免受h202的損傷。而在lip- mnp組 合酶體系屮，高濃度的mn

24、2+或mn3+ ,加上合適的螯合物，會導(dǎo)致lip的抑制,mnp的 誘導(dǎo)?？梢?，mn對lip和mnp都具有重要的作用，且作用大小與猛離子的濃度及添加 時間有關(guān)。mnp的特點(diǎn)是只能氧化酚型木質(zhì)素。氧化苯酚的過程中，mnp和h202的啟 動下，氧化血2+為mn3+,然后,mn3+氧化苯酚生成苯氧殘基。這與lip氧化苯酚的方 式有明顯不同。表2 mnp的主要產(chǎn)生菌屬名菌種名pleurotusphlebiaparuisgm)(lemvitrainedothersp. sapidus, p. erynigij p. pulmonarius p. s(gor£(gup ireiipora p. r

25、arliatap (igrinus. p. condialus(； luculuni, (； vales uk unit. giljxtsa, t. micdor、t. villosa t cuigulalaceriporiopsis subirnuspora, q>ri(4oxs is pohzofm, lenti rmla d(l(ile(ps iscorfragosa.dichomitus stfualmspy(r(porus driri(j)(iri rms. (；rfda fr()ful()s(i, rigitloporuu ligruviits plianf9r(xhade

26、clirys(is)oriurn, sttraim hirsutimi. (y(ithus stereoreus perenniporia inalullajjanisii. ill作用機(jī)制mnp降解木質(zhì)素的作用機(jī)制尚不清晰，h前認(rèn)為是一個循環(huán)催化過程見圖1, ah代表酚型底物。隨著研究的逐漸深入，它在木質(zhì)索降解過程中的作用越來越受到重視。ii. iv基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)從p . chrysosporium的胞外液中分離出至少六種mnp的同工酶，均由多基因編碼。通過全部rna的反轉(zhuǎn)錄pcr,能得到mnp的三個不同基因的mrna:mnpl、mnp2、mnp3。 靜置培養(yǎng)條件下，mnp2是主要的mnp表

27、達(dá)基因，而攪拌培養(yǎng)時，mnpl是主要的表達(dá)基 因,mnp3的表達(dá)較穩(wěn)定。mnp基因有6或7個內(nèi)含子,n端有21或24個氨基酸的信號 肽，但無前體肽。活性位點(diǎn)附近的序列非常保守，mnp的5 非編碼區(qū)包括1個tataa單 元(-81bp)及3個反向的ccaat單元。啟動區(qū)包括大量熱休克元件和序列，這些元件 與哺乳動物金屬硫蛋門基因中的金屬調(diào)節(jié)元件相同4 5 o在基因表達(dá)方面，mnp的產(chǎn)生明顯依賴mn2+濃度、培養(yǎng)基、熱休克、c和n源變 化，且調(diào)節(jié)是在轉(zhuǎn)錄水平上。菌株pchrysosporium ogc1o1 mnpl編碼一個357個氨 基酸的成熟蛋口，內(nèi)含子6個，大小57 72bpoiii漆酶ii

28、li分布及種類1883年漆酶被首次發(fā)現(xiàn)，一百多年來，人們通過大量研究發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛存在于 多種植物和菌類的分泌物中。在真菌中，漆酶人多分布在擔(dān)子菌(basidimycetes )、 多孔菌(polyporus )、柄孑包殼菌(podospora )等中。此外，一些動物腎臟和血清中 也發(fā)現(xiàn)了漆酶，近來，人們發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌也能產(chǎn)生漆酶6,如生脂固氮螺菌 (azospirillum lipof erum)。漆酶的主要高產(chǎn)白腐真菌王佳玲等曾作過統(tǒng)計(jì)。iii. ii結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)漆酶的分子量在64 390kd之間，除podosp oraanserina產(chǎn)生的一種漆酶是四聚 體外，其它漆酶一般是單一多肽，由約50

