γIFN對(duì)增生性瘢痕中TGF-β影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文瘢痕中tgf-p影響的實(shí)驗(yàn)研宄 姓名：唐明睿h靑學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：外科學(xué)階導(dǎo)教師：薛寶升2002.3.1中文摘要丄刖'(瘢痕是組織進(jìn)行修復(fù)后的產(chǎn)物，瘢痕一方面影響外觀，瘢痕聾 縮述可以造成關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙，給人們生活帶來極大不便。燒傷后 的瘢痕多為增生性，于創(chuàng)面愈合6個(gè)月后生長(zhǎng)達(dá)到高峰。研究己 經(jīng)證明，瘢痕的增生攣縮程度與很多因素有關(guān)，而主要是與瘢痕中 成纖維細(xì)胞不成比例增加，膠原的過度沉積有關(guān)。而許多細(xì)胞因 子對(duì)瘢痕的增生攣縮起到一定的作用，其中研究最多的是轉(zhuǎn)化生 長(zhǎng)因子b (tgf p ),它可以通過各種作用促進(jìn)瘢痕的增生 它的含量高低與瘢痕的增生程度直接成正

2、比。而1干擾素(1 i fn)卻是一種對(duì)瘢痕增生起到負(fù)性作用的細(xì)胞因子，和b的作用完全相反。了本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法觀察一、/ i fnx痕中tgf_b的影響，從而進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)瘢痕的抑制作用，: 尋找其存在這種作用時(shí)的合適濃度。本實(shí)驗(yàn)選用于我院行瘢痕整形手術(shù)的病人共1 0例，其中男 例，女2例，平均年齡為3 2歲?；颊唏：蹫閭蟀肽甑?年，j 于正常皮膚，質(zhì)地堅(jiān)硬，無充血紅腫及破潰，瘢痕自形成后未均采 取任何物理及化學(xué)治療方法。術(shù)中將瘢痕切除后，將瘢痕組織保 存于低溫冰箱中（一8 0。c），待實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)方法將瘢痕組織進(jìn)行消毒處理后，消化掉其中的其它成分，僅保留 其中的成纖維細(xì)胞進(jìn)行原

3、代培養(yǎng)，傳一代后取相同數(shù)量的成纖維 細(xì)胞再次進(jìn)行培養(yǎng)，而此時(shí)培養(yǎng)液中含有濃度不同的一/ i fn， 分別為 ou/ml，10u/ml，100u/ml 以及 1000u/ml.劑盒測(cè)出培養(yǎng)后的tgf1 3數(shù)值，并對(duì)各組間數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)i 析，從中觀察，/ i fn是否對(duì)tgf一b存在抑制作用，同曰 作用的合適濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組間數(shù)值進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析，可以發(fā)現(xiàn)，含一、/ ifni ou/ml與ou/ml乙間，并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而1 ( 組，1 0 0 0 u / m 1組與ou/ml組之間存在著明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)達(dá) 組數(shù)值問卻不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。瘢痕是皮膚不良修復(fù)以后的產(chǎn)物。瘢痕增生攣縮的程度和

4、許 多因素有關(guān)，其中主要的是與膠原的代謝失衡有關(guān)。在增生性瘢痕中，膠原合成明顯增加，同時(shí)膠原酶含量減少，降解明顯減慢。iii型膠原比例也有所上升。瘢痕攣縮程度則與肌成纖維細(xì)胞數(shù)量的增加有著直接聯(lián)系，另外，瘢痕的增生還與細(xì)胞外基質(zhì)的變化有 著密切的聯(lián)系。tgf13正是在這些方面對(duì)瘢痕的增生攣締重要的作用。首先，它可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞數(shù)量的增加，還可以使成纖維細(xì)胞分泌膠原的量增加，通過抑制膠原酶的作用來使膠原華解速度減慢，從而對(duì)瘢痕的增生起到明顯的促進(jìn)作用。其次， rgf8還可以誘導(dǎo)0 r .平滑肌肌動(dòng)蛋白在成纖維細(xì)胞中的表j 豈成肌成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增加，導(dǎo)致瘢痕攣縮。最后，tgf一 五可以通過刺

