G418篩選實(shí)驗(yàn)

1、G418篩選實(shí)驗(yàn)相關(guān)問題點(diǎn)擊次數(shù)： Jd 1011 作者：guodengjun12 zhaolifei sandy99 等發(fā)表于：2008-08-06 23:39 轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來自丁香園來源：丁香園問：G418篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做，選 10-14天內(nèi)細(xì)胞死 亡的最小濃度，然后將更高一級(jí)別的濃度應(yīng)用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 是這樣 嗎？答：G418是一種細(xì)胞毒性藥物（氨基糖苷類抗生素），依不同濃度，對(duì)細(xì)胞有一定的抑制或殺傷作用，而擬轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒上帶有G418的藥代酶，能降解G418，從而使細(xì)胞獲得對(duì)G418的耐藥性。也 就是說轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以耐受 G418，而未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞不能耐受 G418，因而被殺

2、滅或抑制。通過 G418篩選體系，使得未轉(zhuǎn)染成功 的細(xì)胞比例不斷減少，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞比例不斷增高。如果G418濃度太高則會(huì)殺傷所有的細(xì)胞，如果 G418濃度太低則沒有什么毒性， 兩種情況都不能起到篩選作用。G418篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)則是先用未轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞做，選14天內(nèi)細(xì)胞死亡的最小濃度應(yīng)用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，因?yàn)椴?同的細(xì)胞對(duì)G418的耐受性也不一樣，這樣的目的是找一個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 能耐受G418的工作濃度，從而為篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞打下基礎(chǔ)，因?yàn)檫@種濃度只能抑制未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 而不抑制轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的！從而起到篩選作用。 建議你再多查找一下國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)手之前一 定要明白其原理， 要不然會(huì)很盲目， 充分的

3、準(zhǔn)備可以避免走很多不必 要的彎路！問：第二次篩選要怎么做？答：第二次篩選就是將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞接種培養(yǎng)后，向培養(yǎng)液中加 入 G418 以殺傷或抑制其中的未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞， 因?yàn)椴还苻D(zhuǎn)染效率 多么高，都不可能是 100% ，所以要通過 G418 篩選體系（或者其他 篩選體系） 來篩掉那些沒有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 此時(shí)加入 G418 的濃度 可以略高于你第一次預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)摸索出來的 “最小有效濃度 ”，實(shí)驗(yàn)中可 以再根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行濃度的調(diào)整！問：第二次篩選是經(jīng)過第一次篩選以后，已經(jīng)篩選出一部分轉(zhuǎn)染 細(xì)胞了，但是因?yàn)橛行┘?xì)胞還是會(huì)丟失目的基因所以要得到穩(wěn)定表達(dá) 的細(xì)胞還要進(jìn)行 2-3 次篩選， 這時(shí)候還是

4、用原來預(yù)實(shí)驗(yàn)的濃度， 還是 要再提高一個(gè)濃度？答：你要在熒光顯微鏡下觀察一下，判斷一下細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率， 也就是轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的比例， 再根據(jù)情況選用或高或低的濃度！ 轉(zhuǎn) 染成功的細(xì)胞的比例越高，則加入 G418 的濃度就可以越低。問：我的質(zhì)粒上沒有熒光標(biāo)記，要等到篩選完了以后打動(dòng)物的， 那要怎么辦呢？答：可以用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)！問：做 G418 篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)濃度是不是要多弄幾個(gè)孔，還是 一個(gè)孔就行了？篩選的培養(yǎng)液是不是要用沒有雙抗的， 做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí) 必須用 DMEM 培養(yǎng)基嗎？答： 用什么培養(yǎng)基視你培養(yǎng)的細(xì)胞特性而定吧 不見得非用 DME M，一般設(shè)三個(gè)復(fù)孔就足以 各濃度3復(fù)孔，設(shè)正常對(duì)照

5、3復(fù)孔。以 10-14 天細(xì)胞全部死亡的濃度為篩選濃度。 由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之 后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。 所以篩選不能太早， 但是也不能太 晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增殖較慢，時(shí)間長(zhǎng)了 就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克 隆，一般要在轉(zhuǎn)染 24 h 之后才開始加 G418 篩選 。答： 每種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和速度不同，在一些細(xì)節(jié)處理上可能也 不同。我的是這樣做的：1、G418 篩選實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞，生長(zhǎng)較快，所以在 96 孔板中加 入100ul細(xì)胞（2000/ml），第二天就加入 G418 ,從0, 100 , 200 1000卩g/ml,

