槲皮素對兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNFα水平的影響

1、    槲皮素對兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中il1、tnf水平的影響    劉俊胡軍祖陳蕾孫巖樊顏偉摘要：目的：觀察中藥槲皮素對骨關(guān)節(jié)炎動物模型關(guān)節(jié)液中細胞因子il-1、tnf水平的影響。方法：按照hulth法建立兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，20只實驗動物隨機等分成4組：槲皮素組。塞來昔布組。生理鹽水組。模型組。各治療組分別給予藥物治療4周，然后抽取關(guān)節(jié)液。elisa法檢測關(guān)節(jié)液中il-1、tnf 的含量。結(jié)果：槲皮素組、塞來昔布組關(guān)節(jié)液中.il-1、tnf水平均顯著低于模型組（p<0.01）。結(jié)論：槲皮素、塞來昔布能夠抑制oa模型關(guān)節(jié)滑液中il-1b、tnf

2、的水平。、關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎；槲皮素；塞來昔布中圖分類號：q959.836；r684.3 文獻標志碼：a 文章編號：10082409（2015）04000504骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，oa）是一種隨著年齡增長而發(fā)病率也逐漸增加的進行性關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病機理至今尚未十分明確，故也沒什么特效的治療藥物。近年的研究表明炎性細胞因子il-1、tnf在oa的發(fā)生發(fā)展過程中起到了非常重要的作用，oa動物模型及oa的關(guān)節(jié)中均檢測出較高水平破的il-1與tnf，il-1和tnf是主要炎性細胞因子參與骨關(guān)節(jié)炎（oa）。這些細胞因子干擾軟骨細胞代謝，抑制細胞外基質(zhì)蛋白的合成，促進分解代謝的蛋白酶的釋放，

3、壞了軟骨細胞，從而形成骨關(guān)節(jié)炎，被認為是在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用的促炎癥性細胞因子。il-1是重要的炎癥介質(zhì)，參與關(guān)節(jié)軟骨破壞的起始和進展。在正常人關(guān)節(jié)液中il-1含量極少，il-1b占主要成分。然而在oa患者關(guān)節(jié)液中il-1b含量明顯升高，且與oa的病理表現(xiàn)呈正相關(guān)。tnf可刺激滑膜細胞產(chǎn)生pge2，增加軟骨下骨的吸收，引起關(guān)節(jié)軟骨型膠原的破壞，并且與oa的疼痛有著密切的關(guān)系，此外oa發(fā)生時滑膜細胞和軟骨組織大量分泌tnf，促使滑膜組織的增生，并誘導成纖維細胞增生，形成大量的血管翳，致關(guān)節(jié)軟骨破壞，最終可以導致關(guān)節(jié)功能障礙。中醫(yī)藥治療是我國防治骨關(guān)節(jié)炎的一大特色，中藥不僅可以調(diào)節(jié)機體免疫

4、功能、減少復發(fā)及改善特應性體質(zhì)，許多中藥還可減少蛋白酶和細胞因子的形成，對于骨關(guān)節(jié)炎疼痛的緩解，關(guān)節(jié)功能的改善有明顯的療效，且不良反應小，槲皮素又稱櫟精、槲皮黃素等，是一種植物源性五羥基黃酮類化合物，具有較高的營養(yǎng)與藥用價值。槲皮素多以苷的形式存在于一些水果、蔬菜和草本植物中。槲皮苷等在經(jīng)過酶或酸作用后，水解成槲皮素。日前已在上百種中草藥中發(fā)現(xiàn)槲皮素的存在，且已有研究證實槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，榭皮素對硝化應激誘導損傷的細胞具有保護作用，其機制可能與榭皮素可提高細胞內(nèi)erk通路有關(guān)。實驗探討槲皮素對兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中il-1、tnfot水平的影響作用機制，為

5、臨床應用提供實驗依據(jù)。1材料與方法1.1實驗動物健康成年雄性新西蘭白兔22只，體重2.02.5 kg，由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供。1.2實驗藥品與試劑槲皮素：由北京友誼醫(yī)院中藥房煎制；塞來昔布：200 mg/粒，由美西爾大藥廠生產(chǎn)；家兔細胞因子il-1b、tnfot elisa檢測試劑盒，由解放軍301醫(yī)院放免所提供。1.3實驗儀器-20低溫冰箱；恒溫箱；離心機；sn-695b型放免測量儀；普通病理設(shè)備。1.4動物模型與實驗分組22只新西蘭兔2只留做檢測模型是否成功用，其余22只隨機分為4組；每組5只。于動物手術(shù)室切斷前交叉韌帶，參照文獻方法建立hulth模型：將動物從耳緣靜脈麻醉后仰臥于手

6、術(shù)臺上，無菌條件下取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長約2 cm，顯露膝關(guān)節(jié)，然后切斷前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，保留關(guān)節(jié)軟骨面，手術(shù)后不固定傷肢，給予自由活動，給予青霉素20×104/d肌肉注射3 d，預防感染，手術(shù)后7 d驅(qū)趕動物在小動物跑臺上奔跑，30min/d，分2次驅(qū)趕，驅(qū)趕動物4周后即得明顯的模型。4周后處死檢測兔，解剖膝關(guān)節(jié)并行大體觀察及取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨標本送普通病理檢查，結(jié)果證實兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型制作成功（圖1、2）。1.5實驗方法1.5.1模型成功后即給予藥物治療槲皮素組：榭皮素每日藥汁灌胃10.31 mg·kg-1d-1。塞來昔布組：塞來昔布每日灌胃