5、激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，延緩其更新速度，使 交原降解減慢。在增生性瘢痕中，tgf一b的含量都有明顯增高 中且它的含量與瘢痕的增生程度成正比。因此，tgf一b對(duì)瘢 的增生攣縮起著非常重要的作用，如果在瘢痕增生早期應(yīng)用它的 和和抗體或者降低活性t g f b水平，將是治療瘢痕增生的關(guān)鍵。7 1 fn是一種對(duì)瘢痕起到抑制作用的細(xì)胞因子。它對(duì)成纖維; 包的分裂增殖以及膠原合成都有一定抑制作用，同時(shí)還能減少膠 氧沉積。，'，/ i fn同時(shí)能夠減少瘢痕組織中肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量， 而減輕瘢痕攣縮。在過度增生的瘢痕組織中，1 i fn的含量偏低 曲此可見，y i ?1和丁0?_?對(duì)增生性瘢痕有著

6、幾乎相反的1 權(quán)實(shí)驗(yàn)正是基于這種原因，觀察啦f n對(duì)t g f b的影響情況。在本實(shí)驗(yàn)中，首先去處瘢痕中的其它成分，僅保留成纖維細(xì)胞生行培養(yǎng)，傳一代后，取基本等量的成纖維細(xì)胞再次進(jìn)行培養(yǎng)，此 寸培養(yǎng)液中含有不同濃度的'y i fn,觀察培養(yǎng)后的tc_f_ >從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，含有5，ifn10u/ml與ou/m34斤后po. 0 5，統(tǒng)計(jì)學(xué)上并無明顯差異，而含有5，ifn1 1 0 0 0 u / m 1組與0 u / m 1組相比，p < 0 . 0 1，統(tǒng)計(jì)學(xué)上巧苛這兩組間p0. 0 5，也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此我們可以看!1 _00u/ml和100011/1111的/

7、，/ if n對(duì)增生性瘢痕中tgf討亢作用，也正是由此對(duì)瘢痕的增生攣縮起到抑制作用，而這兩種 良度之間的拮抗作用卻沒有差別，因此可以認(rèn)為1 0 0 u/m 1的一 備這種作用的合適劑量一1 . y i fn是一種可以有效抑制增生性瘢痕中tgf 細(xì)胞因子，從而進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)瘢痕增生以及攣縮的抑制作用。 在治療瘢痕時(shí)可以起到明顯的作用。2 . 1 0 0 u / ml濃度的1 / i fn是這種抑制作用最有了 以在最小毒性的作用下發(fā)揮其最大的治療效果。關(guān)鍵詞：z，/ i fn； tgf-1 3；瘢痕j糟生i攣締ntlcsr番at-202aoneu <fniehtfoydus <atvn

8、em repxenorefre 11oj11rotcafhtworgtcartsbaecaferpcneunns l±dehtntnrubogn ixmrofsnartiaclcsgn 11r 11ap6reucjs 1ixipioa ssoa拳h(huán)sa* <precu1qorpehco邐 racs1aclocoac rs aatotcartn e or c uhtn <ksplonevnocnuehgn 11rb < 11wc rs aosgn - <vom vn o 1jf-ofients after heal i n g. most ofs cthea r

9、after burning is hy a . itgrows to the spike in 6 months after heal ing.many studi c e s provethe degree of hyperplas contrat of sc is c onne c ted°j h hu r ea ri ay agents and the important is the u np roport ional incmostbroblast and the super deposition of col lagen.many c y a 1 ln t o k i n

10、 efluence the hyperplasia cntract of s c a r and the most i ru r eandis transforming growth facto p (tgf b ) them.itcan stin rinh v d e r d 1 a s icontract of s c a r in many ways.ltj e hu r eais indirect ratio to the degree of hyperplasia. and 7 i n t e c y t o kine that has negative influe t0 hype

11、rplasia o sc a n has t h op a rneefeuc- iecsuenem 11re ep wx，e t眷r<nt1floecneupin 11evresposite action tgf p . tosdmetho tob參1nhypep1as1aoscar. wecould prove tile inhibition action of 7 i fnc f i n d 出 eanproper concenrat ion of t 1 i smaterialswe select 10 patients includi men and 2 w and omensc