6、復(fù)3孔，每天觀察。前幾天，低濃度的孔中細(xì)胞生長(zhǎng)， 中濃度的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,高嘗濃度的不長(zhǎng),稀稀拉拉。約一周左右, 中濃度的孔中出現(xiàn)死細(xì)胞, 低濃度的死細(xì)胞較少, 未加 G418 的孔長(zhǎng) 得很密。14天時(shí)，觀察細(xì)胞全部死亡的最低濃度孔， 在500卩g/m, 做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)選用的600卩g/m。2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：24孔板，細(xì)胞密度也較小，轉(zhuǎn)染后第二天1 : 10稀釋 傳代，設(shè)立空白細(xì)胞對(duì)照組，第三天加 G418（600卩g/ml）。耐心等 待2周，前一周細(xì)胞死亡較少，后一周死細(xì)胞較多，可 3天換液，待 對(duì)照組里的細(xì)胞全部死亡，就可以開始挑單克隆了。http:/www.bio on .com/experim

7、e nt/sol/244209.shtmlG418通過干擾核糖體的功能而阻斷細(xì)胞的蛋白合成G418是一種氨基糖苷類抗生素，這種氨基糖類抗生素的結(jié)構(gòu)和新霉 素、慶大霉素、卡那霉素相似，在分子遺傳試驗(yàn)中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。它通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601 , Tn5的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括原生動(dòng)物和蠕蟲。當(dāng)neo基 因被整合進(jìn)真核細(xì)胞 DNA后，則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為 mRNA ,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G 418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。G 418的

8、這一 選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方 面得以廣泛應(yīng)用。G418使用方法 室溫下運(yùn)輸，干粉在室溫下儲(chǔ)存，溶于水、甲醇，溶 液于-20 C儲(chǔ)存 由于各真核細(xì)胞系對(duì) G418敏感度不同,各新細(xì)胞系 或株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)殺死非穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞所需用量需要通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。最適用量通過建立細(xì)胞死亡曲線獲得。將細(xì)胞稀釋至1000cell/ml，每 孔 100ul 加入有培養(yǎng)基的 24 孔板，將每孔中的 G418 濃度稀釋至 0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml 等 12 個(gè) 級(jí)別 , 培養(yǎng) 10-14 天，以最低細(xì)胞全部死

9、亡濃度為基準(zhǔn)， 一般 400-800 左右， 篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別， 維持時(shí)使用篩選濃度的一半即 可。G418 選擇濃度范圍細(xì)胞系或機(jī)體 G418 濃度( ug/ml )中國倉鼠卵巢細(xì)胞 700800Madin Darby 犬腎細(xì)胞 500人上皮 A431 細(xì)胞 400猿 CV-1 細(xì)胞 500盤基網(wǎng)柄菌屬 1035植物 10酵母 125 500G418質(zhì)量指標(biāo)G418 :白色粉末，融點(diǎn)138144 C,溶于水、甲醇。 CAS No.： 108321-42-2分子式 : C20H40N4O10 ?2H2SO4 分子量 : 692.71結(jié)構(gòu)式 :比旋：+104O+1210 水分：<

10、10% 吸光值：< 0.015(280nm,1mg/ml),< 0.1 (570nm, 100mg/ml)效價(jià)： >700 ug/mg儲(chǔ)運(yùn)室溫下運(yùn)輸，干粉在室溫下儲(chǔ)存，溶液于-20 C儲(chǔ)存。Q： G418 怎么配制？A:我覺得不能用水配，因?yàn)檫@樣 PH會(huì)變化很大，至少要用 PBS 我是配在HEPES溶液中的，具體方法如下：1g包裝的G418瓶子中， 加入10ml HEPES溶液，濃度為100 mg/ml完全溶解后，0.22 um過 濾，20度保存。HEPES緩沖液配方如下：90 ml水中，0.8 g NaCI, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H

11、2O, 0.1 g 葡萄糖， 0.5 g HEPES, 溶解，NaOH調(diào)PH至7.05,定容至100ml。Good answer:推薦用HEPES特別是當(dāng)細(xì)胞對(duì)G418不敏感，G418使用濃度高時(shí)， 如果用水、PBS配置，會(huì)極大的改變細(xì)胞培養(yǎng)基的 pH值，影響細(xì)胞 的生長(zhǎng)。1mol/L HEPES的簡(jiǎn)單配置：HEPES 11.91g，溶解于40ml 的 ddH2O，用 10mol/L 的 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.5-8.0，定容至 50ml, 0.22um小濾器過濾。HEPES最終使用濃度15-20mM。Q: 我想一步篩選出高拷貝整合的高表達(dá)的細(xì)胞克隆，如果我用很高 濃度的G418直接加

12、進(jìn)培養(yǎng)瓶直接篩選，這樣做可以嗎？我做過G418 殺傷曲線， 300ugml 就基本上可以殺死細(xì)胞， 我想直接用 1000ugml 來篩選，不知是否可行？會(huì)不會(huì)有什么問題？A: G418 篩選要做預(yù)試驗(yàn)確定最佳濃度，將細(xì)胞稀釋至 1000cell/ml ， 每孔 100ul 加入有培養(yǎng)基的 24 孔板，將每孔中的 G418 濃度稀釋至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等1 2個(gè)級(jí)別，培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般 400- 8 0 0左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別，維持使用篩選濃度 的一半

