急性淋巴細胞性白血病微小殘留病的臨床分析

1、急性淋巴細胞性白血病微小殘留病的臨床研究iii摘要 【目的】用兩種方法監(jiān)測急性淋巴細胞性白血病 (all)患者的微小殘留病(mrd),為臨床mrd的檢測提供科 學(xué)依據(jù)，并在此基礎(chǔ)上，探討mrd的臨床意義/【方法】33 例初發(fā)白血病患者均接受4-6周誘導(dǎo)化療，獲得完全緩解后， 進行鞏固化療。在誘導(dǎo)化療結(jié)束時，鞏固化療第12周，24周, 36周，應(yīng)用流式細胞儀(fcm)以all患者白血病細胞的特異 分化抗原為標(biāo)志監(jiān)測mrd,同時應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(pcr)技 術(shù)以免疫球蛋白重鏈(igh)及t細胞受體(tcr)基因重排為 標(biāo)志監(jiān)測all患者的mrdo【結(jié)果】初診時fcm檢測33例患,fcm檢測mrd檢

2、出率分別為42%、31%、16. 7%.者骨髓均有淋巴系分化抗原表達,pcr檢測29例至少存在igh、 tcr 一種基因重排。在誘導(dǎo)化療結(jié)束時，鞏固化療第12周， 24 周，3612. 5%, pcr 檢測 mrd 檢出率為 41. 1%. 31.2%, 15.4%、12.5%。兩種方法在各個時段mrd檢出率無差別。在按年齡(以18歲為界)、性別、初發(fā)病時白細胞計數(shù)(50x1q9/l為界)、ph染色體、my表達、cnsl等因素分別分組中,各個時間段mrd的檢出率均無差別。mrd陽性弓戶細胞計數(shù)大于50x109 (p<010)為復(fù)發(fā)的高危因素莎務(wù)論】1、igh與tcry基因重排可作為基因標(biāo)

3、志用pcr方法檢測all患者的mrdo 2、淋巴細胞分化抗原可作為免疫學(xué)標(biāo)志用fcm方法檢測mrd。3、pcr、fcm兩種方法共同檢測mrd可以互相取長補短，增加可檢測人數(shù)，減少假陰性，提高檢出陽性率。4、mrd與臨床復(fù) 發(fā)高度相關(guān)。5、mrd可能為all患者一個獨立的預(yù)后不良的 因素。關(guān)鍵詞急性淋巴細胞性白血病 微小殘留病 流式細胞儀白細胞分化抗原多聚酶鏈反應(yīng)免疫球蛋白重鏈t細胞受體clinical study of minimal residual diseasein acute lymphblastic leukemiaabstract objective: using two kind

4、s of methods to detect minimal residual .disease(mrd)in acute lymphoblastic leukemia .approach the clinical significance of mrd. method:33 patients with newly diagnosed all received 4-6 weeks of remmision-induction chemotherapy once complete remission was attained the patients received consolidation

5、 therapy .bone-marrow aspirates were collected after induction theray and during weeks 12, 24 ,36 of continuation therapy .cells with leukemia associated immunophenotypes were invested by flow cytometery?as immunologic taget of mrd.at the same time , immunoglobin heavy chain (igh) and t cell recepto

6、r (tcr) gene rearrangement were detected by polymerase chain reaction(pcr) technique as moleculal taget of mrd. result:at beginning of disease all of 33 patientsbone marrow express lympho -linge immunophenotype ,at least one of igh and tcr gene rearrangement were detected in 29/33.after induction th

7、eray and during weeks 12, 24 ,36 of continuation therapy,by fcm 9the detectable rates of patients with mrd are 42%、31%、16.7%、 12.5%,respectively.by pcr they are41.1 %> 31.2%, 15.4%、 17 5%c at anv timft the rhffipreng nf thehv thptwo methods is not significant. in different group (based on age, se

8、x ,wbc count,my expression ,ph chromosome cnsl) the difference of the detectable rates is not significance. mrd positive and wbc count more than 50xl09 are risk factor of all relapse.(p<0.10) .conclusion: 1 igh and tcr can be used as gene taget for the detection of mrd in all . 2 all lassotiated

9、immunophynotype can be used as taget for the detection of mrd in all.3 the two methods can help each other ,using together can improve the dectectable rates of mrd.4 mrd may be an independent predictor risk of relapse.key words:acute lymphoblastic leukemia minimalresidual disease flow cytometery pol

10、ymerase chain reaction immuno globin heavy chain t cell receptor.si急性淋巴細胞性白血病(acute lymphocytic leukeamia all)是表達早期淋巴細胞分化抗原的惡性克隆增生性疾病， 其發(fā)病率居兒童惡性腫瘤之首。近20年來，隨著化療及造血干 細胞移植技術(shù)的不斷提高，all在治療上有了很大的進展。目 前，90%以上的兒童及75%以上的成人all患者通過化療可以 獲得完全緩解(complete rimmision cr),甚至痊愈。然 而，仍然有30%的兒童all及50%以上的成人all患者，最終 復(fù)發(fā)，死于白血