12、 is froma re rti <ilpiasraey2otv5參aun g 8mean age is 32 years 0 d. t h ering. the scaris higher and harder than normal ski n ron. it i ss w e 1 1 in and ulcer.and then e have been treated with physi °v egyr calchemical method. when the scaris resected, t h r v e d inlow t emp e r a t refrige

13、rator (80 °c).u r emethodssea are d i g e s t e tor sremove tcomponens and rese ther v efibroblast to u n d e r t aonlyculturejejtile primary culture is finishe d w ehe s a i n eher of fihrohlasoundertake culture again. tharerecent rat io of, /ifn (ou/rnl，10u/rnl，1 0 ou/iid, looou/moin tculture

14、 fluid. wllen this culture i s finished, we fetenaidto deteche concentration of tgf b with elis 1a methodtile values ar analyzed statisticsy. then we can know wehas th inhibiting act ion to 7 ib f b and the erat ion ofproifn witll tllis action.resultse e xtp e r i me nr hdknow that the r e i sstatis

15、tical1 y/ml group and ou/mloou/ml， 1000udifference be tween 1 0 u here iso b vious statistical difference betweandou/ml group. but there - statistical difference bettwoisgroups scar is the dys repairing product of skin.t hype r plasia an contract of s c a r is connecte to m any facto du redmost impo

16、rtant is connected with the dise q u i 11 a g e n me t a b o 1 i s m. i n hyperplasia s c a r , the synthesis of col a s e dand the amount of col 1 a g e n a decreased。at tile same time, thra es e l st i 0iii t y p collagen is increased. the degree of contra s cee t u r e 0 fis connected with the n

17、u m b e ffly o f i b r 0 b h s t, th ehyperplasia o s er o ffis also connecte with the change of e x t r cellular ma t r i x daplay very important role in the hyperplasia of sc many ways.first, it cai increase tile number of fibr 1 a s tto secrecolhgen. italso ? a 1 decreat e1on ofcollagen throush i

18、nhibiting the $ction 0 c late hyperplasia o sc obv i ous 1 yexpression of number ofe theotsoom山museo b 1 a n d sts e theo 1 1 a g e.secot i m u 1 a t espeed of dn a s e . s o i tn d，t g f bn in f i b r o b sa <bmb 11piovjm1qnaips 11racsfotcartn e or c udesaercn 11ebd 秦uowxlacjquamrauecrtxeacudorp

19、 eoxiilqu3idor1d llpieilai um cjnacarenesedehtdeeps* 春aw6nercoll 11ya> ednarvqgnvcepsocj 冬qucjpiode1 i e v e d. in hyperplasia sea，theamountof t g f k 8 is inc 1 r ra repyhfoeergedehocer碥 1qcj 11nuomnacotl 11dnavj <su o i 1±eornou vrlaunrm番 annflcacwnacrlaupnahvrlact1rloupvcjperplasia anc

20、ontractofscar. ii w cail t s theneutralize antu r ee1e ddbody oftgf o reduce the level of acti tgf p , it is the r v ep condnrrenurv*1nn 1111aertpioxln <op gifn is a k i n d of cytokine tllat could inhibit scar. i a r tthe segmentation and proliferation of fibroblast a sis oftissue. so it c ahype

21、rplasia s e a 1 ncollagen.lt a 1 s o a n reduce the generation c o 1 1 a g en. 1 ofd u e e the number of myofibmbl scar a s t inedegree of hyperplasia of s c a r. in f 7 i f nswoll1qnna pqtlxlahxlwon n k ft g f havetheaction to hyperplasi 8 e r r. we observe the influence of,/ito t afnp in this expe

22、riment through t reason, hisin this experiment, we r e f eve the other compon e n t s inonlyhe f i b r o b1 a s0 undertake culture. after phenumber of fibmbl to undertake culture aga i n a s there is different concentration of 1 if the culture f 1tile value of tgf 8 after cul e. wenow that there ist