13、。G418 濃度太高也不好，會(huì)對(duì)細(xì)胞的損傷太大，影響增殖。我用過Zeocin，為了加速篩選，用了最低劑量的兩倍濃度，結(jié)果一個(gè)陽性克 隆都沒篩到，欲速則不達(dá)。Q: 我用 24 孔板做了 G418 篩選的濃度梯度，確定最低致死濃度為600mg/l 。我現(xiàn)在用這個(gè)濃度篩選我轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，我應(yīng)該保持這個(gè) 濃度多少天才能確保我篩選完成呢？在這期間可以換液?jiǎn)?？篩選完 了之后存活的細(xì)胞再培養(yǎng)傳代的話， 培養(yǎng)基中是否還應(yīng)該加一定濃度 的G418?如果要加的話什么濃度比較合適？A: 應(yīng)該保持這個(gè)濃度 9 天以上，每 3 天換液一次。篩選完了之后存活的細(xì)胞再培養(yǎng)傳代的話，培養(yǎng)基中應(yīng)該加一定濃度的G418, 般在最

14、低致死濃度的 60% 左右。Q: 在 6 孔板里進(jìn)行 NIH3T3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的 G418 篩選， 2 周后單克隆 形成 ， 于 是就挑 取 單 克 隆，之 前 6 孔板 里 的 細(xì) 胞 很多 ， 用 0.125%typsin+0.25%EDTA 消化， 1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘 ，肉眼 可以 看到細(xì)胞沉淀，接種至 25ml 塑料培養(yǎng)瓶中，鏡下看密度可以， 但是細(xì)胞形態(tài)成多態(tài)性：少量是圓形， 大多數(shù)是梭形。 第2 天一看沒 有細(xì)胞貼壁！做了 2 次都這樣，請(qǐng)問我的操作步驟有問題嗎？ A: 看了你的操作步驟， 個(gè)人觀點(diǎn)認(rèn)為你挑出來的不能稱之為單克隆， 在 6 孔板里用 G418 篩選兩周

15、后只是大部分細(xì)胞死亡， 少數(shù)細(xì)胞存活 并逐漸生長(zhǎng)，只能叫作克隆形成。我們一般在轉(zhuǎn)染后 24h 將細(xì)胞消化下來( 0.25%trypsin + 0.02%EDTA),以1: 10或更高的比例傳代，貼壁24h后加選擇性培 養(yǎng)基開始篩選。 待大部分細(xì)胞死亡， 極少數(shù)細(xì)胞漸形成克隆。再把這 些克隆經(jīng) 24 孔板、 6 孔板放大后再進(jìn)行單克隆化的操作(具體操作 方法見附件)。從嚴(yán)格意義上來講，單克隆化的操作一般要進(jìn)行 2-3 次，經(jīng)此操作后長(zhǎng)起來的才能稱之為單克隆。另外，在把克隆或單克 隆放大的過程中動(dòng)作一定要輕柔， 否則很容易出現(xiàn)你所說的細(xì)胞不貼 壁死亡的現(xiàn)象， 也可以在消化完用正常培養(yǎng)基， 待細(xì)胞貼

16、壁后再換為 含 G418 的培養(yǎng)基。還有，在多克隆形成后一定要及時(shí)凍存，以備后 續(xù)試驗(yàn)。你挑選的克隆，不能貼壁原因可能有二 ;一、細(xì)胞很少，那么你接種 后，由于密度較低， 細(xì)胞是接觸生長(zhǎng)， 所以密度太低， 細(xì)胞難以生存。 二、擬消化下來可能用 G418 篩選液篩選，這樣也會(huì)死亡。消化后先 用無 G418 的培養(yǎng)液培養(yǎng)，貼壁后，再換取 G428 培養(yǎng)液。Q:我想問怎樣的方法可以把陽性克隆從培養(yǎng)瓶中取下來， 書上說用彎 頭吸管， 我試了，不好用，根本就不能完整的吸取總個(gè)陽性克隆細(xì)胞下來，我想著用刮勺， 但進(jìn)口的特別貴，所需又不多，你看有什么別 的好辦法嗎？謝謝了！A: 如何挑選克隆。你可以按以下操

17、作方法進(jìn)行：【操作方法】（1）將已形成克隆的培養(yǎng)皿置于顯微鏡下觀察克隆位置，并將各個(gè) 克隆位置用標(biāo)記筆標(biāo)記準(zhǔn)確；（2）在超凈臺(tái)內(nèi)，棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液；（ 3）用鑷子夾取一塊濾紙塊， 用 0.25%Trypsin 消化液浸濕， 置于所 標(biāo)記克隆位置處， 5-20 秒；（有人可提前在一孔中裝入 0.02%EDTA PBS）（4）將 24 孔培養(yǎng)板每孔加 G418 選擇培養(yǎng)基 2ml ，用鑷子取出已黏 附克隆細(xì)胞的濾紙快，置于一個(gè)孔中的培養(yǎng)基中，涮洗濾紙塊數(shù)次， 以使黏附的細(xì)胞脫落下。 鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞已經(jīng)脫落后， 將濾紙塊取 出棄掉，其它克隆方法轉(zhuǎn)移同上；（有人在細(xì)胞貼壁后再選用培養(yǎng)基）（5）將