11、病。復(fù)發(fā)的主要根源，是體內(nèi)的微小殘留病(minimal residual disease mrd)。mrd指白血病患者經(jīng)過 現(xiàn)代治療，按目前已制定的療效標(biāo)準(zhǔn)獲得cr后體內(nèi)殘存微量 白血病細胞的狀態(tài)。這些細胞從形態(tài)學(xué)上無法辨認，只能通過 免疫學(xué)，分子生物學(xué)及細胞遺傳學(xué)等方法，采用靈敏度高，特 異性強的技術(shù)進行檢測，mrd的檢測和定期監(jiān)測，對于臨床 指導(dǎo)治療，判斷預(yù)后具有重要意義。本研究應(yīng)用流式細胞儀(flow cytometry fcm)以all患者白血病細胞的特異抗原為標(biāo)志，同時應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reactionpcr)技術(shù)以免疫球蛋白重鏈(immunoglo

12、bin heavy chain igh)ii和t細胞受體y (t cell receptor tcr)基因重排為標(biāo)志監(jiān)測all患者的mrd。研究兩種方法的相關(guān)性，為臨床mrd的檢測提供科學(xué)的依據(jù)，并在此基礎(chǔ)上，探討mrd對all的臨床意 義。材料和方法1.病例2000年9月至2001年10月山西醫(yī)科大學(xué)第二 附屬醫(yī)院住院及門診就診的33例經(jīng)fab分型和免疫分型確診 的初發(fā)aml患者，年齡5-68歲，中位年齡32歲。其中b細胞all 20例，t細胞all11例，tb兩系雙表達all2例。10名正常人作對照。2臨床治療方案：誘導(dǎo)化療采用vcap （長春新堿，阿霉素,環(huán)磷酰胺，強的松）或vcdp方案

13、（長春新堿，柔紅霉素，環(huán) 磷酰胺，強的松）。鞏固化療釆用vcap, vcdp, c0ap （環(huán)磷酰胺，長春新堿，阿糖胞昔，強的松）及hdmtx （大劑量氨甲碟 吟）等方案。緩解期定期常規(guī)三聯(lián)鞘注，及頭顱照射，預(yù)防中 樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。3研究方法:33例all患者初診時進行igh及tcr基因重排及全套免疫分型檢測，之后經(jīng)誘導(dǎo)化療4-6周，獲得cr, 在誘導(dǎo)化療結(jié)束后鞏固化療前，鞏固化療12周，24周，36周 四個時間段檢測mrdo31流式細胞技術(shù)檢測all患者的免疫表型及mrd 311單克隆抗體（美國pharmingen公司提供）:抗 cd45t系單抗：抗cd2、抗cd5、抗cd7、抗cycd3

14、13 系單抗：抗 cd20、抗 cd10、抗 cd19、抗 cy79a髓系單抗：抗 cd13、抗 cd33> cd14、cd15、抗 cympo 干祖細胞系單抗：抗hladr.抗cd34等。3. 1. 2流式細胞儀：采用美國coulter公司elite esp型 313標(biāo)記及檢測：釆用直接熒光標(biāo)記法。每種單抗20ul, 各加入100 口 1 edta抗凝的骨髓，室溫避光20分鐘，q-prep破紅，pbs洗滌兩次，1200rp離心5分鐘，再加500 u 1 pbs上機檢測,檢測10000個細胞。采用cd45-ssc設(shè)門,elite 5軟件分析數(shù)據(jù)。（同時設(shè)立igg及正常人陰性對照）。3.2

15、 igh及tcry基因重排的檢測 32. 1 dna的提?。喝dta抗凝的骨髓300 u 1用centra公司的dna抽提試劑盒提取dna,紫外分光光度計測定dna量。-70°c保存。3- 2.2 引物：針對igh基因及tcry基因，參考文獻，設(shè) 計兩對引物。（a, b和c, d）由北京賽百勝公司合成。其序 列如下：a； 5 ctgaattccgtgtattactg-3e： 5,aaggatccaggagacggtgacc-3，c： 5 -tcttccaacttggaagggaga-3d： 5 -ccctctattaccttggaaatg-3j山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2002323

16、 pcr擴增(所有試劑由promega公司提供)：反應(yīng)體系 sou 1,其中，模板 dna2p1, 2mm dntp 4u l,10xpcr buffer 5 u lj5mm mgcl23 u 1, 10 um 引物各 3 u 1, taqen(5u/u 1)0.5 u 1,無菌離 子水33 u loigh反應(yīng)條件:94°c預(yù)變性2min,93°c變性30s,57°c退火30s,72°c延伸40s, 40個循環(huán),72°c延伸1 ominotcry反應(yīng)條件：94c預(yù)變性2min , 93c變性30s,55c退火3os,72°c延伸min

