細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)書(自編) (2)

1、細(xì)胞生物學(xué)（II）實驗指導(dǎo)學(xué)號 學(xué)院 專業(yè) 班級 姓名 二一三年八月目 錄實驗一 普通光學(xué)顯微鏡及其使用.3實驗二 細(xì)胞減數(shù)分裂 8實驗三 細(xì)胞骨架的顯微鏡觀察11實驗四 RNA的細(xì)胞化學(xué)Brachet反應(yīng) 13實驗五 果蠅唾液腺細(xì)胞巨大染色體的觀察.15實驗六 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬的觀察.20實驗七 動物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備.22實驗八 動物細(xì)胞融合.25實驗九 人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與核型分析.29 實驗十 常規(guī)組織切片制作法.3135實驗一 普通光學(xué)顯微鏡及其使用實驗?zāi)康?.理解普通光學(xué)顯微鏡的機械系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成及其工作原理。2. 熟練掌握普通光學(xué)顯微鏡的使用方法并進行實際操作

2、。一、顯微鏡的主要構(gòu)造 普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造主要分為三部分：機械部分、照明部分和光學(xué)部分。 1. 機械部分 （1）鏡座：是顯微鏡的底座，用以支持整個鏡體。 （2）鏡柱：是鏡座上面直立的部分，用以連接鏡座和鏡臂。 （3）鏡臂：一端連于鏡柱，一端連于鏡筒，是取放顯微鏡時手握部位。 （4）鏡筒：連在鏡臂的前上方，鏡筒上端裝有目鏡，下端裝有物鏡轉(zhuǎn)換器。 （5）物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器)：接于鏡筒的下方，可自由轉(zhuǎn)動，盤上有46個圓孔，是安裝物鏡部位。轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，可以調(diào)換不同倍數(shù)的物鏡，當(dāng)聽到碰叩聲時，此時物鏡光軸恰好對準(zhǔn)通光孔中心。光路接通，即可進行觀察；（6）鏡臺(載物臺)：在鏡筒下方，形狀有方、圓兩種，用

3、以放置玻片標(biāo)本，中央有一通光孔，我們所用的顯微鏡其鏡臺上裝有玻片標(biāo)本推進器(推片器)，推進器左側(cè)有彈簧夾，用以夾持玻片標(biāo)本，鏡臺下有推進器調(diào)節(jié)輪，可使玻片標(biāo)本作左右、前后方向的移動。（7）調(diào)節(jié)器：是裝在鏡柱上的大小兩種螺旋，調(diào)節(jié)時使鏡臺作上下方向的移動。 粗調(diào)節(jié)器(粗螺旋)：移動時可使鏡臺作快速和較大輻度的升降，通常在使用低倍鏡時，先用粗調(diào)節(jié)器迅速找到物象。 細(xì)調(diào)節(jié)器(細(xì)螺旋)：多在運用高倍鏡時使用。 圖1普通正置顯微鏡結(jié)構(gòu)圖 圖2倒置光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)圖 2照明部分 裝在鏡臺下方，包括光源，集光器。 （1）光源：燈泡或者發(fā)光LED管。 （2）集光器(聚光器)位于鏡臺下方的集光

4、器架上，由聚光鏡和光圈組成，其作用是把光線集中到所要觀察的標(biāo)本上。 聚光鏡：由一片或數(shù)片透鏡組成，起匯聚光線的作用，加強對標(biāo)本的照明，并使光線射入物鏡內(nèi)，鏡柱旁有一調(diào)節(jié)螺旋，轉(zhuǎn)動它可升降聚光器，以調(diào)節(jié)視野中光亮度的強弱。 光圈：在聚光鏡下方，由十幾張金屬薄片組成，其外側(cè)伸出一柄，推動它可調(diào)節(jié)其開孔的大小，以調(diào)節(jié)光的亮度和標(biāo)本的反差。 3.光學(xué)部分 （1）目鏡：裝在鏡筒的上端，通常備有23個，上面刻有5×、10×或15×符號以表示其放大倍數(shù)，一般裝的是10×的目鏡。 （2）物鏡：裝在鏡筒下端的旋轉(zhuǎn)器上，一般有46個物鏡，其中最短的刻有“10×”符

5、號的為低倍鏡，較長的刻有“20×”、“40×”符號的為高倍鏡，最長的刻有“100×”符號的為油鏡，此外，在高倍鏡和油鏡上還常加有一圈不同顏色的線，以示區(qū)別。 在物鏡上，還有數(shù)值孔徑(N.A.)的標(biāo)志，它反應(yīng)該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的數(shù)值孔徑如下表： 物鏡數(shù)值孔徑(N.A.)工作距離(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.250.11 表中的工作距離是指顯微鏡處于工作狀態(tài)(物象調(diào)節(jié)清楚)時物鏡的下表面與蓋玻片(蓋玻片的厚度一般為0.17mm)上表面之間的距離，物鏡的放大倍數(shù)愈大，它的

6、工作距離愈小。 顯微鏡的放大倍數(shù)是物鏡的放大倍數(shù)與目鏡的放大倍數(shù)的乘積，如物鏡為10×，目鏡為10×，其放大倍數(shù)就為10×10=100。 二、顯微鏡的使用方法1. 光路調(diào)整（1）首先選用“10×”物鏡和“10×”目鏡。（2）把聚光鏡升到頂端的位置，孔徑光闌調(diào)至適中的位置。（3）載物臺上放置玻片標(biāo)本，打開光源，調(diào)焦清晰。（4）視野中出現(xiàn)一個局部照明的區(qū)域或亮斑。（5）把聚光鏡緩慢地上下調(diào)節(jié)，使視野中的亮斑逐漸變成一個清晰的多邊形圖像。（6）如果光路沒有調(diào)中，則多邊形圖像就不在視野中央，需要調(diào)整聚光鏡旁的一對調(diào)中螺絲，把視場光闌多邊形的像調(diào)至中央位

7、置。（7）逐漸開大視場光闌，使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形，進一步核對調(diào)中的狀況，如對中不夠理想，繼續(xù)微微調(diào)對中螺絲；（8）將視場光闌稍為再微微開大一些，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此，照明系統(tǒng)調(diào)整完畢。2低倍鏡的使用方法 （1）將顯微鏡放在自己左肩前方的實驗臺上，鏡座后端距桌邊12寸為宜，便于坐著操作； （2）對光：用拇指和中指移動旋轉(zhuǎn)器(切忌手持物鏡移動)，使低倍鏡對準(zhǔn)鏡臺的通光孔(當(dāng)轉(zhuǎn)動聽到碰叩聲時，說明物鏡光軸已對準(zhǔn)鏡筒中心)。打開光圈，上升集光器，打開電源，適度調(diào)節(jié)光亮度，直到視野內(nèi)的光線均勻明亮為止； （3）放置玻片標(biāo)本：取一玻片標(biāo)本放在鏡臺上，一定使有蓋玻片的一面朝上