18、移有克隆細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)置37C 5%CO2培養(yǎng)箱培 養(yǎng)， 2-5 天；（ 6）待細(xì)胞長(zhǎng)滿后， 0.25%Trypsin 消化液消化，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 6 孔板繼續(xù)培養(yǎng)，或轉(zhuǎn)入多瓶中擴(kuò)增，此后可做進(jìn)一步鑒定工作。Q:用G418做HEp-2細(xì)胞的建系已經(jīng)有2個(gè)月了，已經(jīng)在細(xì)胞瓶中 擴(kuò)大培養(yǎng)，但發(fā)現(xiàn)與正常 HEp-2 細(xì)胞相比，建系的細(xì)胞生長(zhǎng)得很慢， 細(xì)胞間的邊界也不是很清楚， 而且細(xì)胞長(zhǎng)得不均勻， 這樣正常嗎？為 改變這一狀態(tài)，我該怎么做呢？謝謝！A: 基本算正常吧。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞據(jù)細(xì)胞種類不同其形態(tài)都較正常 細(xì)胞有變化，有的很明顯，比如說細(xì)胞變大， 生長(zhǎng)緩慢， 細(xì)胞界限不 明顯及細(xì)胞愛成

19、堆生長(zhǎng)等等； 有的則變化不明顯。 對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞，建議篩出單克隆后大量?jī)龃?。一方面防止?xì)胞回復(fù)， 因?yàn)槟戕D(zhuǎn)入 的質(zhì)粒對(duì)于細(xì)胞而言畢竟是個(gè)負(fù)擔(dān)，細(xì)胞較傾向于甩掉負(fù)擔(dān)輕裝前 進(jìn)，這一點(diǎn)對(duì)于腫瘤細(xì)胞尤甚；另一方面， 如果插入的質(zhì)粒明顯和細(xì) 胞周期有關(guān)的話， 這種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳不了幾代就會(huì)死亡。 在傳代 過程中， 也可以使用正常培養(yǎng)基， 但過一段時(shí)間一定要用維持劑量的 含 G418 的培養(yǎng)基壓一壓，以除去回復(fù)的細(xì)胞。1. G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾 水至 1 0m l ，過濾消毒， 4 度保存。2. 細(xì)胞培養(yǎng)：取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等

20、量接種入多孔 培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 6 小時(shí)左右開始加藥。3. 制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度， 比如先做個(gè) 100ug/ml 、 400ug/ml 、800ug/ml 、1000ug/ml ，按梯度 濃度用培養(yǎng)基稀釋 G418 制成篩選培養(yǎng)基。4. 加 G418 篩選:5. 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每35 天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同 4。6. 確定最佳篩選濃度：在篩選 1014 天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418 濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳 G418 濃度的 可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度 G418 的量在

21、篩選 14 天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的 G418 的量在 10 天前就看不到活細(xì)胞了。假如是 400ug/ml 不能殺死細(xì)胞，而 800ug/ml 在第 5 天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用 500ug/ml 、 600ug/ml 、700ug/ml 進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由 于特性明確的細(xì)胞系 G418 的最佳用量還是比較穩(wěn)定的， 所以有時(shí)候 不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染 NIH3T3 細(xì)胞 ， 現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過 NIH3T3 細(xì)胞對(duì) G418 的敏感性，我用的篩選 濃度是 200 ug/ml 。這時(shí)你就可以做 150ug/ml 、200ug/

22、ml 、 300ug/ml 三個(gè)濃度進(jìn)行篩選。 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 24 小時(shí)或者更長(zhǎng)，到細(xì)胞增長(zhǎng)接近匯合時(shí)按 1 ：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50 %70%匯合時(shí)；b加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的 G418 篩選培養(yǎng)基。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每 35 天更換一次篩 選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把 G418濃度減半維持篩選。 篩選 1014天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增 大后；d 挑單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到 1 個(gè)/10ul。在

23、96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孑L。 待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到 48 孔中增殖。e單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總 RNA,做RT-PCR檢測(cè)目的 基因是否存在。常見問題：1. 轉(zhuǎn)進(jìn)去的重組質(zhì)粒以什么形式存在于細(xì)胞內(nèi)的？ 無怪乎兩種形式： 整合在染色體中和存在于細(xì)胞質(zhì)中。 沒有經(jīng)過篩選 前大部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的， 但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn) 定的， 基本上篩選不出這種單克隆， 只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我 們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。2. neo 基因和目的基因是不是一定會(huì)整合在一起？整合是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達(dá)而目的基因不一定都 表達(dá)，所以在篩選之