29、0個氨基酸組成。不同種類的漆酶含銅數(shù)并不 相同。一般含有四個銅離子，根據(jù)光譜和磁性特征可分為三類：i型c+ 個，單電子 受體，順磁性，藍(lán)色，入614nm處有特征吸收蜂；ii型cu2+ -個，單電子受體，順磁性,菲藍(lán)色，無特征，吸收光譜；iii型cu21+兩個，雙電子受體，反磁性，是偶合的離子 對(cu2+ - cu2+ ) , x 330nm處有寬的吸收帶。漆酶的三維結(jié)構(gòu)尚不清晰，但證實(shí)銅 離子位于酶的活性部位，在催化氧化過程中起決定性作用。漆酶是單電子氧化還原酶， 據(jù)統(tǒng)計(jì)它催化氧化的底物達(dá)250多個，最重要的是酚及其衍生物，約占其底物總數(shù)的 一半。此外漆酶還能催化芳胺、竣酸及其衍生物，當(dāng)體激

30、素和其它非酚類底物，如抗壞 血酸等。iii. iii 作用機(jī)制漆酶是一類以6為電子受體的蛋白酶，對其作用機(jī)理，冃前研究較透徹的是其催 化多酚化物如氫釀，此過程須經(jīng)過四次單電子傳遞。首先，底物氫醜向漆酶轉(zhuǎn)移一個屯 子，生成半醍-氧自由基中間體。而后，兩分子半醍生成一分子氫醍和一分子苯釀，氧 自由基中間體還能轉(zhuǎn)變成碳自由基卩間體，它們可以相互結(jié)合或相互偶連，故在菌體 內(nèi)，漆酶與其它氧化木質(zhì)素酶系協(xié)同降解木質(zhì)素。而在體外實(shí)驗(yàn)中，木質(zhì)素單體在 laccase/ 02條件下會發(fā)生聚合反應(yīng)。02存在條件下,還原態(tài)漆酶被氧化，02被還原成 水，此過程是通過四個銅離了協(xié)同傳遞電了和價態(tài)變化來實(shí)現(xiàn)的：cu2+

31、cu2+ cu2°+t2e 底物 tcu+ cu+ cu2°+t 分子內(nèi)燈轉(zhuǎn)移cu?+ cu2+ cu22+2ecu+ cu+ cu2+->2h+o2h2o 快tcu2+ cu2+ ( cu2o) 3+t2h+h20 慢tcu2+ cu2+cu24+iii. iv 基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)漆酶是由一個結(jié)構(gòu)相近的基因家族編碼，許多真菌的漆猶基因已被克隆和測序， hagaricus bisporus、neurospora crassa。從coprinus cinerens 中克隆dl13 個漆 酶基因lccl. lcc2和lcc3。其中l(wèi)ccl含7個內(nèi)含子，大小為54 70bp，成

32、熟蛋白約521個氨基酸，有三個潛在的n-連接糖基化位點(diǎn)，c端有23個氨基酸的延伸序列，富含 arg和lys,其酶蛋白成熟至少需剔除信號肽、前體肽和c端延伸區(qū)。lcc2和lcc3均 有13個內(nèi)含子，表達(dá)出的成熟蛋白氨基酸同源性80% olcc3和lccl的氨基酸同源性58%, lcc2和lccl的氨基酸同源性59%,而lcc3與asperg訂lus nidulan漆酶的氨基酸同源 性只有18%。因此，界源真菌漆酶之間的氨基酸同源性較低，但在銅結(jié)合區(qū)具有較高保 守性。在異源表達(dá)上，曲霉是一個很好選擇，a. oryazetataamylase和pichia past i系 統(tǒng)已成功表達(dá)若干不同來源的

33、漆酶丄ccl在米曲霉屮表達(dá)成功,90%以上的轉(zhuǎn)化體表 現(xiàn)出漆酶活性，廿前，已有許多漆酶基因在酵母菌等真核生物中表達(dá)。3.2三種木質(zhì)素降解酶協(xié)同作用對上述三種酶的研究主要集屮在液體培養(yǎng)方式上，結(jié)果顯示采用靜置培養(yǎng)，深層 培養(yǎng)利于酶的產(chǎn)生。已證明，木質(zhì)素降解酶活性受c源、n源、微量元素、誘導(dǎo)物、培 養(yǎng)溫度和ph值等因素影響。而p. cinnabarinus的漆酶產(chǎn)量卻不受一些小分子芳香化合 物的誘導(dǎo)。確定單一一種酶在木質(zhì)素降解中的功能非常困難，因?yàn)槲暌环N白腐菌所產(chǎn)生 的都不是一種木質(zhì)索降解酶，如laccase和mnp單獨(dú)存在都不能很好的降解木質(zhì)索， 而兩種酶同時存在時，木質(zhì)素卻能得到很好降解，表明