8、，切不可放反，用推片器彈簧夾夾住，然后旋轉(zhuǎn)推片器螺旋，將所要觀察的部位調(diào)到通光孔的正中； （4）調(diào)節(jié)焦距：以左手按逆時針方向轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使鏡臺緩慢地上升至物鏡距標(biāo)本片約5毫米處，應(yīng)注意在上升鏡臺時，切勿在目鏡上觀察。一定要從右側(cè)看著鏡臺上升，以免上升過多，造成鏡頭或標(biāo)本片的損壞。然后，兩眼同時睜開，用左眼在目鏡上觀察，左手順時針方向緩慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使鏡臺緩慢下降，直到視野中出現(xiàn)清晰的物象為止； 3高倍鏡的使用方法 （1）選好目標(biāo)：一定要先在低倍鏡下把需進一步觀察的部位調(diào)到中心，同時把物象調(diào)節(jié)到最清晰的程度，才能進行高倍鏡的觀察。 （2）轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，調(diào)換上高倍鏡頭，轉(zhuǎn)換高倍鏡時轉(zhuǎn)動速度要慢，

9、并從側(cè)面進行觀察(防止高倍鏡頭碰撞玻片)，如高倍鏡頭碰到玻片，說明低倍鏡的焦距沒有調(diào)好，應(yīng)重新操作。 （3）調(diào)節(jié)焦距：轉(zhuǎn)換好高倍鏡后，用左眼在目鏡上觀察，此時一般能見到一個不太清楚的物象，可將細(xì)調(diào)節(jié)器的螺旋逆時針移動約0.51圈，即可獲得清晰的物象(切勿用粗調(diào)節(jié)器!) 如果視野的亮度不合適，可用集光器和光圈加以調(diào)節(jié)，如果需要更換玻片標(biāo)本時，必須順時針(切勿轉(zhuǎn)錯方向)轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使鏡臺下降，方可取下玻片標(biāo)本。4油鏡的使用方法 （1）在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進一步放大的部分移到視野的中心。 （2）將集光器上升到最高位置，光圈開到最大。 （3）轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔

10、，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。 （4）用左眼觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。 如果不出現(xiàn)物象或者目標(biāo)不理想要重找，在加油區(qū)之外重找時應(yīng)按：低倍高倍油鏡程序。在加油區(qū)內(nèi)重找應(yīng)按：低倍油鏡程序，不得經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。 （5）油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許二甲苯或者（乙醚:乙醇=7:3）將鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。 三、顯微鏡使用的注意事項 1持鏡時必須是右手握臂、左手托座的姿勢，不可單手提取，以免零件脫落或碰撞到其它地方。 2輕拿輕放，不可把顯

11、微鏡放置在實驗臺的邊緣，以免碰翻落地。 3保持顯微鏡的清潔，光學(xué)和照明部分只能用擦鏡紙擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，機械部分用布擦拭。 4水滴、酒精或其它藥品切勿接觸鏡頭和鏡臺，如果沾污應(yīng)立即擦凈。 5放置玻片標(biāo)本時要對準(zhǔn)通光孔中央，且不能反放玻片，防止壓壞玻片或碰壞物鏡。 6要養(yǎng)成兩眼同時睜開的習(xí)慣，以左眼觀察視野，右眼用以繪圖。 7不要隨意取下目鏡，以防止塵土落入物鏡，也不要任意拆卸各種零件，以防損壞。 8使用完畢后，必須復(fù)原才能放回鏡箱內(nèi)，其步驟是：取下標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)器使鏡頭離開通光孔，下降鏡臺，亮度調(diào)至最暗然后關(guān)電源。下降集光器、關(guān)閉光圈，推片器回位，蓋上綢布和外罩，放回實驗臺柜內(nèi)。最

12、后填寫使用登記表。實驗二 細(xì)胞減數(shù)分裂實驗?zāi)康?了解動、植物生殖細(xì)胞的形成過程。 2了解生殖細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)生過程及各個時期的染色體和細(xì)胞變化特點，加深對減數(shù)分裂意義的認(rèn)識。 3掌握減數(shù)分裂標(biāo)本的制備方法。 實驗原理減數(shù)分裂是一種特殊方式的細(xì)胞分裂，僅在配子形成過程中發(fā)生。這一過程的特點是：細(xì)胞連續(xù)進行兩次核分裂，而染色體只復(fù)制一次，減數(shù)分裂結(jié)束形成四個子細(xì)胞（配子），每個子細(xì)胞染色體數(shù)目減少一半（n）。經(jīng)過受精作用，雌雄配子融合為合子，染色體數(shù)目又恢復(fù)母細(xì)胞的水平（2n）。這樣在物種延續(xù)的過程中確保了染色體數(shù)目的恒定，從而使物種在遺傳上具有相對的穩(wěn)定性。另外，在減數(shù)分裂過程中包含的同源染色體配

13、對、交換、分離和非同源染色體的自由組合，充分體現(xiàn)了遺傳的三大規(guī)律，在豐富基因的多樣性中起著重要的作用。 實驗儀器、材料和試劑（一） 儀器與用具 顯微鏡、鐘表鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、吸水紙 （二） 材料 蝗蟲精巢、玉米雄穗（三） 試劑 乙醇、冰醋酸、改良苯酚品紅染色液。方法與步驟（一）玉米花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的觀察 1取材在雌穗未抽出前710天，而雄花序即將抽出（手摸植株上部喇叭口處有松軟感覺），以上午911時取樣為好，此時減數(shù)分裂較盛。剝?nèi)バ鬯胪獠咳~片，露出幼穗，新鮮幼穗可直接壓片觀察，也可用Carnoy固定液固定1224小時，再經(jīng)95%和85%乙醇各30min，最后放在70%乙醇中4保存