24、后還要用 RT-PCR的方法進(jìn)一步鑒定。 培養(yǎng)基處理的個(gè)人技巧體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后， 對(duì)環(huán)境都有一個(gè)適應(yīng)過程， 期間 細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液具有同化作用， 即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時(shí)， 也 向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)， 其中有排泄物也有促 細(xì)胞生長(zhǎng)因子。 這個(gè)過程也是細(xì)胞同化培養(yǎng)基的過程。 細(xì)胞越多則其 同化作用越強(qiáng)， 所以細(xì)胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長(zhǎng)。在篩選后期，大 批細(xì)胞死亡， 不換液沒有死亡的細(xì)胞就會(huì)受到死亡細(xì)胞的影響， 換液 后殘留的少量細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)， 也不利于生長(zhǎng)。 我是用 適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的： 適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制 a培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)

25、，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)2448 小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心： 3000 4000rpm 10 min 后，吸取上清液c 慮過：再經(jīng)直徑 0.22um 濾器過濾，再加入 2 倍體積的新鮮培養(yǎng)基， 低溫凍存?zhèn)溆?。eeflying1. G418 篩選要做預(yù)試驗(yàn)確定最佳濃度，將細(xì)胞稀釋至 1000cell/mL ， 每孔 100uL 加入有培養(yǎng)基的 24 孔板，將每孔中的 G418 濃度稀釋至 0， 100， 200， 300， 400， 500， 600， 700 ， 800， 900， 1000， 1100ng/mL 等 12 個(gè)級(jí)別。培養(yǎng) 10-14 天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，

26、一 般 400-800 左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別， 維持使用篩選濃度 的一半。2 .我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因?yàn)橛袝r(shí)候抗性基因會(huì)丟失，如果沒有 G418，很快會(huì)形成優(yōu)勢(shì)的。3 .即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重 要的。轉(zhuǎn)染后， 每個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的， 目 的蛋白表達(dá)有的多， 有的少，外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞由于代謝負(fù)荷較 小，所以生長(zhǎng)較快，在生長(zhǎng)若干代之后，表達(dá)少的細(xì)胞會(huì)形成優(yōu)勢(shì)， 長(zhǎng)期之后， 表達(dá)最弱的細(xì)胞會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)占主要， 轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白 基因后，表達(dá)越來越暗就是這個(gè)道理。所以，要進(jìn)行單克隆化操作， 使得到

27、的均來自于同一祖先細(xì)胞， 遺傳性狀盡量一致， 也是對(duì)高表達(dá) 細(xì)胞的保護(hù)。操作用 96 孔板法，每代細(xì)胞長(zhǎng)滿后，大多數(shù)凍存，留 200cell 左右 就可以進(jìn)行該操作了， 該方法在很多關(guān)于單克隆抗體和細(xì)胞原代培 養(yǎng)書中均有講述。1. 可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且 不是單拷貝的，這點(diǎn)我們做過 FISH 驗(yàn)證過，表達(dá)量與整合數(shù)目，上 游序列特性，特定部位 DNA 立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了 SV40 只 是增加了表達(dá)了數(shù)目， 但并不能掩蓋其它因素對(duì)表達(dá)的影響。 按你的 講法，轉(zhuǎn)染完 GFP 的細(xì)胞應(yīng)該亮度一致，但實(shí)際上差別很大。 neo 基因也是這樣， 而且，同一細(xì)胞中不

28、同基因的拷貝數(shù)不會(huì)相同， 不同 細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會(huì)相同， 這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀 點(diǎn)理解。有時(shí)， neo 表達(dá)了，但目的基因丟失了的情況也是有的。2. 那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一 細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因基因， 那么，一種基因拷貝 數(shù)為 0 的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小， 很大的 概率為外源基因的不均質(zhì)。打個(gè)比方，一個(gè)大口袋，抓 100 個(gè)紅球， 再抓 100 個(gè)黃球，然后以從中抓若干個(gè)， 這些球均為紅球的概率有多 大呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是 neo ，黃球就是你的目的基因。我們 用 neo ，實(shí)際上是篩選的外源基因整

29、合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的 例子來說，如果我們抓著 5 個(gè)紅球，另一次抓著 10 個(gè)紅球，可以肯 定，第二次抓的球比較多， 那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。因?yàn)槎叱霈F(xiàn)的概率比是恒定的3. 維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持?？梢栽俚托荒軟]有。 或者隔一定時(shí)間從新使用篩選量壓一下， 我不知你是否干臨床， 想想 抗生素的用藥原則，反向思維一下，實(shí)際上我們?cè)诤Y選耐藥株呀。4. neo 的產(chǎn)物是酶，過高的 G418 濃度就要有更多的 neo 酶來支持， 否則細(xì)胞也要被毒死的， 而此時(shí)過多的酶要求會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝造成太大 負(fù)擔(dān)，細(xì)胞可能因此無法完成分裂與增殖， 我們?cè)囘^， 即使在同一