34、兩種酶具有協(xié)同作用。有趣的是 當(dāng)體系中一些條件變化時，體系中的兩種或幾種木質(zhì)素降解酶會發(fā)生相互抑制現(xiàn)彖， 如液體培養(yǎng)條件下，mr?濃度增加會導(dǎo)致lip活力大大降低，而mnp和laccase的活力 卻相應(yīng)增加，這啟示我們這種協(xié)同作用可能存在正負(fù)兩種機(jī)制。不同白腐菌木質(zhì)素降解 酶系的組成人不相同，口j分為四類：lip - mnp,如p . chrysosporium;lip mnp laccase, 女dtrametes gibbosa; mnp laccase, 如lent inulaz間的比例將直接影響木質(zhì)素降解效果。各種酶系具體如何分工協(xié)作降解木質(zhì)素，尚不 清楚，將是今后研究的一個熱點(diǎn)。4應(yīng)

35、用全景4.1木質(zhì)素降解酶的全景在自然界中，能降解木質(zhì)素并產(chǎn)生相應(yīng)酶類的生物只占少 數(shù)。木質(zhì)素的完全降解是真菌、細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落共同作 用的結(jié)果，其屮真菌起著主要作用。降解木質(zhì)素的真菌根據(jù)腐 朽類型分為：門腐菌使木材呈白色腐朽的真菌；褐腐菌使木材呈褐色腐朽的真菌和軟腐菌。前兩者屬擔(dān)子菌 綱，軟腐菌屬半知菌類。白腐菌降解木質(zhì)素的能力尤于其降解 纖維素的能力，這類菌首先使木材中的木質(zhì)素發(fā)生降解而不 產(chǎn)生色素。而后兩者降解木質(zhì)素的能力弱于其降解纖維素的 能力，它們首先開始纖維素的降解并分泌黃褐色的色索使木 材黃褐變，而后才部分緩慢地降解木質(zhì)索。白腐菌能夠分泌胞 外氧化酶降解木質(zhì)素，因此被認(rèn)為是最主

36、要的木質(zhì)素降解微 生物。忖前，研究最多的白腐菌有：黃孑包厚毛平革菌(phanerochete chrysosporium) > 彩絨 草蓋菌(coridus versicolor)、變 色栓菌(thametes versicolor)、射脈菌(phlebia radiata)、鳳尾菇(plcurotus pulmononanus)、朱紅密孔菌(pycnoporus cinnabarinus)等這些菌多屬于擔(dān)子菌亞門，無隔擔(dān)子菌亞綱、無褶菌a的多孔菌科.王佳鈴等曾評述過19811995年間研究報道過的主要高產(chǎn)漆酶白腐真菌(表1)。表1主要的高產(chǎn)漆酶微生物屬名菌種名polyponis(jor

37、ioluspleiirotus"minuspyvmponispolyntutus(riinodemiap. tvrsicolor , p. hirautus p. anceps，p. san取ineus(： irrsicolor)(c. hirsuius k c. consorp 。氏廠血必 p. 眄ocaju > p. eryn誨i p. pulmonariiisl. edodes, l. tirinusp cinnabariniis , p. sanguineus , p. coccineusp. versicolor > p. sanguineusg ludolum

38、 (； mlesiocimothenagaricus bisponis ifotrytis cinem» panus tiinus» irpex lacuis» daemea flat uiu fames annos rhs tonia pnwtieola ngroapora crassti lnzites be tulina , sporotrifhum pulendentinn pholiota nuiiabilis，schimis molle，stenim pujpureum t (joprimis congregaiiis > cerrvna uni

39、color > ceriporiopsis whttrmis- pom bjejkaradera adusta poliporus pinsitus difhomitus sfutilensa, pyricu- laria oryme fyalhiis bulleri褐腐菌的軟腐菌中的有些種類也可以分泌一些降解木質(zhì)素的酶類，但它們分解木質(zhì)素的能力不是很強(qiáng)，因此，研究報道 較少.降解木質(zhì)素的原核生物以放線菌為主，如鏈霉菌屬(streptomyccs) > 節(jié)桿菌(arthrobaeter) > 小單抱菌展(micromonoyticum)和諾卡氏菌(nocardia)等。細(xì)菌中