17、, 30 個循環(huán),72°c延伸 1 omin。324電泳凝膠成像：反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物10p1, 2%瓊 脂糖凝膠電泳，100v半小時,uvp凝膠分析系統(tǒng)攝像分析結(jié)果。 操作中設(shè)置陽性和雙陰性對照(正常人dna陰性和只缺模板的 體系陰性對照)。3.2.5 pcr產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶消化。tcr y基因重排擴增陽性者取其產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇沉淀純化后， 分別用 alui , kpn i ?hpaii(37°c),taq i (65°c)四種限制性 內(nèi)切酶進行消化，分析酶譜特征。酶用量5u/ u g產(chǎn)物，消化 6小時。終止反應(yīng)后再進行照相。4統(tǒng)計方法應(yīng)用spss軟件包處理數(shù)據(jù)

18、。兩種方法的相關(guān)性分析采用 2x2列聯(lián)表x 2檢驗，組間率的比較用四格表x彳檢驗及確切概 率法'生存分析中，單因素分析采用log-tank分析，多因素 令析夾田r nv冋i口并桁-山西醫(yī)科大學(xué)1流式細胞儀對正常人、初診all及all cr期mrd的檢 測情況。cd45-ssc設(shè)門將被檢測細胞群分為四個門，b門（原始細 胞門）、lo （成熟淋巴細胞門）、m門（單核、巨核細胞門）、 g門（成熟粒細胞門），elite軟件對b門細胞進行分析1. 110名正常人fcm檢測情況：b門中各系抗原表達陽性細胞占該門細胞總數(shù)的百分比均 低于 10% （0.2-9. 8%）。正常人fcm cd45/ssc

19、檢測圖彖1-2 all的fcm診斷標(biāo)準(zhǔn)：b門中，干祖系抗原與t或b系 兩種或兩種以上抗原表達陽性的細胞占該門細胞總數(shù)的百分 比大于或等于20%,伴或不伴髓系抗原表達細胞的增多。gt as9c初發(fā)all患者骨箭fcm cd45/ssc檢測圖象1. 333例all患者初診時fcm檢測的情況（表1）表1 33例a1x患者初診時fcm檢測的情況b-allt-ai 丄tb雙表達allmy-1481my卜631合計201121.4 mrd的fcm診斷標(biāo)準(zhǔn)：cr期，3門中表達初診時兩個 或兩個以上異常表達抗原的細胞占該門細胞總數(shù)的百分比，大 于或等于10%為陽性。all患者緩解期mrd cd45/ssc圖象

20、檢測1.4 fcm對mrd的檢測：在誘導(dǎo)化療結(jié)束后鞏固化療前，鞏固化療12周，24周， 36周四個時間段檢測mrd。各個時間段mrd檢出的陽性率分 別為 42%, 31%, 15. 6%, 12. 5%o表2fcm對mrd的檢測結(jié)果檢測時間檢測人數(shù)mrd陽性人數(shù)在誘導(dǎo)化療結(jié)束后3314 (42%)鞏固化療12周3210 (31%)24周294 (16. 7%)36周243 (12.5%)2 igh及tcry基因重排。2. 1 dna的提?。核袠?biāo)本提得足夠dna,可供數(shù)次pcr擴增所需之模板。6例標(biāo)本所提取的dna電泳圖2. 2 all患者及正常人igh, tcr y基因重排的情況2. 2.

21、1 igh igll基因重排，陽性病例電泳后在hobp, 出現(xiàn)光亮擴增帶，正常人dna無擴增條帶出現(xiàn)。33例初診ml 患者中18例出現(xiàn)陽性增產(chǎn)物，b all igh基因重排率明顯高 于 tall (p<0. 05)其中,b-all 陽性率 80% (16/20), t-all 陽性率18.2 (2/11), tb雙表達all2例均為陽性。100hp200iipigh電泳圖1陰性對照2陽性對m. 3. dna分子量標(biāo)記表333例患者igh基因重排情況如下b-allt-alltb雙表all合計igh陽性162220igh陰性49013合計201123p<0. 052. 2. 2 tcr

22、y tcry基因重排由于其多態(tài)性不明顯，正常 人多克隆造血有時也出現(xiàn)陽性條帶，均為400bp左右，為防止 假陰性需進行限制性酶切分析，止常人多克隆造血不能被酶 切，而all患者根據(jù)不同酶切結(jié)果，分為6種重排，v2, v4,v3> v5, vr, v8o 能被 taqi 消化為 192、218bp 者是 v8, hpall 消 化為90、310bp者為v4,如還能被alu消化為229、171bp者 為仏。本實驗33例初診all患者tcr y基因重排陽性者17例(v2 5 例,v4 6 例，v8 4 例，v7 2 例)，t all tcr y 基因重排 率明顯高于ball (p<0.0