30、轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，在不同濃度的 G418 液中生長(zhǎng)速度也不同，嚴(yán)重形態(tài) 也不同。 這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方 程理解吧。5. 胰酶的作用不必理會(huì)，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響， 由幾代之后，不受影響的細(xì)胞會(huì)占優(yōu)勢(shì)的。僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理， 實(shí)在是個(gè)人 經(jīng)驗(yàn)， 而且在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友， 我還是想聽聽諸位專業(yè)人士 的理解和經(jīng)驗(yàn)。在第 10 天左右就手挑單克隆或者 96 孔板單克隆操作了 本帖開始我就講了如何確定基準(zhǔn)濃度，篩選濃度是基準(zhǔn)濃度的高一 級(jí)，維持用篩選濃度的一半。匯合度 (confluence) 也許是我們實(shí)驗(yàn)室的翻譯，實(shí)際上就

31、是指細(xì)胞占 培養(yǎng)表面的比例， 如果細(xì)胞鋪滿了整個(gè)容器， 我們就認(rèn)為它們 100% 匯合，也就是匯合度 100% 。最近的一個(gè)實(shí)驗(yàn)是：3X106細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，我把電激杯中的細(xì)胞分別接 種 1/4000 和 1/1000 和 1/300 到 24 孔板中，48 小時(shí)后加 g418 篩選， 這個(gè)時(shí)候接種了 1/300 細(xì)胞的孔會(huì)大約 50% 匯合，而理論上接種了 1/4000 細(xì)胞的孔會(huì) 4% 左右匯合，今天是篩選后第 9 天，觀察到 1/4000 孔有兩三個(gè)小克隆，按道理 1/300 孔會(huì)有 20-30 個(gè)克隆，但 實(shí)際的情況是它們幾乎全部死光了，僅有少數(shù)存活細(xì)胞！ 所以我認(rèn)為匯合度對(duì) g418 篩

32、選影響很大，這耽誤了我將一個(gè)多月。 jiangql 同意菊花與刀對(duì)你的建議。我的感覺 G418 篩選時(shí)間太長(zhǎng)， 到后來一般會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響。以下是一些建議，供參考： 首先需要擴(kuò)增細(xì)胞， 凍存部分中間產(chǎn)物細(xì)胞后， 再做克隆化比較合適， 否則一旦污染就會(huì)全軍覆沒。一般57天后G418就可以減半維持。 勤換液，去除死細(xì)胞，可以減少對(duì)存活細(xì)胞的影響。 血清濃度可以高到 20 ，質(zhì)量要好。進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：克隆目的基因 (經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證) 準(zhǔn)備真核表達(dá)載體將目的基因插入 表達(dá)載體中轉(zhuǎn)染篩選鑒定下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作。一、 試劑準(zhǔn)備1、HBS( He pes

33、-buffered saline )：876mg NaCl 溶于 90ml ddH2O ， 加入 1M Hepes,調(diào) pH 到 7.4,補(bǔ) ddH20 至 100ml, pH7.4，濾過除菌。2、核酸貯存液，過濾除菌。3、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的正常培養(yǎng)。、操作步驟 （一）克隆目的基因1、根據(jù) GenBank 檢索的目的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并在上、下游引物的5'-端分別引入酶切位點(diǎn)BamH I和Xho I,行RT-PCF。2、回收特異性擴(kuò)增片段，連入 T 載體。3、轉(zhuǎn)化DH5a,質(zhì)粒制備。4、酶切初步鑒定，測(cè)序證實(shí)。（二）真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建：pcDNA3 載

34、體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、 便于挑選帶重組質(zhì) 粒細(xì)菌的抗生素抗性基因，以及表達(dá)外源 DNA 序列所必需的所有真 核表達(dá)組件。重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamH I和Xho I雙酶切回收插入片段和 pcDNA3 線性片段T4 連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5%質(zhì)粒制備BamH I和Xho I雙酶切鑒定。（三）重組 pcDNA3 轉(zhuǎn)染 SHG-44 細(xì)胞：1、G418篩選濃度測(cè)定：SHG-44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板-G418分別 用 100mg/L 、 200mg/L 、 300mg/L 、 400mg/L 、 500mg/L 、 600mg/L 加入， 各濃度 3 復(fù)孔，設(shè)正常對(duì)照 3 復(fù)孔。以 10

35、-14 天細(xì)胞全部死亡 的濃度為篩選濃度，結(jié)果為 200mg/L 。2、在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞， 各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的 生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到 60%-80% 覆蓋。 一般要求，6孔培養(yǎng)皿（35mm ）,每孔1-2ml培養(yǎng)基3X105細(xì)胞。 依據(jù)不同大小培養(yǎng)板調(diào)整每平方厘米的細(xì)胞數(shù)量。 典型貼壁細(xì)胞平板密度培養(yǎng)板大小 生長(zhǎng)面積（ cm2） 大約細(xì)胞數(shù) 培養(yǎng)基容積（ ml）組織培養(yǎng)皿（© 60mm）2866X1055-66孔培養(yǎng)板（© 35mm）9.53X1051-212孔培養(yǎng)板 © 22.6mm)413X10505-124 孔培養(yǎng)