40、有厭氧梭菌(clostridum xylanoyticum)、假單抱菌(pseudomonas)、不動桿菌(acinetobacter)和 芽砲桿菌(bacillus)等原核生物對于在土壤中木質(zhì)素的轉(zhuǎn)化和 降解具有重要作用，但土壤中木質(zhì)索的降解據(jù)報導(dǎo)是土壤微 生物區(qū)系多種類型微生物協(xié)同進(jìn)行的結(jié)果，而且進(jìn)程緩慢，單一微生物純培養(yǎng)的商業(yè)用途前景不很清晰，月這類原核生物的多酚氧化酶是胞內(nèi)酶，這也決定了其在木質(zhì)素降解菌的研究中處于一個相對從屬的地位.此外，很多植物病原微生物女hrhizoctonia solani r. praticola等也具有分解木質(zhì)素的能力，但這類微生物在處理秸稈上的應(yīng)用 前景不

41、大.在木質(zhì)素降解微生物屮，研究得最多最徹底和最具應(yīng)用 前景的是黃抱原毛平革菌。這種微生物的特點(diǎn)是培養(yǎng)溫度髙 (37°c左右)，無性繁殖迅速，菌絲生長快且分泌木質(zhì)素降解 酶能力強(qiáng)，它已經(jīng)成為研究白腐真菌的一種模式微生物'它 的培養(yǎng)條件、代謝調(diào)控、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)及其在生產(chǎn)實(shí) 踐上的應(yīng)用等均已被研究的相當(dāng)仔細(xì)。4. 2木質(zhì)素降解酶的特性目前，關(guān)于木質(zhì)素降解酶的研究工作主要集中在口腐菌所 產(chǎn)生的酶系。研究得較多，并認(rèn)為最為重耍的木質(zhì)素降解幽有 3種，即木質(zhì)素過氧化物酶(lignin petoxidases/lip)、猛依賴過氧 化 物 酶(manganese pcrxidascs

42、/mnp)和 漆 酶(laccase) . lip, mnp和leicceisc只 是 分別代表一系列的同功晦。但各種微生物所產(chǎn)生的晦的種類 和一些理化特性是有所不同的。其中l(wèi)ip是第一個從黃抱原 毛平革菌發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素降解酶，以后又分別從射脈菌，彩絨革 蓋菌，變色栓菌中發(fā)現(xiàn).laccase沒有在黃砲原毛平革菌中發(fā) 現(xiàn),而在phlebia, trametes, coriolus 等菌中發(fā)現(xiàn)。木質(zhì)素的降解酶系是非常復(fù)雜的一個體系，很多問題至 今還不十分清楚.除了上述3種重要的酶外，其它的一些酶如 芳醇氧化酶(aa0)、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶及一 些還原酶、甲基化酶和蛋口酶等都參與或?qū)δ?/p>

43、質(zhì)素的降解產(chǎn) 生一定的影響.lip和mnp都是帶有糖基的胞外血紅素蛋白乂稱血紅索過 氧化物酶(hcmc peroxidase),它們在反應(yīng)中從苯酚或非酚類的苯 環(huán)上奪取一個電子而使后者形成一個陽離子基團(tuán)，從而導(dǎo)致 木質(zhì)素分子中主耍鍵的斷裂.lip主耍是氧化苯酚使z成為苯 氧殘基mnp主要是從mr?和的氧化中得到然后氧化苯酚 使之成為苯氧殘基'而每種酶在木質(zhì)素降解中的具體作用 還不甚清楚.漆酶(laccase)是含銅的多酚氧化酶，主要來源于生漆和真 菌。出于laccase的含糖量高，難得到x-衍射分析用的漆酶單品， 它的三維空間結(jié)構(gòu)尚不清楚.但已經(jīng)證實(shí)，漆酶中的銅離子 在催化氧化反應(yīng)中起