14、，可隨時取用。2染色、制片取適當(dāng)大小穎花各一朵，置載玻片上，用解剖針剝開內(nèi)外穎，將花藥剔出，加一滴改良苯酚品紅染色液染色10min，邊染色邊用鑷子輕輕搗碎花藥，最后用鑷子除去殘渣，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周多余的染液。 3鏡檢在顯微鏡下檢查花粉母細(xì)胞、二分體、四分體以及各個時期的細(xì)胞?；ǚ勰讣?xì)胞與一般體細(xì)胞的區(qū)別是細(xì)胞外有一層較厚的透明胼胝質(zhì)壁，同時，細(xì)胞體積較近似等徑的多角形，核也較大。 （二）蝗蟲精母細(xì)胞減數(shù)分裂的觀察 蝗蟲精巢取材方便，標(biāo)本制備方法簡單，染色體數(shù)目較少，分裂過程清楚?；认x初級精母細(xì)胞染色體數(shù)2n=22+X，經(jīng)過減數(shù)分裂形成四個精細(xì)胞，每個精細(xì)胞染色體數(shù)為n=11+X或n

15、=11（注：蝗蟲的性別決定與人類不同，雌性有兩條XX染色體，雄性為XO，即只有一條X染色體，沒有Y染色體）。 1取樣以夏、秋兩季采集為宜，因此時蝗蟲精母細(xì)胞正處于減數(shù)分裂旺期?；认x雌雄個體易于區(qū)別，一般雄蟲個體較小，其腹部末端為交配器，形似船尾，而雌體較大，腹部末端分叉。 2固定捕捉后將雄蟲腹部剝開，取出精巢，放入Carnoy固定液中固定12小時，然后分別用95%和85%乙醇各30min，最后放在70%乙醇中，于4冰箱中保存。 3壓片挑取精細(xì)管，置載玻片上，水洗并吸干，滴加一滴改良苯酚品紅染色液，鑷子輕輕搗碎，染色510min，加蓋玻片，用手隔著吸水紙將材料適當(dāng)用力壓之，再用帶橡皮頭的鉛筆輕輕

16、敲擊蓋片，使成單層細(xì)胞（敲擊時勿使蓋片移動）。 4鏡檢可看到除正在分裂的細(xì)胞外，還可看到精原細(xì)胞的有絲分裂，其中期細(xì)胞呈菊花狀，細(xì)胞肥大，屬于體細(xì)胞的一般有絲分裂，染色體看上去比減數(shù)分裂細(xì)胞為多。 先用低倍鏡觀察，找到一個好的分裂相時再轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察。要求能夠?qū)p數(shù)分裂的各個時期分辨清楚，特別是對前期的各時期能夠獨立辨認(rèn)。 第一次減數(shù)分裂分為前期、中期、后期和末期，各時期特征如下： 前期減數(shù)分裂的前期時間很長，此時期染色體逐步折疊、濃縮。同時出現(xiàn)非姊妹染色體的節(jié)段交換現(xiàn)象。人們根據(jù)細(xì)胞核及染色體的形態(tài)變化將前期工劃分為五個時期。即細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期。 細(xì)線期 細(xì)胞核膨大，染

17、色質(zhì)濃縮、凝聚成染色絲，染色絲上有許多染色粒。DNA雖然已經(jīng)復(fù)制，但還看不出雙線結(jié)構(gòu)。此時由于染色體盤繞扭曲而分不清頭尾。 偶線期 同源染色體的配對，即聯(lián)會（synapsis）。配對后的同源染色體形成二價體，但是盡管此時染色體比細(xì)線期清楚，但染色體仍很細(xì)長，所以也不能辨清染色體數(shù)目。 粗線期 染色體明顯縮短變粗，同源染色體配對完畢，形成四價體。 雙線期 染色體進一步縮短，配對的同源染色體開始分開。由于染色單體間起過交換，同源染色體的相互吸引力消失，因此形成了不同形狀的交叉圖像。 終變期 染色體交叉數(shù)減少，染色體濃縮得最短，染色體呈現(xiàn)各種如“O”“8”“X”“V”形。核仁、核膜消失。此時進行染色

18、體計數(shù)十分方便。 中期：配對的染色體排列在赤道面上，同源染色體的著絲粒與細(xì)胞兩端的紡錘絲相連。如果制備的細(xì)胞是從極面壓成的標(biāo)本，則可看到同源染色體排列成環(huán)形。 后期：同源染色體在紡錘絲的牽引作用下，分別向細(xì)胞兩極移動。每個染色體有一著絲粒，帶著兩個染色單體。每一極得到n條染色體，染色體數(shù)已減半。由于雄性蝗蟲的染色體數(shù)為23，因此，其中一組為11條染色體，另一組為12條染色體（11X）。 末期：染色體移到兩極后聚集在一起，并逐步解旋而恢復(fù)到染色質(zhì)狀態(tài)。隨后核仁、核膜重新出現(xiàn)，進行胞質(zhì)分裂而形成兩個子細(xì)胞。經(jīng)過一個簡短的間期后，就進入第二次減數(shù)分裂，第二次減數(shù)分裂分為前期、中期、后期和末期。由于經(jīng)

19、過了減數(shù)第一次分裂，同源染色體己經(jīng)分離，染色體數(shù)目已經(jīng)減半，所以從形態(tài)上看第二次分裂的細(xì)胞體積較小。 前期：與末期緊密相連，時間短暫。在形態(tài)上與末期相似。 中期：同一著絲粒連接的染色單體排列在赤道面上，形成赤道板。 后期：著絲粒分裂，兩條姊妹染色單體分離，在紡錘絲的牽引下染色單體向細(xì)胞兩極移動。末期：染色體到達(dá)兩極后，逐步解旋形成染色質(zhì)，核仁、核膜重新出現(xiàn)。形成四個子細(xì)胞。細(xì)胞體積較小，形態(tài)與間期細(xì)胞類似。經(jīng)過生長、發(fā)育、變態(tài)過程逐漸形成梭型的精子。 實驗報告1簡述有絲分裂與減數(shù)分裂的異同。2繪圖示蝗蟲精母細(xì)胞減數(shù)分裂各時期，并敘述其典型特征。實驗三 細(xì)胞骨架的顯微鏡觀察實驗?zāi)康牧私饧?xì)胞骨架的