23、atistical difference be tween lou/ml group aroup. andthere is obvious statistical die r e n c e between 100mlgroups and ou/1 i 1 1 group. b ua t i s t i c a 1 differenishese t w o- r n n c q n cai drawgroups. so ,o1w eh thethe conclusion t h a 1concentration of 1 0 0 u / i i 1 1 and looou/ml i an t

24、a goii i s t t s t h ein hyperplasia s c a r . s 0 icaninhibit h y p o r p1 a s i a a rs c a r . but there is no diffefence between these t wwe can say the concentration of loou/ml is the proper conre, on.1.啊fna kind of cytokine t h ati n h i b i ofthe ext g f bsearact ion tohyperplasia and contract

25、uimportant role in the treatment 8car.of2.1/ifn wi th the concentration of loou/ml i dosageof this inhibiting action. i c a bring into the best treatment a cntionthe minimus toxicity.key words： 1/ifn; tgf b ； scar； hyperplasi re英文縮略語t g f bp d g ff g ft n f儀transforming growth fact p orderivedf i b

26、r o b 1 a sgrowgrowth f a ct h facto rtumor necrosis f a c o t tortoreghepidermal/ i f n一/intefferoni l1n t e r 1 e u k ie u s aen z y m e 1e d 7 i z aayninkedethylene diamine tetraace瘢痕是組織修復(fù)后的產(chǎn)物，瘢痕既影響皮膚外觀，關(guān)節(jié)周圍的 瘢痕攣縮還可以明顯限制關(guān)節(jié)活動(dòng)，給生活造成極大不便。燒傷 后的瘢痕多為增生性，增生性瘢痕于創(chuàng)面愈合6個(gè)月左右生長(zhǎng)i 到高峰，此過程一般需6 2 4個(gè)月，少數(shù)可以更長(zhǎng)。研究已彥

27、明，瘢痕的過度增生主要是由于病變部位成纖維細(xì)胞不成比例增 加，膠原過量沉積引起。近年來細(xì)胞因子的研究和發(fā)展為增生 性瘢痕的臨床治療提供了薪的方法，多種細(xì)胞因子和瘢痕形成有著密切的關(guān)系。其中包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b （tgf b），&/生長(zhǎng)因子（pdgf），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fgf），腫jtnf僅），表皮生長(zhǎng)因子（egf），1干擾素（一/ i f 素一 1 （ i l 一 1 ）等等b】。而t g f_b是目前被認(rèn)為是與; 最為密切的一種細(xì)胞因子，它可以明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖與膠原合成，它的含量高低與瘢痕的增生程度呈正比p j。而一/i 被認(rèn)為是對(duì)瘢痕增生起到明顯抑制作用的一種細(xì)胞因子，但是

28、它 的抑制作用尚無確切的理論根據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)瘢痕中的成纖維 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用el i s a法測(cè)定增生性瘢痕中成纖維細(xì)月的tgf_b在應(yīng)用tzfn后的變化情況，同時(shí)尋找 增生的合適劑量，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)增生性瘢痕的抑制作用。實(shí)驗(yàn)材料一、病例來源選取2 0 0 1年6月至2 0 0 1年1 2月在中國醫(yī)科醫(yī)院燒傷科因?yàn)轳：墼錾惺中g(shù)切除瘢痕的病人，共10例。 中男8例，女2例，年齡由7歲至5 4歲，平均年齡3 2歲。痕為傷后半年至2年不等，均高出正常皮膚，質(zhì)地較硬，無明顯7 血及紅腫，無破潰，瘢痕自形成后未采取任何物理及化學(xué)治療方 法。術(shù)后病理檢查證實(shí)為瘢痕組織。標(biāo)本的留取和處理術(shù)中將瘢痕完

29、全切除后，部分常規(guī)病理送檢，其余整塊瘢痕組織保存于一 8 0 0 c低溫冰箱中，待實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)用。、材料和儀器1 ）胰蛋白酶（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)業(yè)開發(fā)公司）2 ） e d t a消化液（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)業(yè)開發(fā)公司）3 ） dmem培養(yǎng)基（g i b c o生物技術(shù)發(fā)展中4 ）胎牛血清（t b d生物技術(shù)發(fā)展中心）（5） 1干擾素（上?？寺∩镏破饭荆?. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定試劑盒（上海森雄禾 實(shí)業(yè)有限公司）3. 普通離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠tgl1 6 g 4 .恒溫水浴箱（d i i w 6 0 0二氧化碳培養(yǎng)箱（nu 45 0 0e）6.biorad5 5 0型酶標(biāo)儀7 .深低溫冰箱