7、1次，20 mg/次。鹽水組：每日灌胃生理鹽水10.31 mg·kg-1·d-1。空白組：無藥物治療。全部動物治療飼養(yǎng)4周，然后抽取關(guān)節(jié)液。1.5.2抽取關(guān)節(jié)液：施行膝關(guān)節(jié)穿刺抽取關(guān)節(jié)液，用2.5 ml一次性無菌注射器加入生理鹽水1 ml對膝關(guān)節(jié)反復抽吸使沖洗液混勻，最后抽干膝關(guān)節(jié)腔液體。將抽吸的關(guān)節(jié)液以3 000 r/min離心20min，收集上清液，最后獲得關(guān)節(jié)液0.5 my膝，將其注入試管內(nèi)-20低溫冰箱保存。1.6檢測方法雙抗體elisa法il-1、tnf測定：采用elisa雙抗體夾心法（按試劑盒說明書進行操作），取上述獲得的關(guān)節(jié)液200l，確定所需的已包被兔il-

8、1/tnf抗體的酶標板孔數(shù)目，依次加入倍比稀釋的兔il-1b/tnf標準品和標本液，反應90min，自動洗板機洗滌2次，加入物素化兔il-1/tnf抗體工作液，反應60min，洗滌3次，加入abc工作液，反應30 min，洗滌5次，加人3，4，5-三甲氧基苯甲醛顯色工作液，避光反應，顯色后加入3，4，5-三甲氧基苯甲醛終止液。酶標儀在450 nm測定吸光度值，根據(jù)吸光度值計算樣品il-1/tnf的濃度。1.7統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)處理應用spss 10.0軟件。治療組與對照組的比較應用獨立樣本t檢驗，p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，多組間兩兩比較應用q檢驗。2結(jié)果各組il-i、tnf測定結(jié)果見

9、表1。槲皮素組、塞來昔布組關(guān)節(jié)液中il-1、tnf水平均較空白對照組低，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01）；生理鹽水組關(guān)節(jié)液中的il-1p、tnfa水平均與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）；槲皮素組模型關(guān)節(jié)液中il-1、tnf水平均顯著高于塞來昔布組（p<0.05）。3討論筆者利用動物實驗的方法觀察了2種治療oa的藥物對oa模型關(guān)節(jié)液中細胞因子il-1、tnf的影響。il-1與tnf是非常重要的炎性細胞因子，多項研究表明oa關(guān)節(jié)中il-1 與tnf水平明顯升高，il-1與tnf 是oa病理過程中重要的一環(huán)。santangelo等研究發(fā)現(xiàn)oa時軟骨細胞和滑膜細胞分泌i

10、l-1明顯增加，并且對il-1的敏感性也顯著增加，同時增加的il-1可使軟骨細胞和滑膜細胞上調(diào)mmps的表達，加劇炎癥反應，導致軟骨基質(zhì)降解，并加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞。il-1可使滑膜細胞合成和分泌膠原酶和pge2，刺激滑膜組織產(chǎn)生炎癥反應，加速軟骨基質(zhì)的降解，最后導致關(guān)節(jié)軟骨的破壞。在oa患者滑液、滑膜組織、軟骨中il-1和tnf呈高表達狀態(tài)。il-1和tnf同時可促進大量的炎性和分解性因子分泌并產(chǎn)生放大級聯(lián)反應，促進關(guān)節(jié)軟骨的破壞，加速oa病情的發(fā)展。實驗復制的大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型，hulth法建立兔oa模型具有創(chuàng)傷小，模型可重復性好，病理改變接近人類oa軟骨的病理改變的特點，造模4周時軟骨退變

11、以粗糙糜爛等oa早中期改變?yōu)橹?。目前為學者廣泛從大體以及光鏡下觀察到關(guān)節(jié)充血、水腫、肥厚，關(guān)節(jié)液量增多，滑膜細胞增生活躍，且有明顯的炎細胞浸潤，軟骨表面有不同程度的糜爛、缺損，軟骨細胞排列紊亂，細胞減少。這些表現(xiàn)與骨關(guān)節(jié)炎的病理形態(tài)學變化相一致，說明模型復制成功。實驗中槲皮素組、塞來昔布組關(guān)節(jié)液中il-1b、tnf水平均較空白對照組低于模型對照組，表明槲皮素、塞來昔布能夠阻止關(guān)節(jié)液中il-1、tnf的產(chǎn)生，對il-1、tnf的產(chǎn)生起到一定的抑制作用。塞來昔布是cox-2特異性抑制劑，屬于nsaid類藥物，nsaid藥物因能快速緩解骨關(guān)節(jié)炎癥狀而被大范圍使用，塞來昔布因具有較小的胃腸道不良反應被認為是治療oa的理想藥物，但是塞來昔布因為其胃腸道和心血管危險性，使其不能作為骨性關(guān)節(jié)炎的長期維持治療，所以臨床醫(yī)生一直尋找一種療效顯著，不良反應小、經(jīng)濟的治療藥物，中醫(yī)藥正是具有以上優(yōu)點。實驗結(jié)果表明oa動物模型經(jīng)槲皮素與nsaid類藥物一樣也具有抑制患者關(guān)節(jié)炎癥的潛在作用。黃熹等認為槲皮素在這個體系中，具有顯著的抗氧化作用，能提高細胞的抗氧化能力，降低細胞的凋亡。槲皮素能明顯減少gs-no損傷后的內(nèi)皮細胞ldh的釋放，減少mda的產(chǎn)生，提高sod，gsh-px的活性，抑制ros的產(chǎn)生，抑制caspase-3的激活，從而具有保護gs-no誘導損傷的內(nèi)皮細