20、結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)。 實驗原理細(xì)胞骨架（cytoskeleton）是由蛋白質(zhì)絲組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)其組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細(xì)胞形態(tài)的維持，細(xì)胞的生長、運動、分裂、分化，物質(zhì)運輸，能量轉(zhuǎn)換，信息傳遞，基因表達(dá)的起到重要作用。當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理細(xì)胞時，可將細(xì)胞質(zhì)膜中和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和全部脂質(zhì)被溶解抽提，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)不受破壞而被保存，經(jīng)用戊二醛固定，考馬斯亮藍(lán)R250染色后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到由微絲組成的微絲束為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 實驗儀器、材料和試劑（一）儀器 、用具普通光學(xué)顯微鏡、50ml燒杯、玻璃滴管、容量瓶、試劑瓶、載玻片、蓋

21、玻片、鑷子、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙 （二）材料 洋蔥鱗莖 （三）試劑 lM-緩沖液：50mM 咪唑、50mM KCl、0.5mM MgCl2、lmM EGTA乙二醇四乙酸、0.lmM EDTA、lmM 琉基乙醇或DTT（二硫蘇糖醇） 26mM （pH6.8）磷酸緩沖液（用NaHCO3調(diào)pH ） 31%TritonX-100，用M-緩沖液配制 40.2%考馬斯亮藍(lán)R250，其溶劑為：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸餾水46.5ml 53%戊二醛，用2液配置 方法與步驟l. 撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮 （約lcm2大小若干片）置于裝有pH6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉。 2. 吸去磷酸緩沖液

22、，用l%TritonX-100處理2030分鐘。 3. 吸去Triton-100，用M-緩沖液洗三次，每次10分鐘。 4. 3%戊二醛固定0.51小時。 5. pH6.8磷酸緩沖液洗三次，每次10分鐘。 6. 0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色2030分鐘。 7. 用蒸餾水洗l2次，細(xì)胞置于載玻片上，加蓋玻片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。 8. 如觀察效果好，可制作成永久切片： 實驗報告 1. 繪出植物細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)圖。 2. 分析和論述在光學(xué)顯微鏡下觀察到的細(xì)胞骨架的形態(tài)特征。 附： 細(xì)胞熒光染色觀察與熒光顯微鏡的使用實驗?zāi)康恼莆諢晒怙@微鏡成像基本原理和及其使用。掌握暗視野顯微鏡的成像基本原理及其

23、使用?；驹頍晒怙@微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡，其基本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。實驗儀器、材料和試劑青蛙、洋蔥、甲醇、1丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片，熒光顯微鏡方法與步驟 1. 蛙血細(xì)胞染色觀察：取少許蛙血常規(guī)血涂片涼干甲醇固定10 min 1丫啶橙染色5 min水洗 室溫干燥（濾紙擦干玻片底面） 熒光顯微鏡觀察（先低倍后高倍觀察）（可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細(xì)胞） 2.取洋蔥撕取一小片內(nèi)表皮平面單層鋪展于玻片上室溫涼干1丫啶橙染色 5min 水洗（用吸管，小心掉片）室溫干燥（或用濾紙擦干

24、） 熒光顯微鏡觀察。注意事項1.熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀使用。2.使用熒光顯微鏡時要注意不要直接觀察激發(fā)光源，保護眼睛。 實驗報告 描述在熒光顯微鏡下所觀察到結(jié)果，并繪制細(xì)胞骨架圖像。實驗四 RNA的細(xì)胞化學(xué)Brachet反應(yīng) 實驗?zāi)康?了解Brachet反應(yīng)的原理，掌握有關(guān)的操作方法。 實驗原理 甲基綠派洛寧（Methyl green-Pyronin）為堿性染料，它能分別與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA結(jié)合而呈現(xiàn)不同顏色。當(dāng)甲基綠與派洛寧作為混合染料時，甲基綠和染色質(zhì)中DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色；派洛寧與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的RNA選擇結(jié)合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用

25、，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色。而派洛寧則與聚合程度較低的RNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色，但解聚的DNA也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅色。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親和力大，被染成藍(lán)綠色。 實驗儀器、材料和試劑 （一）器材 、用具顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙 （二）材料 洋蔥鱗莖表皮 （三）試劑 1Unna試劑：甲基綠派洛寧（Methyl green-Pyronin）染色液 甲液： 5%派洛寧水溶液 6ml 2%甲基綠水溶液 6ml 蒸餾水 16ml 乙液： 1M醋酸緩沖液（pH=4.8） 16ml 甲、乙兩液分別置

26、4冰箱備用，用時甲乙兩液混勻。 21M醋酸緩沖液（pH=4.8）配方 A液： 冰醋酸6ml加蒸餾水至100ml 。 B液： 醋酸鈉13.5g加蒸餾水100ml 。 取A液40ml+ B液60ml 混勻即為pH=4.8 。 配制注意事項： （1）Pyronin可加熱助溶。 （2）Methyl green批號不同，染色效果差別很大。商品Methyl green?；煊屑谆?， 影響染色效果，應(yīng)先把藥品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振蕩，然后靜置，直到洗脫甲基紫為止，最后干燥備用。 方法與步驟 1用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于載玻片上。 2滴一滴Unna試劑，染色30min。 3蒸餾水洗兩

27、次，吸水紙吸去多余的水分。 4蓋上蓋玻片，鏡檢。 對照片： （1）撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，經(jīng)5%三氯醋酸中90水浴處理15min 。再經(jīng)70%乙醇洗片刻，然后按步驟1-4制片觀察。 （2）撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，用0.1%RNA酶室溫處理1015min 。蒸餾水洗，吸干，然后按步驟1-4制片觀察。 實驗報告 簡述Brachet反應(yīng)的原理。繪圖示細(xì)胞中RNA的分布。實驗五 果蠅唾液腺細(xì)胞巨大染色體的觀察實驗?zāi)康?觀察果蠅和搖蚊幼蟲唾液腺細(xì)胞巨大染色體的形態(tài)特征。實驗原理 染色體的數(shù)量和形態(tài)特征跟生物體的性狀遺傳有著密切的關(guān)系，而染色體的形態(tài)特征又不易觀察，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)果蠅幼蟲的唾液腺細(xì)胞染色體特別大，比果