30、8 0 °c c )8 .倒置顯微鏡（h k 4 09 .無菌臺(tái)實(shí)驗(yàn)方法、進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)1 .將冷凍的瘢痕組織塊放入含有青霉素1 0 0 0 u/m1 i素1 0 0 0 u /m 1的生理鹽水中于3 7 0 c的水浴中解凍，把2. 將解凍的組織塊浸泡于碘伏溶液中3 0分鐘，充分消毒。3 .以生理鹽水沖去瘢痕塊表面碘伏，去處表皮，用組織剪刀:其剪成1 mm3大小的小塊，用dmem培養(yǎng)基反復(fù)沖洗3沖洗液，將其加入含0. 2 5 %胰蛋白酶的edta消化液中 于3 7 °c的恒溫水域箱中消化3 0分鐘。4. 取出消化液中的組織塊，見組織塊邊緣己經(jīng)被消化為毛）狀，加入d mem

31、培養(yǎng)基終止消化，將上面的液體加入離心管4行1 0 0 0轉(zhuǎn)/分的離心2 0分鐘。5. 棄去上清液，應(yīng)用含1 0 %胎牛血清的d mem培養(yǎng);打后，將培養(yǎng)液置于培養(yǎng)瓶中準(zhǔn)備開始培養(yǎng)。6. 將培養(yǎng)瓶放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，半小時(shí)后在1置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞，此時(shí)見細(xì)胞已長(zhǎng)成棱形，同時(shí)有些細(xì)朋 已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)。7 .細(xì)胞培養(yǎng)2 4小時(shí)后再次觀察培養(yǎng)細(xì)胞，見大部分細(xì)胞i貼壁或變成長(zhǎng)棱形，有的細(xì)胞見分裂方式，換生長(zhǎng)液一次。4 s 時(shí)后觀察見細(xì)胞分裂增生旺盛，己基本接近滿層。72小時(shí)后見 胞已鋪滿培養(yǎng)瓶底部全層，細(xì)胞總數(shù)約為2x1 0 5個(gè)，同時(shí)未見 及細(xì)菌生長(zhǎng)。此時(shí)成纖維細(xì)胞己經(jīng)傳一代，待下步實(shí)驗(yàn)應(yīng)

32、用。二、加入1干擾素的細(xì)胞培養(yǎng)1. 應(yīng)用含0. 2 5 %胰蛋白酶的e d ta消化液對(duì)長(zhǎng)訪給予消化約1分鐘，見其邊緣變?yōu)槊Ａ睿瑮壢ハ?。使?1 0 %胎牛血清的8 r a 1 dmem.培養(yǎng)液充分吹打后，將其自 各取2 m l吹打液置于培養(yǎng)瓶中顯微鏡下觀察見單個(gè)視野中自 數(shù)大致相等，而培養(yǎng)瓶中除含有等量的培養(yǎng)液外，分別含有不同濃 度的，/ ifn，濃度分別為 ou/ml，1 ou/ml, 1 0 0 u / m 1 以及 1 0 0 0 u /2. 將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，半小時(shí)后于倒j 顯微鏡下觀察見部分細(xì)胞已經(jīng)開始貼壁，有的變?yōu)槔庑巍? 4小后觀察見大部細(xì)胞已經(jīng)貼壁，

33、部分細(xì)胞開始分裂增長(zhǎng)，加入'干擾 素組未見明顯抑制現(xiàn)象。4 8小時(shí)后觀察見加入1干擾素0 u /r1 0 u / r r d組細(xì)胞增生較旺盛，已接近全層，而1 0 0 u / m 1和1 0 0組細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯3. 7 2小時(shí)后觀察見前兩組細(xì)胞基本已長(zhǎng)成全層，而后兩組會(huì)胞尚未完全長(zhǎng)滿全層，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯較前兩組慢4 .分別應(yīng)用等量含o. 2 5 %胰蛋白酶的e d ta消化液胞，加入離心管中給予離心，取上清液準(zhǔn)備測(cè)量tgf一b。t g f_b的測(cè)定1 .標(biāo)本激活：取1 5 0 上清液及12 6 稀釋液加入到 丙烯管中，再加入2 0m1& hcl，蓋緊，上下混