23、5)其中,ball陽性率40% (8/20), t all 81.2% (9/11), tb雙表達all 2例均為陽性。tcr電泳1234567894ooi!p1陰性對照2 ball患者3、正常人4陽性對照5 marker 6 all cr期mrd陰性7allcr期mrd陽性8 tall患者9 tall患者pcr產(chǎn)物酶切電泳圖2 3451 taq i消化產(chǎn)物，2 dna分子量標(biāo)記3 kpn i消化產(chǎn)物，4 hpnii消化產(chǎn)物,5 alu i消化產(chǎn)物，表533例初診all患者tcr y基因重扌菲的情況balltalltb雙表達all合計tcr y陽性8例9例2例19例tcr y陰性12例2例0例

24、14例合計20例11例2例33例p<0 052. 23 用igh及tcry基因重排為基因標(biāo)志，對于初診 陽性的患者，在誘導(dǎo)化療結(jié)束時，鞏固化療第12周，24周，36周檢測mrd,檢出率分別為42%, 31%, 16.5%, 115%。表6 pcr檢測mrd的情況檢測時間檢測人數(shù)mrd陽性人數(shù)在誘導(dǎo)化療結(jié)束后2912 (41. 1%)鞏固化療12周289 (31.2%)24周264 (15. 4%)36周223 (12. 5%)3 pcr及fcm兩種方法的比較:對于同時能用兩種方法檢測的病例，各個時間段檢出的陽 性率比較，兩者無差別。表7 pcr及fcm兩種方法的比較:fcmpcr合計陽性

25、陰性陽性24529陰性75966合計286495（p0 05）o4 mrd與臨床的關(guān)系：41在不同分組中mrd的陽性率的比較:16在按年齡（以18歲為界）、性別、初發(fā)病時白細胞計數(shù)（50 x 10九為界）、ph染色體、my表達、cnsl等因素分別分組中, 各個時間段mrd的檢出率均無差別。4. 2隨訪結(jié)果：33例患者誘導(dǎo)化療結(jié)束獲得cr開始隨訪,， 至復(fù)發(fā)隨訪結(jié)束，為復(fù)發(fā)者隨訪至今，隨訪時間32-512天， 中位隨訪時間276天。誘導(dǎo)化療結(jié)束時，mrd陽性14例，檢 測后復(fù)發(fā)的9例，鞏固化療12周，mri）陽性9例，檢測后復(fù) 發(fā)5例，24周mrd陽性5例,檢測后復(fù)發(fā)3例,36周mrd陽 性3例

26、，檢測后復(fù)發(fā)2例。表8 隨訪結(jié)果檢測時間ccr復(fù)發(fā)合計mrd+12911誘導(dǎo)化療結(jié)束p<0. 05mrd-14522鞏固化療hrq+641012周p<0. 05mrd20222mrd>132524周p<0. 05mrd-2234mrd+12336周p<0. 05mrd-192214. 2. 2生存分析：根據(jù)患者臨床復(fù)發(fā)和持續(xù)cr的情況，對33例患者進行生存分析表9因素賦值表變量因素賦值xi年齡n18 歲=1<18 歲二0x2ph陽性=1陰性px3wbc計數(shù)50x109/l=1 <50 x 109/l-0x4mrd陽性=1陰性=0x5my表達陽性&quo

27、t;陰性-0x6cnsl合并=1不合并=0y結(jié)局復(fù)發(fā)"ccr=0表10單因素log rank分析結(jié)果2 xdypxi0.0110. 9275x20. 0310. 8661x50. 1410. 7078x60. 1610. 7286x33. 8510. 0496*x410. 0210. 0015*p<005有統(tǒng)計學(xué)意義結(jié)果顯示mrd陽性（p二0.0015）及wbc計數(shù)>50x 109/l（p二0.0496）為復(fù)發(fā)的高危因素。表11多因素分析cox回歸（前進法a=0. 10）variables bsewaldxpexp(b)95%clforexp(b)lowerupperx3

28、 984.5772. 906 0882. 674.8638 .288x41.9007o57. 270.0076. 685l68026. 601結(jié)果顯示mrd陽性（pp.007）及wbc計數(shù)50x 10九 （p二0.088）,進入回歸模型。根據(jù)33例患者的臨床復(fù)發(fā)及 ccr狀況繪制生存曲線，可以看出隨著時間的推移，ccr 的人數(shù)逐漸下降，而mrd陽性的患者的ccr狀況明顯較mrd 陰性者為差。生存曲線"svrrinl hbctei*survival functions in.00. 二 44.mb 18 wo xd <0tiib山西醫(yī)科大學(xué)igh和tcr基因重排為淋巴系克隆的特異

29、性標(biāo)志。其理論依 據(jù)igh和tcr基因聯(lián)合區(qū)的高變區(qū)（v）、多樣區(qū)（d）和連接區(qū) （j）的基因片段組合，組合因隨機序列插入和序列缺乏等而千差萬別，也就是說，每個淋巴細胞或每一淋巴細胞克隆的igh 和tcr基因聯(lián)合區(qū)（v叮）均不同，這樣每一例淋巴系白血病細 胞的igh和tcr基因聯(lián)合區(qū)均是唯一的，正常淋巴細胞是不同 的。本研究顯示：igh基因在80%的b系all發(fā)生重排，tcr在82% 的t系all發(fā)生重排，本數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，理論上igh 基因重排只應(yīng)該出現(xiàn)在b-all, tcr基因重排只應(yīng)出現(xiàn)在t-all,過去也曾將兩種基因作為區(qū)分兩種惡性腫瘤的特異性指標(biāo)，但本研究與saiki, vo