28、蠅的其他體細(xì)胞染色體要長100200倍，體積大上千倍，搖蚊幼蟲的唾腺細(xì)胞的染色體，也比一般細(xì)胞大100倍以上。在一般光學(xué)顯微鏡下就能清楚地看到，這些都是觀察染色體理想的材料。實驗儀器、材料和試劑 果蠅三齡幼蟲；解剖針，鑷子，載玻片，蓋玻片，解剖鏡或有支架的放大鏡，吸水紙；0.75%氯化鈉溶液，乙酸洋紅或乙酸地衣紅染液，1N鹽酸，0.4%氯化鈉溶液。方法與步驟1. 摘取唾液腺 取一塊潔凈的載玻片，在載玻片中央滴一小滴0.75%氯化鈉溶液（相當(dāng)于果蠅的生理鹽水）。用解剖針挑起一條肥胖的充分發(fā)育的果蠅三齡幼蟲，放入載玻片上溶液中，生理鹽水不宜多，以減少幼蟲活動。把載玻片放在解剖鏡或放大鏡下，左手用鑷

29、子夾住幼蟲體1/2處，右手持一解剖針，壓住頭部（外形似一個黑色小點），輕輕地向前拉，當(dāng)拉出頭部時，腺體隨同內(nèi)臟一起拉出。如果頭部拉斷，腺體沒拉出，可以用解剖針從鑷子附近的腹部緩緩地向頭端擠壓，這樣也可以壓出唾液腺。拉出后借助解剖鏡或放大鏡放大唾液腺，細(xì)心分離，理出雙叉形囊狀腺體。如用放大鏡看不清，可放在低倍顯微鏡下觀察區(qū)別，光線調(diào)弱一些，小心剔除腺體周圍乳白色的脂肪組織和身體的殘余部分，在載玻片中央僅留下具有唾液腺的部分。在材料上滴加一滴0.4%氯化鈉溶液，低滲處理2分鐘，使唾液腺細(xì)胞膨脹。2. 染色 小心吸去材料周圍的溶液，先滴2滴1N鹽酸在唾液腺上，水解2分鐘（不能超過3分鐘）。然后用清水

30、輕輕滴洗。滴洗方法是：滴入清水，用吸水紙從材料旁邊吸水（絕對不能碰到實驗材料，否則材料就被紙吸附而丟失）。這樣反復(fù)幾次，洗去鹽酸。用吸水紙吸干周圍的水分，再在材料上滴2滴乙酸洋紅染液，染色10分鐘。如果氣溫過低，可把載玻片放在酒精燈上來回移動加溫（不可煮沸），以加速染色。3. 壓片 在染好色的材料上，蓋上蓋玻片，再覆以二三層吸水紙，用手掌用力壓一下，使細(xì)胞中染色體散開，壓片時注意不能移動蓋玻片，必要時再壓一次。4. 觀察 先用低倍顯微鏡觀察，找到染色體分散的細(xì)胞，再用高倍鏡觀察。結(jié)果與分析1.可以看到每個唾液腺細(xì)胞都有數(shù)條形似飄帶的染色體，且在每條染色體上有粗細(xì)不等的橫紋，或叫做帶，一般認(rèn)為橫

31、紋是基因所在的位置。2.果蠅易采集和培養(yǎng)，染色體數(shù)目少（僅4對），體形大，（唾液腺染色體更大）。果蠅的染色體中，其中有一對是性染色體（x染色體是棒狀，y染色體是鉤狀），另3對是常染色體，分別定為、（見圖）。 3.果蠅唾液腺細(xì)胞染色體特別大，是因為唾液腺細(xì)胞中染色體都處于同源染色體配對的階段，同時唾液腺細(xì)胞沒有分裂能力，所以染色體既大又集中。一般情況下，染色體只有在細(xì)胞分裂的中期才能較清楚地觀察到。注意事項1. 一定加生理鹽水，否則唾腺易干， 將脂肪組織清除干凈。2. 水不可太多，否則幼蟲會漂浮而且活躍， 染色時間不可過長，否則背景也著色。3. 壓片時要揉，用力要均勻。吸水時勿將唾腺一起吸走實驗

32、報告1檢查你制作的制片，尋找形態(tài)良好、分散適中的圖象仔細(xì)觀察各條臂的特點。2畫出所制染色體的形態(tài)，大小，并標(biāo)出明顯的橫紋特點。實驗六 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬的觀察 實驗?zāi)康?1通過觀察小鼠巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞的實驗，了解巨噬細(xì)胞對異物吞噬的原理和功能。 2了解吞噬在機體非特異免疫中的重要作用。 實驗原理高等動物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，具有吞噬的功能。它們廣泛分布在組織和血液中，在機體的非特異免疫功能中起著重要的作用。當(dāng)病原微生物或其它異物侵入機體時，能招引巨噬細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞又具有趨化性，它通過產(chǎn)生活躍的變形運動，主動向病原體和異物移行聚集，首先把異物吸附在細(xì)胞表面，隨之，吸附區(qū)域的細(xì)

33、胞膜向內(nèi)凹陷，伸出偽足包圍異物，并吞入胞質(zhì)，形成吞噬泡，繼而在細(xì)胞質(zhì)中的初級溶酶體與吞噬泡融合，形成吞噬溶酶體，把病原體殺死，異物消化分解。 實驗儀器、材料和用具 （一）儀器、用具 顯微鏡、高壓滅菌鍋、解剖盤、解剖剪、1ml注射器、吸管、載玻片、蓋玻片 （二）材料 小鼠（體重20g左右），雞血 （三）試劑 6淀粉肉湯（含0.3臺盼藍(lán)） 方法與步驟 1實驗前2天，每天給小白鼠腹腔注射6淀粉肉湯（含臺盼藍(lán)）1ml。 2實驗時，再往腹腔內(nèi)注射1ml 1雞紅細(xì)胞懸液，并輕揉腹部，使雞紅細(xì)胞懸液分散。 32030in后，用脊椎脫臼法處死小鼠（右手抓住鼠尾，用力向后拉，左手拇指與食指同時按住鼠頭，使脊髓與

34、腦髓間斷開致死）。 4迅速剖開腹腔，用未裝針頭的注射器或吸管吸取腹腔液。 5取一張干凈的載玻片，滴一滴腹腔液，蓋上蓋玻片，顯微鏡下檢查。 觀察時，將視野光線調(diào)暗。在高倍鏡下，先分辨清雞紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。雞紅細(xì)胞為淡黃色、橢圓形、有核的細(xì)胞。而數(shù)量較多、體積較大圓形或不規(guī)則的細(xì)胞，其表面有許多似毛刺狀的小突起（偽足），胞質(zhì)中有數(shù)量不等的藍(lán)色顆粒（為吞入的含臺盼藍(lán)淀粉肉湯形成的吞噬泡）即為巨噬細(xì)胞。變換視野，仔細(xì)觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的過程?？梢娪械碾u紅細(xì)胞（一至多個）緊貼附于巨噬細(xì)胞的表面；有的巨噬細(xì)胞已將1至數(shù)個紅細(xì)胞部分吞入；有的巨噬細(xì)胞已吞入1個或幾個紅細(xì)胞在胞質(zhì)中剛剛形成橢圓形的吞噬泡