34、勻，放置60分!再加入2g“l(fā)1naoh，蓋緊，上下混勻，準(zhǔn)備開始檢測(cè)。2 .檢測(cè)程序：(1 )建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔加入樣品稀釋 1 0 0出，第一孔加入標(biāo)準(zhǔn)品1 0 0 ，混勻后吸出1 0 0山，以至鄉(xiāng)如此反復(fù)做對(duì)倍稀釋至第七孔，最后，從第七空孔吸出1 0 0止爹 去，使之體積為1 0 0 m。第八孔為空白對(duì)照。(2 )待測(cè)品孔每孔加入已激活的待測(cè)品1 0 0以。(3 )將反應(yīng)板置于3 7 0 c 1 2 0分鐘后，用洗浲液將反 冼滌6次，向?yàn)V紙上印干。(4 )向反應(yīng)板每孔中加入第一抗體工作葉5 0山，將反應(yīng)相 分混勻后置3 7 ” c 6 0分鐘后，用洗滌液再充分洗滌6次，向勿

35、印干。5)向反應(yīng)板每孔中加入酶標(biāo)抗體工作液1 0 0 “，將反應(yīng)相3 7。c 6 0分鐘，再用洗滌液充分洗滌反應(yīng)板6次，向?yàn)V紙上印干。6)反應(yīng)板每孔中加入底物工作液1 0 0出，置3 7。c暗: 1 0分鐘，然后每孔中加入1滴終止液混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀zi 9 2 nm處測(cè)吸光值。1在半對(duì)數(shù)紙上作3 -結(jié)果計(jì)算：將測(cè)得的吸光值減去空白值，以標(biāo)準(zhǔn)品2 01 0 0 0、5 0 0、2 5 0、1 2 5、6 2. 5、3 2、0 pg準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品吸光值于曲線圖上查出相應(yīng)的tgf1 3再將此數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)，即為待測(cè)標(biāo)本中tgf13的準(zhǔn)確四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：對(duì)應(yīng)用1ifn ou/ml, 1 0 u /

36、m 11 o 0 0 u /m 1后所測(cè)得的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1 3值各組分別進(jìn)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用一，/ i ?1后丁0?一：6值的變化情況二、各組問方差統(tǒng)計(jì)分析：第1，2組間p0. 0 5，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第1，3組問p<0. 0 1，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 第1， 4組闖p<0. 01，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 第2， 3組間p<0. 01，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 第2，4組間p < 0 . 0 1，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 第3，4組問po. 0 5,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異瘢痕是皮膚不良修復(fù)以后的產(chǎn)物，般說來，深ii度和iii度燒傷創(chuàng)面愈合后均會(huì)形成瘢痕，大部分為增生性瘢痕，而其增生以及 挈縮程度與很多因

37、素有關(guān)。其中主要和膠原的代謝失平衡有關(guān)， 正常皮膚中大部分為i型和iii型膠原，iii型膠原占2 5 %,在增j性瘢痕中，成纖維細(xì)胞合成和分泌膠原的能力都增強(qiáng)，膠原合成量 是成熟期瘢痕的2倍，iii型膠原的量也增至3 3 %h o。瘢痕組彙狡原合成和降解都增加，但膠原合成超過降解，使其過度沉著。膠 原降解主要由膠原酶控制，燒傷病人血清中膠原酶水平下降，同時(shí) 有抗體存在，直接影響膠原降解 1。瘢痕攣縮與肌成纖維細(xì)胞有著密切的聯(lián)系，成纖維細(xì)胞增生分化為收縮表型，逐漸獲得表達(dá)a平滑肌肌動(dòng)蛋白能力，即為肌成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞是創(chuàng)面收縮的動(dòng)力細(xì)胞，是引起瘢痕攣縮的主要因素，它的長(zhǎng)期存在導(dǎo)致瘢痕進(jìn)行性收縮，