30、ndogon等人研究一致。t、b all確實有交 叉重排，這可能與兩種重排發(fā)生時所需要的酶相同有關(guān)。因此,不能單純用tcr及igh基因重排區(qū)分t、b惡性腫瘤，但是由于大 部分all均存在tcr及igh基因重排，因此可以作為all患者微小 殘留病較為理想的基因標(biāo)志。白血病是某一類型造血細胞惡性增殖形成優(yōu)勢克隆的結(jié) 果。白血病細胞往往停滯在某一分化階段，大多數(shù)白血病表達 某種分化早期抗原，流式細胞儀可檢測到all特有的分化抗 原，并以此為靶位監(jiān)測mrd,本研究釆用的cd45/ssc （側(cè)向 角光散射）設(shè)門法其原理是，cd45表達于所有的白細胞膜， 其表達強度在不同細胞各異。淋巴細胞單核細胞成熟粒細

31、胞 原幼細胞，而紅細胞和漿細胞不表達。ssc在成熟粒細胞最大山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2002it單核細胞原幼細胞與淋巴細胞紅細胞。這樣cd45/ssc雙 參數(shù)散點圖上可以顯示出4個細胞群體，其中一群cd45表達弱 于淋巴細胞，ssc小于成熟粒細胞的為原幼細胞。原幼細胞 少時只有cd45/ssc圖形中能清晰顯示。找到原始細胞群之后 對該群細胞進行分析，對于mrd的檢測十分有利。fcm與pcr方法檢測mrd的比較：在研究中，初診時igh、 tcr基因重排雙陰性的患者只能用流式細胞儀的方法監(jiān)mrd。 29例均能用兩種方法檢測mrd的患者在各個檢測時段，mrd 的陽性率無顯著性差異。說明兩種方法有很好

32、的相關(guān)性。3例fcm檢測陰性，但pcr檢測陽性的患者分別在檢測后，61天、92天、181天復(fù)發(fā)；2例pcr檢測陰性，而流式細胞儀檢測陽性的患者分別在檢測后，153天、212天復(fù)發(fā)，說明兩種方法又 有很好的互補性。造成fcm假陰性的原因可能與白血病細胞的 抗原丟失有關(guān)，造成pcr檢測假陰性的原因可能與白血病細胞 的克隆轉(zhuǎn)換或寡克隆存在有關(guān)。mrd與臨床復(fù)發(fā)的關(guān)系：本研究顯示在按不同年齡、白細胞計數(shù)、性別、ph染色體的有無、my表達的有無及cnsl有 無的分組中，mrd的陽性率均無顯著性差異，說明mrd與上述 因素?zé)o關(guān)。生存分析顯示：各個檢測時段mrd的陽性與復(fù)發(fā)率 高度相關(guān)。與復(fù)發(fā)相關(guān)的因素還有

33、：白細胞計數(shù)50x109/l, 本研究分析結(jié)果中其他影響all預(yù)后的因素未顯示，其原因可 能與樣本量偏少，觀察時間有限有關(guān)。另外在研究中有3例患 者在誘導(dǎo)化療后,mrd陰性,但分別在鞏固化療的12周（2例）、24周mrd陽性并且在檢測后的61天、72天、112天復(fù)發(fā)， 故我們認為，mrd的檢出或由陰轉(zhuǎn)陽，與臨床復(fù)發(fā)高度相關(guān)， 而且可以較形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)提前數(shù)月。mrd陰性患者ccr率高，但 不能排除復(fù)發(fā)的可能，定期多次對患者進行mrd的檢測，比一 次檢測能夠為臨床提供更準(zhǔn)確的信息。綜上所述，每位患者在初診時進行形態(tài)學(xué)，免疫學(xué)，分子生物學(xué)，細胞遺傳學(xué)等。全面檢查，建立病例檔案，對于mri 的檢測及實現(xiàn)

34、白血病患者的個體化治療，最終獲得痊愈有著非 常重要的意義。參考文獻1.聶建民，林煥馨，郭亮。pcr技術(shù)在兒童all微小殘留病中的檢測及臨床意義。臨床血液學(xué)雜志,1998, 11 (4)： 149-1512 campana, puic-h. detection of minimal residual disease in acute leukemia: methodological advances and clinical significance blood, 1995, 85:1416-343 dan dongen jjm, szceepanski t, de bruijin, et al