36、板1 © 8mm)05 06X105025-053、 SHG-44細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：（1）轉(zhuǎn)染當(dāng)天，加入脂質(zhì)體 / DNA 混合物之前的短時(shí)間內(nèi)，更換 1ml 新鮮的有血清或無血清培養(yǎng)基。 準(zhǔn)備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個(gè)細(xì)胞系的最 佳比例。 溶液A：用HBS稀釋DNA（ pcDNA3、重組pcDNA3）各1.5卩g到總體積50卩1（30卩g/m）。溶液B:用HBS稀釋6卩脂質(zhì) 體到終容積501（ 120卩g/ml）。混合溶液A和B,輕柔混合（不要 振蕩），室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。（3）不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100卩脂質(zhì)體/DNA混合物（從

37、培養(yǎng) 孔一邊到另一邊） ，邊加邊輕搖培養(yǎng)板。37 C孵育6hr。（5） 6hr 后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入 2-3ml 新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基 屋尸轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力，改用含 G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。4、G418篩選：在G418篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后，挑出單克隆， 擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)轉(zhuǎn)染 pcDNA3即SHG-44-vect，并設(shè)對(duì)照組細(xì)胞即 SHG-44。(一)篩選結(jié)果鑒定：(1) 基因組DNA提取-PCR鑒定外源基因(2) SHG-44-重組pcDNA3陽性細(xì)胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰 胺凝膠電泳免疫印跡鑒定 P16蛋白表達(dá)(Western-blot )。(3) 測(cè)定外源性基因?qū)H

38、G-44細(xì)胞增殖的影響 流式細(xì)胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組 pcDNA3單細(xì)胞懸液70%酒精固定裂解細(xì)胞核糖核酸酶消化碘化 丙啶染色上機(jī)分析 G1期和G2/M、S期比例。 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA35X104/孔接種24孔培養(yǎng)板24hr后各自用苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞 計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率。 軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3 104細(xì)胞0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)1-2周后計(jì)數(shù)不可少 于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)計(jì)算克隆形成率抑制率。三、注意事項(xiàng)1、優(yōu)化轉(zhuǎn)

39、染條件(脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體 和DNA混合孵育時(shí)間)每種細(xì)胞和質(zhì)粒均須進(jìn)行。用于轉(zhuǎn)染的核酸 應(yīng)高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應(yīng)在無菌條件下，這是細(xì)胞慣常的做法。 但是， 脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA 混合物無需濾過除菌。2、預(yù)備脂質(zhì)體 /DNA 混合物必須在無血清下進(jìn)行。但是在隨后的脂 質(zhì)體 / DNA 與被轉(zhuǎn)染細(xì)胞共孵育的過程中，血清又是培養(yǎng)基的一部 分。3、在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率，但所用培養(yǎng)基必須37 C預(yù)溫。4、脂質(zhì)體 / DNA 混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿 一邊到另一邊， 邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿， 以確保均勻

40、分布和避免局部高 濃度。常見問題和解答：Q:我覺得套環(huán)法操作不如96孔辦法效率高。A:也不一定.依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求而定.如果克隆效率較低的細(xì)胞, 套環(huán)可能更好 .用96孔板法,如果不是每孔單個(gè)細(xì)胞 ,就不能保證是單 克隆.即使是增加到每孔十幾個(gè)細(xì)胞或上百個(gè) ,一個(gè) 96 孔板也只能培 養(yǎng)一萬個(gè)細(xì)胞 ,十萬個(gè)細(xì)胞就至少需要 10 個(gè)板,100 萬個(gè)細(xì)胞就需要 100 個(gè)板,對(duì)于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選或基因打靶 ,工作量就太大了 .且細(xì)胞 在單獨(dú)生長(zhǎng)條件下 ,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如千萬個(gè)細(xì)胞共同培養(yǎng)活力好 . 因此還得 看這位朋友使用的是什么細(xì)胞 ,有限細(xì)胞系還是無限細(xì)胞系 ,轉(zhuǎn)基因還 是非轉(zhuǎn)基因 ,篩選還是不篩選 ,

41、需要的單細(xì)胞克隆株數(shù)量多少 ?Q：請(qǐng)問一種細(xì)胞如果轉(zhuǎn)染了穩(wěn)定表達(dá)的， 含neo抗性基因的質(zhì)粒后， 如何用G418篩選？我查看了國內(nèi)、外 50幾篇文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè) 定論的說法。即使對(duì)于同一種細(xì)胞其篩選劑量和篩選時(shí)間也不一樣。 我自己認(rèn)為， 從理論上講， 如果穩(wěn)定表達(dá)最好要一直篩選到細(xì)胞傳代 后。不知這種觀點(diǎn)對(duì)不對(duì)。然而開始篩選的劑量、 維持劑量以及篩選 持續(xù)時(shí)間又該如何確定？維持劑量與開始篩選時(shí)的劑量是否有一定 關(guān)系？A： 1. G418 篩選要做預(yù) 試驗(yàn)確定最佳濃 度， 將細(xì)胞稀 釋至 1000cell/ml ，每孔 100ul 加入有培養(yǎng)基的 24 孔板，將每孔中的 G418 濃 度 稀