38、隨著瘢痕的成熱，e的數(shù)量逐漸減少直至消失mj。另外 細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化與瘢痕增生也有著密切的關(guān)系，在瘢痕增 主過程中由成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞時(shí)基質(zhì)成分發(fā)生了改 變，原來僅微量的硫酸軟骨素a和硫酸角質(zhì)素一 4含量顯著增加，區(qū)些蛋白多糖質(zhì)地硬，沉積于膠原團(tuán)塊周圍使瘢痕變僵硬。這些 隆質(zhì)在膠原團(tuán)塊外形成一道屏障，阻礙膠原酶對(duì)膠原的降解。瘢 茛成熟后，蛋白多糖成分又回到以硫酸軟骨素b和硫酸角質(zhì)素為 主的狀態(tài)，瘢痕隨之變?nèi)彳?quot;1。以上幾種作用方式促進(jìn)瘢痕增生 挈縮，是燒傷后瘢痕增生性瘢痕產(chǎn)生的基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b (tgf b)是目前已知與瘢痕形成關(guān)f刃，最具代表性的一種細(xì)胞因子，它在

39、損傷、炎癥以及纖維化之間s著連接作用1。血小板在受損組織脫顆粒而釋放t g f 一 b，t損組織中tgf一b的最初來源，它的自身誘導(dǎo)作用可使激活巨噬細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞、增殖的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)tg b同時(shí)加強(qiáng)并延長(zhǎng)tgf 一 b的作用p。這使創(chuàng)面基質(zhì)中、 的tgf8,它一方面對(duì)創(chuàng)面修復(fù)起著積極作用，更重要的是 各個(gè)方面均對(duì)瘢痕的增生及攣縮都起著非常重要的作用。t g f b共分三個(gè)亞型，其中起主要作用的是tgf8，而其中所1首先，ttgf b,對(duì)tgf一b。具有一定拮抗作用"0面促進(jìn)成纖維細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量增加，還可以直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞啟 成膠原量的增加，增加iii型膠原比例，同時(shí)還抑

40、制膠原酶的作用，使膠原的降解速度簡(jiǎn)慢，對(duì)瘢痕的增生起到明顯的促進(jìn)作用"ln】。其次，tgf b可以誘導(dǎo)q平滑肌肌動(dòng)蛋自在成胞中的表達(dá)，促使成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肌成纖維 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，促進(jìn)瘢痕攣縮最后，tgf 8還可以刺: 成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，延緩細(xì)胞外基質(zhì)更新，使膠原降解減 慢' 人們己經(jīng)發(fā)現(xiàn)，tgf一b的水平與許多纖維化疾病有很 相關(guān)性，在肝硬化、肺間質(zhì)纖維化、腎小球腎炎、硬皮病及腦部、視網(wǎng)膜瘢痕、燒傷后增生性瘢痕中，tgf一b量都有顯著增加"”。 多實(shí)驗(yàn)也己證明，tgfb的表達(dá)程度與瘢痕的增生程度 比1。由此可見，t g f一b對(duì)瘢痕的增

41、生攣縮起著非常重要白、 用，因此在創(chuàng)傷早期應(yīng)用t g f b的中和抗體和使用降低 tgf_b水平的藥物，是防止瘢痕增生，減輕瘢痕攣縮的關(guān)鍵。1干擾素（一、/ i fn）是一種對(duì)瘢痕起到明顯抑制作用的 子，它是由激活的t淋巴細(xì)胞所分泌的，是一種重要的抗腫瘤，i 病毒的細(xì)胞因子。同時(shí)，/ i fn對(duì)成纖維細(xì)胞的分裂增殖以及 合成都有明顯的抑制作用，同時(shí)還能減少膠原沉積"6”0。亦有報(bào)道證明，硼限能夠減少瘢痕組織中肌成纖維細(xì)胞數(shù)量，減輕瘢瘸 攣縮"8. 19 1。而且在過度增生的瘢痕組織中，確實(shí)存在一 / i f: 的低下印j。我們可以看出，.y i fn和tgf b對(duì)增生性級(jí)