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38、ukemia. j clin oncol, 1998, 16:3711.10. coustan-smith e, behm fg, sanchez j, et al. immunological detection of minimal residual disease in children with acute lymphoblastic leudemia. lancet, 1998, 351:550-554陳珊。流式細胞術(shù)白血病免疫分型規(guī)范化，中國實驗血液學(xué)雜志,2002, 20(1):12. 劉永昌，郭素堂等。淋巴細胞惡性增殖病基因重排及其意義，臨床血液學(xué)雜志，1999(8) 65-7

39、013. m bruggemann, j droese, i bolz improve assessment of mrd in b-cen malignance using fluorogenic consensus probes for real time quantitative pcr. leukemia (2000)14:1419442514. ojhm verhagen, mj willemse, wb breunis. applicationof germline igh probes in real-time quantitative pcr fd the detection

40、of mrd in all. leukemic (2000)14:1426-1433急性白血病微小殘留病的檢測viie1iiiii白血病微小殘留病變(minimal residual disease) mrd 是指經(jīng)治療達到完全緩解后，用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法不能檢測出的 體內(nèi)存在微量白血病細胞。近20年來，隨著化療及造血干細 胞移植技術(shù)的不斷提髙，白血病在治療上有了很大的進展，相 當(dāng)一部分患者可以得到臨床完全緩解(cr),甚至達到治愈， 但困擾臨床的一個重要問題是復(fù)發(fā)。究其根源，是因為無論何 種治療方法，都無法徹底殺滅體內(nèi)殘留的白血病細胞，最終這 些殘留的癌細胞將死灰復(fù)燃，導(dǎo)致白血病的復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的根

41、源 就是體內(nèi)的mrd,因此為了徹底根治mrd并避免盲目無意義治 療，對mrd檢測方法的研究具有重要意義。mrd的臨床意義預(yù)測白血病發(fā)展趨向，早期預(yù)報復(fù)發(fā)。指導(dǎo)白血病緩解后治療，并是個體化治療的依據(jù)之一。 可確定持續(xù)cr的白血病患者何時停止治療。機，5估計預(yù)后，包括cr的難易及dfs(disease-free survival) 和 or (overall survival)o6 mrd的檢測有助于制定更確切的白血病完全緩解的標(biāo)準(zhǔn)。 mrd檢測的方法監(jiān)測移植后mrd,幫助選擇自體造血干細胞移植的最佳時 評價體外凈化效果，選擇凈化手段。靈敏度也有很大區(qū)別，現(xiàn)大致介紹如下1、形態(tài)學(xué)有細胞遺傳學(xué)：手工

42、操作，檢測數(shù)目有限，靈敏度只有l(wèi)-5%o2、白血病祖細胞（cfu-l）培養(yǎng)法：條件嚴格，且在cr期，原始幼稚細胞5%時，cfu-l不易形成，影響觀測，靈敏 度為1-5%,國外有學(xué)者以cfu-l結(jié)合fcm對mrd做定量檢測 獲得成功。3. southern-blot,即dna印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)，靈敏度為1-5%。4、熒光原位雜交術(shù)（fish）：可從單個細胞水平提供直觀, 精確的結(jié)果，與rt-pcr相比可減少交叉污染而引起的假陽性, 與southern-blot相比有周期短（只需48小時即可得到結(jié)果）, 且無放射性等優(yōu)點，但它仍受到非整倍及一些遺傳技術(shù)假象的 困擾，靈敏度只有1%。5、流式細胞術(shù)（fcm

43、）：細胞計數(shù)快而且數(shù)量大，有較大的應(yīng)用前景，但它只能適用于有限的幾種表型，靈敏度達10-4 級。6、多聚酶鏈反應(yīng)（pcr）技術(shù)，臨床上應(yīng)用較多方法為針對dna的pcr,針對mrna的pt-pcr靈敏度高達10-410-5, 乃至10-6o經(jīng)過大量實驗研究，目前檢測mrd最常用較理想的方法有現(xiàn)分述如下:熒光原位雜交熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, fish）是近年來在細胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)山西醫(yī)科大學(xué)合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，它應(yīng)用非放射性物質(zhì)標(biāo) 記核酸探針，可以在染色體和新時期核上對特異dna序列進行 定性、定量和定位研

44、究。由于它具有快速、靈敏、安全和準(zhǔn)確 等優(yōu)點，因而正在成為一種新的有價值的mrd檢測方法 熒光原位雜交法對各型急性白血病mrd檢測的作用急性淋巴細胞性白血病（all）在兒童all中，大于50的超二倍體的發(fā)生率高達25%-30%, 并且該種核型常提示預(yù)后良好。因此檢測該類all的mrd對治 療和預(yù)后有著非常重要的價值。常規(guī)核型分析由于通常只能分 析少量分裂相（20-25個），故敏感性甚低，southern blot和 pcr等技術(shù)對染色體數(shù)目異常又不適用，相反，應(yīng)用染色體著 絲粒特異性探針進行新時期fish檢測可得到滿意的結(jié)果。 white等對13例超二倍體核型的兒童all cr后進行fish檢