42、釋 至 0,100, 200,300,400,500, 600,700, 800,900,1000,1100ng/ml等1 2個(gè)級(jí)別，培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡 濃度為基準(zhǔn)，一般400- 8 0 0左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別， 維持使用篩選濃度的一半。2。我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因?yàn)橛袝r(shí)候 抗性基因會(huì)丟失，如果沒有 G418，很快會(huì)形成優(yōu)勢(shì)的。3。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重 要的。Q:請(qǐng)問：能談一談單克隆化操作的步驟以及其與目的基因表達(dá)的關(guān) 系嗎？A:轉(zhuǎn)染后，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的， 目的蛋白表達(dá)有

43、的多， 有的少， 外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞由于代謝負(fù)荷 較小，所以生長(zhǎng)較快，在生長(zhǎng)若干代之后， 表達(dá)少的細(xì)胞會(huì)形成優(yōu)勢(shì)， 長(zhǎng)期之后， 表達(dá)最弱的細(xì)胞會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)占主要， 轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白 基因后，表達(dá)越來越暗就是這個(gè)道理。所以，要進(jìn)行單克隆化操作， 使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞， 遺傳性狀盡量一致， 也是對(duì)高表達(dá) 細(xì)胞的保護(hù)。操作用 96 孔板法，每代細(xì)胞長(zhǎng)滿后，大多數(shù)凍存，留2 0 0 cell左右就可以進(jìn)行該操作了，該方法在很多關(guān)于單克隆抗體 和細(xì)胞原代培養(yǎng)書中均有講述，我就不贅述了。必須指出， 單克隆化要做幾遍， 一遍是不夠的， 我前十代都是這樣的， 結(jié)果綠色熒光蛋白不但沒減弱，反而增強(qiáng)了很

44、多。 現(xiàn)在很多代了，很 穩(wěn)定。Q ：1。我的質(zhì)粒中含有 SV40 與 neo 基因，好像就不存在外源蛋白 表達(dá)少的細(xì)胞形成優(yōu)勢(shì)這個(gè)問題了吧。2。按您的講法， 篩選要進(jìn)行 10 代，那么維持劑量要進(jìn)行多長(zhǎng)時(shí)間？ 如果我使用對(duì)照組 ,在對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后就用維持劑量進(jìn)行培養(yǎng) 行嗎？3。在細(xì)胞用胰酶進(jìn)行傳代時(shí)，此時(shí)細(xì)胞膜受到一定影響，如果培養(yǎng) 基中存在 G418 對(duì)細(xì)胞是否有影響？4。既然細(xì)胞表達(dá) neo, 從理論上講是否無論多大濃度的 G418 對(duì)之都 無影響？A： 1.可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而 且不是單拷貝的，這點(diǎn)我們做過 FISH 驗(yàn)證過，表達(dá)量與整合數(shù)目， 上

45、游序列特性，特定部位 DNA 立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了 SV40 只是增加了表達(dá)了數(shù)目， 但并不能掩蓋其它因素對(duì)表達(dá)的影響。 按你 的講法，轉(zhuǎn)染完GFP的細(xì)胞應(yīng)該亮度一致，但實(shí)際上差別很大。neo 基因也是這樣， 而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會(huì)相同， 不同 細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會(huì)相同， 這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀 點(diǎn)理解。有時(shí)， neo 表達(dá)了，但目的基因丟失了的情況也是有的。2。那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因基因， 那么，一種基因拷貝 數(shù)為 0 的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小， 很大的 概率為外源基因

46、的不均質(zhì)。打個(gè)比方，一個(gè)大口袋，抓10 0個(gè)紅球， 再抓 100 個(gè)黃球，然后以從中抓若干個(gè)， 這些球均為紅球的概率有多 大呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是 neo ,黃球就是你的目的基因。我們 用neo,實(shí)際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的 例子來說，如果我們抓著5個(gè)紅球，另一次抓著10個(gè)紅球，可以肯 定,的二次抓的球比較多, 那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就 很大了。因?yàn)槎叱霈F(xiàn)的概率比是恒定的。3。維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持?？梢栽俚托荒軟]有。 或者隔一定時(shí)間從新使用篩選量壓一下, 我不知你是否干臨床, 想想 抗生素的用藥原則,反向思維一下,實(shí)際上我們?cè)诤Y選耐藥株呀。4。neo的產(chǎn)物是酶，過高的G4 18濃度就要有更多的neo酶來支 持,否則細(xì)胞也要被毒死的, 而此時(shí)過多的酶要求會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝造成 太大負(fù)擔(dān),細(xì)胞可能因此無法完成分裂與增殖,我們?cè)囘^,即使在 同一轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，在不同濃度的 G418 液中生長(zhǎng)速度也不同，嚴(yán)重 形態(tài)也不同。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的， 用米 氏方程理解吧。5。胰酶的作用不必理會(huì)，有的細(xì)