35、；有的巨噬細(xì)胞內(nèi)的吞噬泡體積縮小，并呈現(xiàn)圓形，這是與初級溶酶體發(fā)生融合，泡內(nèi)物正在被消化分解。 注意事項 ： 1小鼠腹腔注射時注意不要刺傷內(nèi)臟。 2腹腔內(nèi)的細(xì)胞濃度過大，可用生理鹽水稀釋。 實驗報告 1繪圖示出所觀察到的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的各種形態(tài)。 2計算吞噬百分比，即每100個吞噬細(xì)胞中吞有雞紅細(xì)胞的吞噬細(xì)胞數(shù)。實驗七 動物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備實驗?zāi)康?掌握動物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備技術(shù)。 2觀察染色體的數(shù)目以及形態(tài)特征。 實驗原理骨髓細(xì)胞具有豐富的細(xì)胞質(zhì)和高度分裂能力，因此不必經(jīng)體外培養(yǎng)，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可直接觀察到分裂細(xì)胞。經(jīng)秋水仙素處理后，分裂

36、的骨髓細(xì)胞被阻斷在有絲分裂中期，再經(jīng)離心、低滲、固定、滴片等步驟，便可制作出理想的染色體標(biāo)本，是研究動物細(xì)胞遺傳學(xué)的好材料。實驗儀器、材料和用具（一） 儀器、用具 天平、離心機、溫箱、顯微鏡、注射器、解剖盤、解剖剪、刀片、試管架、10ml離心管、吸管、燒杯、量筒、酒精燈、冰凍載玻片、玻璃板、吸水紙、擦鏡紙 （二） 材料 小鼠或青蛙 （三）試劑 1Carnoy固定液（甲醇冰醋酸 = 31） 20.1%秋水仙素溶液 稱取10mg秋水仙素，加入10ml 0.65%生理鹽水（1ml含有1000微克，0.1ml含有100微克秋水仙素）。 3生理鹽水 41/15 mol/L磷酸緩沖液（pH7.4） A液：

37、1/15M磷酸氫二鈉：1000ml含Na2HPO4 9.465g或Na2HPO4·2H2O 11.876g或 Na2HPO4·12H2O 23.88g 。 B液：1/15M磷酸二氫鉀：1000ml含KH2PO4 9.07g 。 80ml A液+ 20ml B液混勻即成pH7.4 。 5Giemsa染液Giemsa原液：Giemsa粉 0.5g， 甘油（AR） 33ml ，甲醇（AR） 33ml 先將少量甘油加入研鉢中，將Giemsa粉充分研細(xì)，再倒入剩余甘油，并在56溫箱中保溫2小時，然后再加入甲醇混勻，貯存在棕色瓶內(nèi)。 方法與步驟1秋水仙素處理： 實驗前34小時，按動物每

38、克體重24g的劑量，腹腔注射秋水仙素。 2取股骨： 處死動物后，立即取出股骨，用刀片剔掉肌肉。 3收集骨髓細(xì)胞：用刀片切開股骨的兩端，用盛有生理鹽水的注射器插入股骨的上端，沖出骨髓細(xì)胞至離心管中，直至股骨變白色為止。將收集的骨髓細(xì)胞平衡后放入離心機，以1000r/min 離心10min. 4低滲處理：棄上清液，加入6ml蒸餾水，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸浮液，置37溫箱中低滲20min 。 5預(yù)固定： 加入5滴新配的固定液，立即打勻，并以1000r/min 離心10min后，棄上 清液。 6固定： 沿管壁慢慢加入6ml固定液，立即用吸管吹打成細(xì)胞懸液，室溫下固定20min.。1000r/min 離

39、心10min后棄上清液。 7重復(fù)步驟6的操作。 8沉淀物中加入0.30.5ml固定液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液。 9滴片： 用鑷子取預(yù)先冰凍的干凈載玻片，迅速滴上23滴細(xì)胞懸浮液，立即用嘴向同一方向吹氣，使細(xì)胞分散均勻，然后置酒精燈上微微加熱干燥。 10染色： 將晾干的玻片放在潔凈的玻板上，用Giemsa染液（Giemsa原液用10倍體積的1/15M磷酸緩沖液（pH7.4）稀釋）染色30min，自來水沖洗，空氣干燥。 11鏡檢。在低倍鏡下找到中期分裂相的細(xì)胞，轉(zhuǎn)用高倍鏡，選擇染色體分散適度、長度適中的分裂相進行觀察。 注意事項1掌握好秋水仙素的濃度和處理時間，濃度過高，處理時間過長，都會使染色體過

40、分收縮，不利于形態(tài)觀察。 2控制好離心的轉(zhuǎn)速，一般以1000r/min為宜，轉(zhuǎn)速過大，會造成細(xì)胞結(jié)塊，不利于染色體伸展；轉(zhuǎn)速過小，細(xì)胞不能充分沉淀，會造成細(xì)胞分裂相丟失。 3低滲處理是實驗成敗的關(guān)鍵，其目的是使細(xì)胞體積脹大，染色體松散。低滲處理時間過長，會造成細(xì)胞破裂，染色體丟失，不能準(zhǔn)確計數(shù)。低滲處理時間不足，則細(xì)胞內(nèi)染色體聚集一起，不能很好伸展開來，觀察時無法區(qū)辨和計數(shù)。 4固定液要現(xiàn)配現(xiàn)用，固定要充分。 5載玻片要潔凈，無油脂和預(yù)先冰凍，滴片要有一定的高度，以利于細(xì)胞和染色體充分分散。 實驗報告1通過這次實驗，你認(rèn)為實驗中要注意那些問題？ 2分析你做的標(biāo)本的優(yōu)劣，繪出骨髓細(xì)胞分裂中期染色