45、 測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中5例陽性，且后來不久均復(fù)發(fā)。anasteasi 等釆用17號著絲粒探針對2例伴有三體17的兒童all于治 療結(jié)束后進行fish檢測和跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)其中1例有10.6% 的細胞顯示三體17, 2個半月后其病情復(fù)發(fā)；而另1例則為正 常二倍體，隨訪12個月未見復(fù)發(fā)。kasprzyk等采用單色、 雙色和三色fish技術(shù)對16例超二倍體all在cr期進行mrd 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述三種方法的敏感性分別為10-1. 10-3和 10-4。由此可見，采用多色fish可提高mrd檢測的敏感性。在成人all中，t（9； 22）易位較為多見。因此，采用9號 和22號全染色體探針（wcp）進行fis

46、h檢測亦是一種直觀和bmt治療后用9號wcp進行fish檢測，結(jié)果其中3例陽性， 且分別在檢測后1-3個月復(fù)發(fā)死亡，而1例陰性患者隨訪13 個月尚在cr中。急性非淋巴細胞性白血病(anll) 在anll的染色體異常中約有60%系特異性染色體重排,它們和anll各亞型有著密切的聯(lián)系，并且具有重要的預(yù)后意義，如 t (15; 17)見于m3, t (8; 21)見于m2, v/del (16)見于 m4e0, t(9;22)見于ml。前三者提示預(yù)后較好，后者提示預(yù)后較差。伴有上述異常的anll均可用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr) 技術(shù)或wcp-fish技術(shù)檢測其mrdolian等對10例緩解

47、后2-93 個月的伴有t(15; 17)易位的m3患者采用17號wcp進行fish檢測，結(jié)果6例陰性患者隨訪25-33個月仍在cr中，而4例 陽性患者分別在1h4個月內(nèi)復(fù)發(fā)。tempersi等采用17號11(wcp對4例伴t(15;17)易位m3患者于cr后進行fish檢測和 常規(guī)核型分析，結(jié)果g帶分析均為正常核型，而fish發(fā)現(xiàn)其 中3例分別有2/2& 2/22和3/13的細胞顯示t(15;17)易位。 作者認為wcp-fish技術(shù)和常規(guī)核型分析相比，其靈敏度較高, 值得推薦用來監(jiān)測伴有特異性易位急性白血病的mrdo tanaka 等采用pml/rar a基因探針，檢測5例化療后和1

48、例bmt后 的m3患者，其中顯示陽性的2例均于6月后復(fù)發(fā)。有作者將 fish和rt-pcr靈敏度低，但其假陽性率亦較低，且fish可 提供衡量白血病負荷的數(shù)量指標(biāo)，而rt-pcr> southenblot等 方法則不能。另外，由于fish檢測到的殘留細胞一般處于分 裂期，這種增殖期細胞比非增殖細胞更能導(dǎo)致復(fù)發(fā)，故fish山西醫(yī)科大學(xué)結(jié)果能較準(zhǔn)確地預(yù)測復(fù)發(fā)6對于伴有染色體數(shù)目異常如+8、-7的anll來說，fish就 更顯示其優(yōu)越性了 o white等對1例伴有三體8的anll作常 規(guī)核型分析及間期fish檢測，常規(guī)核型分析只在初診及復(fù)發(fā) 的檢出三體8號異常，而新時期fish在初診，cr和

49、復(fù)發(fā)時均為陽性。由此可見，fish較常規(guī)核型分析更為敏感。nylund等對7例伴有染色體數(shù)目異常的anll于cr期采用fish進 行檢測，結(jié)果3例陽性，其中2例不久后復(fù)發(fā)；相反，4例陰 性患者在隨訪期內(nèi)無1例復(fù)發(fā)?？傊?，fish技術(shù)的出現(xiàn)不但是常規(guī)細胞遺傳學(xué)的重要補 充，而且為mrd檢測增添了一種新的手段。與常規(guī)核型分析相 比，其敏感性和特異性均在前者之上，并且具有簡便、直觀和 快速等優(yōu)點；與rt-pcr相比，其敏感性雖不如前者，但假陽 性發(fā)生率較低，且有定量和準(zhǔn)確預(yù)測復(fù)發(fā)的價值。相信隨著 多色fish和自動化分析技術(shù)的應(yīng)用，fish在白血病mrd的檢 測中將會發(fā)揮越來越大的作用。多聚酶鏈反應(yīng)

50、(polymerase chain reaction pcr)技術(shù)iipcr是無細胞dna克隆方法，能夠在體外極為高效地從復(fù) 雜dna中，特異地擴增目的dna序列。由于pcr簡便快速，靈 敏度高，可檢測僅達10-470-6水平的白血病細胞，故廣泛用 于白血病的mrd檢測。pcr檢測白血病微小殘留病常利用的靶基因pcr檢測mrd常利用白血病細胞出現(xiàn)的特殊基因作靶基因，主要包括染色體平衡易位產(chǎn)生的融合基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物山西醫(yī)科大學(xué)5rna),抗原受體基因重排和癌基因。融合基因"16j常見的包括慢性粒細胞白血病(cml),位于染色體9q34的abelson原癌基因(abl)易位至22ql 1

