金黃色葡萄球菌的致病性及檢測技術(shù)

1、金黃色葡萄球菌的致病性及檢測技術(shù)2016/6/16簡介 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），有“嗜肉菌的別稱，是革蘭氏陽性菌，可引起許多嚴重感染。 金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37C，最適生長pH7.4，干燥環(huán)境下可存活數(shù)周。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑0.51.0mm。 金黃色葡萄球菌具有較強的抵抗力，對磺胺類藥物、青霉素、紅霉素、土霉素、新霉素等抗生素敏感，但易產(chǎn)生耐藥性，對堿性染料敏感。流行病學(xué) 美國疾病控制中心報告，由金黃色

2、葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。 金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則占到45%。中國金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也時有發(fā)生。 2002年，澳大利亞一次公眾活動因前一天準備的食物貯存不當(dāng)導(dǎo)致250人出現(xiàn)惡心、嘔吐、胃痙攣的癥狀，其中100多人因為脫水需要進醫(yī)院治療。 2001年4月12日，無錫市錫山區(qū)所轄小學(xué)、幼兒園因課間加餐飲用袋裝牛奶飲料導(dǎo)致食物中毒事件。 2000年6月底到7月中，日本有14555人被感染，感染源來自日本當(dāng)時最大的牛奶生產(chǎn)商雪印乳業(yè)。1997年，美國佛羅里達31人食用被污

3、染的火腿片被感染，癥狀持續(xù)了大約24小時。 金黃色葡萄球菌流行病一般多見于春夏季。 中毒食品種類多，如奶、肉、蛋、魚及其制品，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位，常成為污染源。 金黃色葡萄球菌可引起局部化膿感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。 金黃色葡萄球菌為侵襲性細菌，能產(chǎn)生毒素，對腸道破壞性大，金黃色葡萄球菌腸炎起病急，中毒癥狀嚴重，主要表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)熱、腹瀉。 金黃色葡萄球菌的致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶： a.溶血毒素：外毒素，分、四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體

4、局部缺血和壞死 b.殺死白細胞素：可破壞人的白細胞和巨噬細胞 c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān) d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌 e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C1、C2、C3、D、E及F八種血清型。腸毒素可耐受100C煮沸30分鐘而不被破壞。它引起的食物中毒癥狀是嘔吐和腹瀉。 此外，金黃色葡萄球菌還產(chǎn)生溶表皮素、明膠酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。檢測與診斷 標

5、本采集標本采集 采自不同感染部位的各種標本，包括血液、腦脊液、穿刺液；痰液、膿液、創(chuàng)傷分泌物、尿液、糞便和嘔吐物等。 直接涂片鏡檢直接涂片鏡檢 直接涂片檢查在正常情況下呈無菌狀態(tài)的體液標本如血液、腦脊液、穿刺液等，若有檢出革蘭氏陽性，顯微鏡下呈葡萄狀排列、無芽胞、莢膜，直徑0.5-1m的球菌。即具有重要的臨床價值。 分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 可以選用普通營養(yǎng)瓊脂平板、血平板和高鹽甘露醇平板，血平板用葡萄糖肉湯增菌培養(yǎng)基。該菌在普通肉湯中呈均勻迅速混濁生長；若接種于瓊脂平板上35過夜后可形成直徑約23mm的厚菌落、濕潤有光澤、呈金黃色不透明圓形凸起。若接種于血平板，菌落周圍可形成明顯的透明的溶血環(huán)。在高

6、甘露醇平板上金黃色葡萄球菌生成淡橙黃色菌落，以此可與其他凝固酶陰性的葡萄球菌相鑒別。 鑒別實驗鑒別實驗 一、血漿凝固酶試驗 血漿凝固酶是金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的，與其致病力有關(guān)的一種侵襲性酶，其作用是使血漿中的纖維蛋白在菌體表面沉積和凝固以阻礙吞噬細胞的吞噬。 血漿凝固酶分為結(jié)合型和游離型。前者結(jié)合在細菌的細胞壁上，能直接作用于血漿中的纖維蛋白原，使之轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，環(huán)繞菌體而形成凝塊。而游離型血漿凝固酶則在產(chǎn)生后被分泌到菌體外，不能直接作用于纖維蛋白原，但可以激活血漿凝血酶原，使之轉(zhuǎn)化成凝血酶，后者再作用于纖維蛋白原使其轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。 具體的測量方法也因此分為玻片法和試管法兩種。1、玻片法：

7、將待試菌落乳化于玻片上的鹽水中，經(jīng)1020S證實無自凝后，用接種環(huán)取人或兔血漿一環(huán)，與乳化菌液混合，出現(xiàn)凝集者為陽性，另設(shè)生理鹽水為陰性對照。2、試管法：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時培養(yǎng)物充分混勻，置37培養(yǎng)，每隔半小時觀察一次，連續(xù)觀察6小時，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時，內(nèi)容物不流動，判為陽性。二、耐熱核酸酶試驗將24小時肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種于甲苯胺蘭-DNA平板，35培養(yǎng)24小時，在刺種線周圍出現(xiàn)淡粉色者為陽性。本試驗金黃色葡萄球菌為陽性。三、甘露醇發(fā)酵實驗金黃色葡萄球菌可發(fā)酵甘露醇。四、Staphaurex 膠乳凝集實

8、驗是鑒定金黃色葡萄球菌的一種快速、簡便的商品化直接凝集試驗。其基本原理是在紙片上滴加包被有纖維蛋白原和IgG抗體的聚苯乙烯膠乳，然后用接種環(huán)挑取待鑒定菌株的新鮮培養(yǎng)物加入混勻，若出現(xiàn)凝集塊現(xiàn)象即為陽性。 生化鑒定生化鑒定 如上述，注意與其他凝固酶陽性的葡萄球菌的鑒別要點：PYR（吡咯烷酮-萘基酰胺試驗陰性；VP試驗陽性；鳥氨酸脫羧酶試驗陰性。 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法 用酶聯(lián)免疫吸附試驗和對流免疫電泳方法可檢測金葡菌的磷壁酸抗體。 分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法 包括PFGE脈沖場凝膠電泳以及酶切圖譜分析等。定量檢測方法 目前關(guān)于食品中金黃色葡萄球菌的定量檢測方法主要有Baird-Parker平板計

9、數(shù)法、顯色培養(yǎng)基計數(shù)法、Petrifilm TM 測試片計數(shù)法、MPN計數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附法、反相被動乳膠凝集法、放射免疫測量法、反相血凝實驗、纖維玻片凝膠雙擴散法、聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)等。 顯色培養(yǎng)基A計數(shù)法：稀釋好的菌液0.2 mL涂布接種培養(yǎng)基平板上，361培養(yǎng)24 h，按說明書判讀，可疑菌落做補充實驗（血漿凝固酶試驗，目標菌落血漿凝固酶試驗為陽性）。 顯色培養(yǎng)基B計數(shù)法：稀釋好的菌液0.2 mL涂布接種培養(yǎng)基平板上，361培養(yǎng)24 h，按說明書判讀，可疑菌落做補充實驗（滴加1 mol/L鹽酸，目標菌落有透明圈）。 Petrifilm TM 測試片計數(shù)法：稀釋好的菌液1 mL接入測試片，靜置測試片1 min，361培養(yǎng)24 h，按說明書判讀，必要時對可疑菌落用確認反應(yīng)片