41、體核型圖實驗八 動物細(xì)胞融合實驗?zāi)康?了解聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)體外細(xì)胞融合的基本原理。 2通過PEG誘導(dǎo)雞血細(xì)胞之間的融合實驗，初步掌握細(xì)胞融合的基本方法。 實驗原理細(xì)胞融合（cell fusion）又稱體細(xì)胞雜交，是指用人工方法使兩個或兩個以上的體細(xì)胞融合成異核體細(xì)胞，隨后，異核體同步進入有絲分裂，核膜崩潰，來自兩個親本細(xì)胞的基因組合在一起形成只含有一個細(xì)胞核的雜種細(xì)胞（hybrid cell）。細(xì)胞融合技術(shù)是研究細(xì)胞遺傳、基因定位、細(xì)胞免疫、病毒和腫瘤的重要手段。依據(jù)融合過程采用的助融劑的不同，細(xì)胞融合可分為：（1）病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，如：仙臺病毒（hemagglutinating vi

42、rus of Japan，HVJ）；（2）化學(xué)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，如：聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）；（3）電場誘導(dǎo)的細(xì)胞融合；（4）激光誘導(dǎo)的細(xì)胞融合。 PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子質(zhì)量的多聚體。PEG可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點處脂類分子發(fā)生疏散和重組，引起細(xì)胞融合。該方法應(yīng)用分子質(zhì)量為4006000的PEG溶液引起細(xì)胞的聚集和粘連，產(chǎn)生高頻率的細(xì)胞融合。融合的頻率和活力與所用PEG的分子質(zhì)量、濃度、作用時間、細(xì)胞的生理狀態(tài)與密度等有關(guān)。 實驗儀器、材料和試劑（一）儀器、用具 注射器、刻度離心管、離心機、血細(xì)胞計數(shù)板、水浴鍋、滴管、顯微

43、鏡、燒杯、容量瓶、凹面載玻片、蓋玻片、酒精燈等。 （二）材料 成年家雞 （三）試劑 10.85 % NaCl 溶液 2GKN液：8.0g NaCl，0.4g KCl，1.77 g Na2HPO4·2H2O，0.69 g NaH2PO4·H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚紅，溶于1000ml重蒸水中。 350%（W/V）PEG溶液 1） 取50g PEG（分子質(zhì)量=4000）放入100ml 瓶中，高壓滅菌20分鐘。 2） 讓PEG冷卻至5060，勿讓其凝固。 3） 加入50ml預(yù)熱至50的GKN液，混勻，置37備用。 4Hanks原液 (10×)： NaCl 80

44、.0g Na2HPO4·12H2O 1.2 KCl 4.0g KH2PO4 0.6 MgSO4·7 H2O 2.0 葡萄糖 10.0g CaCl2 1.4g 1）稱取1.4g的CaCl2，融于3050ml的重蒸水中。 2）取 1000ml的燒杯及容量瓶各一個，先放重蒸水800ml于燒杯中，然后按上述配方順序，逐一稱取藥品。必須在前一藥品完全溶解后，方可加入下一藥品，直到葡萄糖完全溶解后，再將已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至1000ml。 5Hanks液： Hanks原液 100ml 重蒸水 896ml 0.5%酚紅 4ml 配好的Hanks液，分裝包扎好貼上標(biāo)簽，經(jīng)過

45、滅菌后，4保存。 6Janus green 染液 方法與步驟 1. 雞血細(xì)胞的獲得： 從家雞的翼根靜脈用注射器采血，注入試管后，迅速加入肝素（100U 肝素/ 5ml全血）混合，制成抗凝全血。 2. 雞血細(xì)胞儲備液的制備： 在抗凝全血的試管中，加入4倍體積的0.85 %NaCl溶液，制成紅細(xì)胞儲備液，置于4冰箱內(nèi)可供一周內(nèi)使用。 3. 雞血細(xì)胞懸液的制備： 取雞血細(xì)胞儲備液1ml，加入4ml 0.85 %NaCl溶液，混勻后，1200rpm離心5min，棄去上清液，再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述條件離心一次。最后，棄去上清液，加入10ml的GKN溶液制成雞血細(xì)胞懸液。 4. 計數(shù)

46、： 取0.5ml雞血細(xì)胞懸液，加3.5ml的GKN溶液進行稀釋，在血細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)。若細(xì)胞濃度過大，用GKN溶液稀釋至1X107個/ml左右。 5. 雞血細(xì)胞的收集： 吸取1ml雞血細(xì)胞懸液放入離心管中，加入4mlHanks液混勻，1000rpm離心5min。棄去上清液，用手指輕彈離心管底部，使沉淀的血細(xì)胞團塊松散。 6. PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合： 吸取0.5ml 37的50%PEG溶液，慢慢沿著離心管壁逐滴加入，邊加邊輕搖離心管，使PEG與細(xì)胞混勻，然后在37水浴中靜置2min。 7. 終止PEG作用： 緩慢加入5ml Hanks液，輕輕吹打混勻，于37水浴中靜置5min。 8. 制備細(xì)胞懸液

47、： 用吸管輕輕吹打細(xì)胞團數(shù)次使細(xì)胞團分散，1000rpm離心5min，使細(xì)胞完全沉降。棄去上清液，加Hanks液，再離心一次，棄多數(shù)上清，留少許溶液，混勻。 9. 染色和鏡檢： 吸取細(xì)胞懸液，在凹面載玻片上滴一滴，加入Janus green染液混勻，染色3min后蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況。 10. 計算細(xì)胞融合率： 細(xì)胞融合率是指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞其細(xì)胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細(xì)胞（包括已融合細(xì)胞）的細(xì)胞核總數(shù)之比，通常以百分比表示，而且要進行多個視野測定，進行統(tǒng)計分析。 注意事項1. 必須嚴(yán)格控制PEG的作用時間，通常處理細(xì)胞12min。2. 融合細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)就變成

48、一個雜種細(xì)胞，它的染色體數(shù)不是兩核的倍數(shù)，因為一些染色體會逐漸消失。實驗報告1. 畫出觀察到的融合細(xì)胞，并計算融合率。 2. 試說明細(xì)胞融合的關(guān)鍵。 實驗九 人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與染色體標(biāo)本制備實驗?zāi)康?掌握人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法及染色體標(biāo)本制備的方法。 實驗原理 人體的1ml外周血中約含有1×1063×106個小淋巴細(xì)胞，它們幾乎都處于G0期或G1期，一般情況下是不分裂的。用人工離體培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)基中加入植物血球凝集素（PHA）能刺激小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞而進行有絲分裂。經(jīng)過短期的培養(yǎng)，秋水仙素處理，低滲和固定，就可獲得大量的中期有絲分裂細(xì)胞。實驗儀器、材料