44、決定作用根據(jù)磁學(xué)和光譜性質(zhì)可將漆酶 中的4個銅離子分為3類：i型c十和ii型c+各1個，是單電子受體, 呈順磁性，可以用核磁共振控測；iii型cu2+ 2個，是雙電子受體， 反磁性，用核磁共振不能檢測 ！ i型cf 呈藍(lán)色，在x614nm特征吸 收峰；11型5決為非藍(lán)色，沒用特征吸收峰；iii型(x”的離w(cu2+-cu2+ ),在30處有寬的吸收峰.在木質(zhì)素降解過程的機(jī)制和作用至今人們還不完全清楚。 作為一種多酚氧化酶，它可催化氧化酚類或芳胺類等多種底 物的氧化作用。氧化酚或芳胺先失去一個電子生成口出基， 后者發(fā)生一系列非酶反應(yīng)，氧化成釀，在有02存在時，還原態(tài)漆 酶被氧化o還原成水

45、9;底物自由基不穩(wěn)定，可進(jìn)一步發(fā)生鍵 的斷裂或生成，導(dǎo)致裂解或聚合反應(yīng)。因此，底物分子可進(jìn)一步 合生成復(fù)朵的產(chǎn)物，也可催化芳香環(huán)支鏈ca 斷裂。galian0等發(fā)現(xiàn),當(dāng)laccase和mnp分別單獨(dú)存在時，都不能有效地 降解木質(zhì)素，而2種酶同時存在時則木質(zhì)素得到有效的降解， 這表明2種酶在催化木質(zhì)素生物降解反應(yīng)中具有協(xié)同作用. 此外還發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)中加入其它的酶，如葡萄糖氧化酶時，可顯 著提高木質(zhì)素的降解程度他們認(rèn)為，這是由于laccase既有解 聚，乂有聚合木質(zhì)素的能力，加入葡萄糖氧化酶可原laccase氧 化多酚產(chǎn)生的釀等阻止木質(zhì)素的聚合作用，從而提高laccase的 降解能力.確定每一種酶在

46、木質(zhì)素降解過程中的作用和功能是困難 的，因?yàn)橹辽倌壳澳举|(zhì)素被微生物所產(chǎn)生的單一胞外酶徹 底、完全地催化解聚和降解的情況還沒被發(fā)現(xiàn)每一種口腐 真菌所產(chǎn)生的都不只是一種能降解木質(zhì)素的酶，在缺陷任一 種酶的體系中木質(zhì)素仍能夠較好的降解，而這些酶z間乂相互作用和影響，使其存在于一個協(xié)同作用體系屮雖然現(xiàn)在已 能用叱標(biāo)識的合成木質(zhì)素來研究木質(zhì)素降解酶在木質(zhì)素降 解中的作用機(jī)理，但由t木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，木質(zhì)素的徹底降 解需依賴微生物區(qū)系中多種微生物在較長時間內(nèi)相互交替 的生長繁殖才能完成.4.3木質(zhì)素的降解微生物的酶活性調(diào)控機(jī)理在白腐菌產(chǎn)酶的培養(yǎng)方式上，研究最多的是液體培養(yǎng)國內(nèi)夕卜曾利用同有機(jī)、無機(jī)或復(fù)合碳

47、源和氮源來研究它們對微生物素降解能力和產(chǎn)酶能力的影響.還研究了碳源或氮源它們的影響結(jié)果表明，碳源和氮源是微生物降解木質(zhì)酶的一個極為重要的影響因素.不同的單糖、雙糖作碳源的礦質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)豹斑革菌時， 用麥芽糖生物的生長量最高.標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，以葡 照，甘露糖和麥芽糖使mnp分別增2倍和3. 8倍。酵母汁、牛醇胺等合氮有利于lip活性的提高，而甘氨酸、檸檬酸鍍、乙 抑制lip的生成和活性.毛平革菌等白腐菌的木質(zhì)素降解和木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生是發(fā)生在氮源或其它營養(yǎng)被消耗的次級代謝過程中而細(xì)菌則與之相反，高濃度的有機(jī)或無機(jī)氮源都不能抑制木質(zhì)素 降解，所產(chǎn)生的過氧化物酶也具有與生長相聯(lián)和不受高水平 氮抑制的