42、然相反的作用，因此可以推測(cè)一/ifn對(duì)tgf_p的合成和17-定的拮抗作用，同時(shí)國外已有報(bào)道證明tifn可以降低燒傷肩 tgf一b水平拉“。本實(shí)驗(yàn)正是基于這些原因，在對(duì)成纖維細(xì)胞 行培養(yǎng)后，觀察t i fn對(duì)tgf_b表達(dá)的影響作用。在實(shí)驗(yàn)中我們首先對(duì)瘢痕組織進(jìn)行消化，去除瘢痕中的其他組織，如結(jié)締組織、脂肪等等，僅保留成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在其傳一代后，取其中的基本相等的成纖維細(xì)胞再次進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此時(shí)的培養(yǎng)液中已經(jīng)含有了不同濃度的t i fn，我們可以發(fā)現(xiàn)，lifn100u/ml， 1000u/ml組細(xì)胞生長(zhǎng)速度己有 重點(diǎn)觀察了一y1fn對(duì)成纖維細(xì)胞表達(dá)的tgf一b的影響作用， 結(jié)果中，我們可

43、以看到，含有7 i fnou /m 1與含有t i fn 1 統(tǒng)計(jì)學(xué)上并無明顯差異，證明1 0 u / m 1的啦fn對(duì)瘢痕成纖彡 表達(dá)的tgf1 3并無抑制作用，而含有3 fifn100u/ml, 1組與ou/ r r d組具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明以上兩種含量的.、/ 對(duì)t g f一p可以起到明顯的拮抗作用，而兩組之間對(duì)t g f 抑制作用卻沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此我們可以看出，tifn一種可以有效抑制tgf1 3表達(dá)，從而抑制瘢痕增生攣縮的$因子，而1 0 0 u /ml濃度的一/ i fn是最合適的劑量。如何與臨床，治療增生性瘢痕將是今后研究的重點(diǎn)和方向之一。1 .1，if n是一種

44、可以有效抑制增生性瘢痕中t g f一細(xì)胞因子，從而進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)瘢痕增生以及攣縮的抑制作用。在治療瘢痕時(shí)可以起到明顯的作用。2.10 ou/ml濃度的一、/ i fn是這種抑制作用最有效的 以在最小毒性的作用下發(fā)揮其最大的治療效果。參考文南犬1 . dieglmanu r f et，a 1 . growth kinetics and thesis ofnormal skin，norms c and keloid fibroblasts i n v i t r o.a ra 1physiol； 98:3 4 1.2. 王文革，細(xì)胞因子與瘢痕形成機(jī)制的研究進(jìn)展。中華燒傷; 形外科雜志，1997，1

45、3 (2): 128 129。3. zhang k，etal.jinv dermatol，1995，104(5)e s t4. 盛志勇等，危重?zé)齻祻?fù)與治療學(xué)?？茖W(xué)出版社，2 0 0 0： 35. cohen l k，e t al.ke and hypertrophic seal ",1 o i dj geds.plasti surgery. philadelphia： w b s a c1 9 9 0.6. 尹清，肥厚性瘢痕膠原代謝研究進(jìn)展(一)。國外醫(yī)學(xué)( 醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)分冊(cè))，1999，19 (2): 191一193。7. i. , a 1 s o n dl，b a u r ps

46、 etal. mechani sm of hypertroph seri afi ccontracture formation in bum. burn, 1 9 7 5，1(2)78 . stocum dl. tissue restoration approaches a t s . woundrep reg 1996。4 :3 15.9. 謝舉臨，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子一b在創(chuàng)傷愈合過程中的研究進(jìn)展 國外醫(yī)學(xué)(創(chuàng)傷與外科基本問題分冊(cè))，1 9 9 9 ; 2 0 (2 ):10. 賈赤宇，tgf b,對(duì)瘢痕形成的影響。中華整形燒傷志，1 9 9 9，1 5 ( 1 ): 7 2 7 3.1 1 . overrall cm，e t a 1 . independent regulation of c roge latinase and m e t a 1 1 o endoproteinase inhibitor n hu mall fibroblasts by transforming gro factor b . j b w t h1989，2 6 4：1 8 6 0.1 2 . robens ab，e t a 1