49、和用具（一）儀器、用具 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、天平、離心機、顯微鏡、離心管、試管架、2ml 注射器、吸管、量筒、培養(yǎng)瓶、燒杯、試劑瓶、酒精燈、載玻片、切片盒 （二）材料 人外周血 （三）試劑 1RPMI “1640”培養(yǎng)基， DMEM培養(yǎng)基 2肝素：作為抗凝劑使用。稱取該粉末160mg（每毫克含126單位），用40ml 生理鹽水溶解，即500單位/ml，8磅15分鐘滅菌。 3秋水仙素：稱取秋水仙素2mg ，用50ml 生理鹽水溶解，6號細(xì)菌漏斗過濾，4冰箱保存。使用時終濃度0.40.8g /ml。 4PHA： 每毫升培養(yǎng)液加入100200g PHA粉劑，1000ml培養(yǎng)液加入10

50、0200mg 。 5雙抗： 青霉素 取4ml 生理鹽水稀釋40萬單位，吸1ml 到1000ml 培養(yǎng)基中，終濃度為100單位/ml。 鏈霉素 取10ml 生理鹽水稀釋100萬單位，吸1ml 到1000ml 培養(yǎng)基中，終濃度為100單位/ml。 6小牛血清 7Carnoy固定液（甲醇冰醋酸=31） 81/15mol/L磷酸緩沖液（pH7.4） 9Giemsa染液 方法與步驟 1采血 用2ml滅菌注射器吸取肝素濕潤管壁，然后用碘酒和酒精消毒皮膚，從肘靜脈采血12ml ，在酒精燈火焰旁，自橡皮塞向培養(yǎng)瓶內(nèi)（內(nèi)含有生長培養(yǎng)基5ml ）接種全血0.3ml 左右，輕輕搖勻。 3培養(yǎng)：置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66

51、72小時，終止培養(yǎng)前34小時，用注射器向培養(yǎng)物中加入秋水仙素，最終濃度0.40.8 g/ml 。 4收集細(xì)胞：將培養(yǎng)72小時并經(jīng)秋水仙素處理的培養(yǎng)瓶由溫箱取出，用吸管將貼在瓶壁上的細(xì)胞沖散均勻，并移到刻度離心管中。 51000rpm/min離心8min，用吸管吸棄上清液。 6低滲：向離心管中加入6ml蒸餾水或0.075mol/L KCl，用吸管吹打均勻，置37溫箱內(nèi)低滲20 min，使紅細(xì)胞破裂，白細(xì)胞膨脹。 7低滲后沿管璧慢慢加入1ml 新配的固定液，吹打均勻，立即以1000rpm/min離心8min，吸棄上清液。 8固定：沿管壁慢慢加入6ml固定液，用吸管吹打均勻，固定20min。以100

52、0rpm/min離心8min，棄上清液。 9重復(fù)步驟8的工作一次。 10制片：加入固定液0.5ml，吹打成細(xì)胞懸液，用滴管吸取細(xì)胞懸液，滴在預(yù)先經(jīng)4冰凍的干凈玻片上。每片滴1-2滴，用嘴輕輕吹散，在酒精燈火焰上微微烤干。 11染色：用Giemsa原液和磷酸緩沖液（pH6.8）按110 配成染色液，將所制成的玻片染色20min。微自來水沖洗，涼干。 12鏡檢：在顯微鏡下尋找染色體分散適宜，不重疊，長度適中，形態(tài)清晰的分裂相，然后在油鏡下仔細(xì)觀察染色體的形態(tài)和數(shù)目。選擇有代表性的分裂相進行顯微攝影以供做核型等進一步的分析。 注意事項1PHA的質(zhì)量是人體淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。效價低或用量不足，則培

53、養(yǎng)效果差，但濃度過大，紅細(xì)胞凝固，會影響細(xì)胞生長。 2采血接種時注意不要加入太多的肝素。因為肝素過多可能引致溶血和抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和分裂。 3接種的血樣愈新鮮愈好，避免保存時間過久影響細(xì)胞的活力。 4秋水仙素處理的濃度和時間、離心的轉(zhuǎn)速、低滲處理是影響染色體標(biāo)本制備質(zhì)量的關(guān)鍵因素。 實驗報告1培養(yǎng)基中添加PHA和小牛血清的作用是什么？ 2在制片中如低滲不足或低滲過度會出現(xiàn)什么問題？ 3哪些因素會影響制片中染色體的分散？4. 繪出人體染色體核型圖。實驗十 組織切片制作法實驗?zāi)康?通過對材料的固定、脫水透明、浸蠟、包埋、切片等實驗操作，了解石蠟切片的基本過程，掌握石蠟切片的制作方法。實驗原理 顯微

54、標(biāo)本的制作技術(shù)是組織學(xué)、胚胎學(xué)、生理學(xué)及細(xì)胞學(xué)等學(xué)科研究觀察細(xì)胞、組織的生理、病理形態(tài)的一種主要方法。組織經(jīng)過固定、脫水、透明、包埋等步驟后就可把材料切成較薄的片子，用不同的的染色方法可顯示不同組織細(xì)胞的形態(tài)及其中某些化學(xué)成分含量的變化，可在顯微鏡下清楚觀察到。實驗儀器、材料和用具（一）儀器、用具 小標(biāo)本瓶，指管，眼科鑷子，蠟杯，載玻片，毛筆，蠟鏟，刀片，量筒（10）毫升，漏，滴管，酒精燈，小木塊，切片木框，切片盒，吸水紙，標(biāo)簽紙，切片刀，熔蠟箱，展片臺，真空泵，解剖針。 器皿的清洗 切片所用的載玻片必須洗得很干凈，否則切片容易脫落。新的載玻片用洗液浸泡半天取出，用自來水沖洗后，用紗布擦干凈，放入盒內(nèi)備用。擦拭時應(yīng)捏住玻片兩端的邊緣操作，手指勿與玻片的表面接觸，以免手指上的脂肪沾污玻片。蓋玻片的擦洗 新的蓋片可放入95%酒精內(nèi)浸泡數(shù)十分鐘，或用洗液浸泡。注意蓋片要一片片投入，使蓋片的二面都接觸到液體，浸泡后，水沖洗干凈后再放入95%酒精中浸泡，然后用干凈白布擦拭。擦拭時應(yīng)注意，手指不能接觸玻面，應(yīng)以左手拇指和食指夾持蓋片，右持布趁酒精未干時，一一擦拭之。（二）實驗試劑 70%、85%、95%、100%的