48、特點(diǎn)我國學(xué)者李越中等曾對黃泡原平革菌合成木質(zhì)素過氧化物酶的營養(yǎng)調(diào)控進(jìn)行過較為詳細(xì)的研究報道（表2、表 3) o表2不同碳源対黃他原毛蘋革菌木索酶活力的影響碳源/（2gi：）酶活力/（ul）碳源/(2 g-l-1)酶活力/（ul"）di iiii繭糖265.2甘油126.3非還原性三糖戊醛糖d松三糖75.8d 核糖168.0上述糖等比混合4(1). 0d 木糖227.3毗喃型戊聚糖j阿拉伯糖122.1木聚糖12.6己醛糖咲喃型己聚耦d-葡萄糖324.2葡糖46.3己酮糖毗喃型己聚糖山梨糖101.0糊精429.4脫氧己糖可洛性淀粉42.1d巖藻糖0微晶纖維素172.6i巖藻糖176.8地

49、衣多糖193.7鼠李糖4.2海帶多糖164.2還原二糖其他纖維二糖286.6葡甘聚糖29.5非還原二糖果膠147.4d松二糖0魏皮浸汁（1%）256.8蔗糖54.7表3不同氮源對黃抱原毛平革菌酶活力的影響氮源菌絲重/ mg酶活力/（u-l-1）無機(jī)氮14.2237.1(xil4)2so414.3283.6(xh4)2hpo417.198.0尿素19.20有機(jī)氮乙醇胺20.10丙烯酰彼18.5247.8石酸錢13.7350.6檸檬酸錢16.90甘氮戰(zhàn)2l401尸谷氨戰(zhàn)20.3257.5復(fù)雜氨酵母浸汁18.3389.2牛肉音20.7436.9注:氮源質(zhì)雖濃度為12 mmol*l1.微量元素對于口腐

50、菌相關(guān)酶類的產(chǎn)生是有較人影響的。漆 酶是一種含銅的多酚氧酶，因此，cu對于漆酶的產(chǎn)生和酶活 性是相當(dāng)重要的mn對lip和mnp都具有重要的作用，對漆酶的影響 也是顯著的.btnnarme等認(rèn)為,mr?*對lip有抑制作用，而對mnp則有 誘導(dǎo)作用，其作用的大小與mh的濃度及添加時間有關(guān).c. subuermispora在mr?'濃度為11 x 10 'mol 1/時，木質(zhì)素礦化速率最大， 而mnp和laccase的活性在4. 0x 106 mol i時最高.不添力umn2'nj*使 agaricus campe str is的laccase活性顯著降低，但對其彩響是以c

51、u" 的存在為前提，如果沒有存在,那么laccase的活性則與濃 度無關(guān)且酶活性始終很低有報道，高濃度的會提高phlebiabreispora 的laccase 活性，但對dichomitus 來說，laccas 活性都不受mrf 的影響.結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素有關(guān)的低分子芳香化合物或木質(zhì)素降解的 碎片化合物，可誘導(dǎo)laccase產(chǎn)生并提高具猶產(chǎn)量，這類化合物如 香草酸、藜蘆醇、愈創(chuàng)木酚、吐溫、甲苯胺等.在豹斑革耳菌上 還發(fā)現(xiàn)了專一的mnp誘導(dǎo)物3-甲基節(jié)醇.培養(yǎng)溫度、通氣狀況，p h值乃至環(huán)境濕度等，也是影響木質(zhì) 索降解酶產(chǎn)生的因素如黃他原毛平革菌的最適生長溫度為 3 7 °c ,最適產(chǎn)酶溫度為30°c豹斑革耳菌增加通氣可使木質(zhì)素礦 化率有所提高，而對于phlebia radiata來說，通氧則抑制其活 性.培養(yǎng)溫度和p h值對laccas的影響因具體菌種而異，不同的 菌種有不同的適宜培養(yǎng)溫度和p i【值.4.4木質(zhì)素的生物降解的應(yīng)用木質(zhì)素的生物降解目前成功地用于生產(chǎn)實(shí)踐的實(shí)際應(yīng)用 尚不多見，但在有些方面的研究己經(jīng)顯現(xiàn)出誘人的前景.1）造紙工業(yè) 分解木質(zhì)索的酶類在造紙工業(yè)上的應(yīng)用 有兩個方而，一是用改造舊的造紙工藝，用于生物制漿、生物漂 白和生物脫色-黃抱原毛平革菌和pbrevispora等在國外己經(jīng)