51、的斷裂點簇區(qū)(bcr),形成bcr/abl融合基因；早幼粒白血病(apl) ,t(15;17)易位導(dǎo)致15q24的轉(zhuǎn)錄因子基因pml,與17q21的維甲酸受體?；?rara )融合，形成15號染色體上pml/rara融合基因；急性髓細胞白血病(aml)位于染色體21q22的aml1基因與位于8q22的et0基因融合形成aml1/et0融合基因；急性粒單細胞白血病臂間倒位inv(16) (pl3q22)或同源染色體易位t (16; 16) (pl3;q22),導(dǎo)致16q22的核心結(jié)合因子(亞單位基 因(cbfb )與16pl3的平滑肌肌球蛋白重鏈基因(myh11)融 合形成cbfp/myh11

52、融合基因；兒童急性白血病中aml1基因 與12pl3的tel基因融合形成tel/aml1融合基因；all中t(l;19)易位使19pl3的e2a基因與lq23的pbx1基因融合,產(chǎn)生e2a/pbx1融合基因?？乖荏w重排9t 13> 16包括免疫球蛋白(ig)和t細胞受體(tcr)基因重排。為ig和tcr v區(qū)編碼的v、d、j基因片段數(shù)量較多，且在重排過程中有n區(qū)核昔酸插入及各基因片段的突變，導(dǎo)致v-d-j重 排后核昔酸序列的極富多樣性，但每種白血病細胞只有一種重 排方式，表現(xiàn)為單克隆重排，從而可利用診斷時確定的重排序 列追蹤持續(xù)存在的微星腫瘤細胞。癌基因山西醫(yī)科大學(xué)白血病有關(guān)的癌基因主

53、要是mll及其融合伙伴基因：mix 基因(亦稱all、hrx、hrtxl)位于llq23,常見的融合基因 有mll/af4> mll/af9及mll部分串聯(lián)重復(fù)(ptd)等。wt1基 因:定位于llpl3o此外尚有p53,pl6,pl5基因等。pcr檢測mrd的方法學(xué)改進多重pcrw1111由于不同類型的白血病有不同的基因變異，檢測mrd往往 很盲目。pallisgaard等陶提出可用多重pcr反應(yīng)，用8個平 行反應(yīng)管同時篩選出29種染色體易位/畸變。為驗證此方法的 可行性，他們利用102例aml和62例all進行回顧性分析， 發(fā)現(xiàn)用細胞遺傳學(xué)方法染色體畸變檢出率為42%(28/26,

54、aml)、 38%(17/45, all)；用多重 pcr 為 44% (45/102, aml)、45%( 28/62,all),且在33%(22/66)和47%(21/45)具有細胞遺傳學(xué)資料的aml和all病例中檢出了前者未能發(fā)現(xiàn)的亞染色體畸變或隱蔽 易位。scurto等呦同時篩選幾種可劃分兒童all危險度的易 位，包括 t(9;22)、t(l;、t (4;11)、t(12;21)等。在對 70份樣本及5個細胞系的分析中，多重pcr與單一 pcr獲得的結(jié) 果完全一致。實際操作要方便得多。定時定量 rt-pcr (real-time quantitati ve rt-pcr) 1151此法

55、首先以目標(biāo)特異性檢測探針(taqman mt)與cdna結(jié) 合，taqman的5，、3，端分別標(biāo)記有報告熒光染料(fam)、熒光染料淬滅劑(tamra)。在pcr延伸階段，taq酶利用5,-3,核酸酶活性使探針與cdna分離并釋放出fam,從而產(chǎn)生 特異性fam熒光信號，隨擴增進行，信號逐漸增加并與樣本中山西醫(yī)科大學(xué)最初的融合cdna量成比例，當(dāng)信號強度閾值（基線以上10個sd）時，即被電荷耦聯(lián)裝置照相機（ccd camera）探測到,ccd camera可在規(guī)定的時間間隔（如7秒）實時檢測500-650n的光信號。以pcr循環(huán)數(shù)-作擴增曲線（rn二fam信號/tamra信號-基線熒光信號），根據(jù)曲線即可確定ct值（循環(huán)閾值，即產(chǎn)生可被canera探測到的fam信號所需的最少pcr循環(huán)數(shù)）。以一系列已知數(shù)量的cdna及其ct值從曲線上讀出。為修正所加rna量、rt及pcr中抑制水平的差別，一般以融 合mrna與同理求得的參照物（膽色素原脫氫酶pbgd或b-actin）的數(shù)量之比作為其相對數(shù)量。此法可擴大定量范圍至6個數(shù)量級，且無交叉污染，無需pcr后處理，可檢測融合轉(zhuǎn) 錄本的動態(tài)變化，提供mrd定量的信息。熱啟動（hot-start） pcr常用的pml/rar a rt-pcr檢測的靈敏度只有10-3-10-4, 較其他靶分子者低，因此高達25%的陰