基因工程的操作步驟教學(xué)提綱

1、基因工程的操作步驟基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 1.目的基因的獲取目的基因的獲取 2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建 3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 4.目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子含子編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 知識點(diǎn)一：知識點(diǎn)一：

2、2.2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真真核核細(xì)細(xì)胞胞的的 基基因因結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下

3、游 原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)不同點(diǎn)編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點(diǎn)相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞胞4 4

4、、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定知識點(diǎn)二知識點(diǎn)二. .基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟一、獲取目的基因1.獲取目的基因的途徑獲取目的基因的途徑 A.A.從自然界已有的物種中分離從自然界已有的物種中分離 B.B.人工合成人工合成2.獲取目的基因的方法獲取目的基因的方法 A.A.從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取 B.B.利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增 C.C.利用化學(xué)方法人工合成利用化學(xué)方法人工合成目的基因主要是目的基因主要是_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因一、目的基因的獲取一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@取1.1

5、.基因文庫：基因文庫：概念見概念見P9P92.2.基因文庫的分類基因文庫的分類: :按外源按外源DNADNA片段的來源分類片段的來源分類種種類類基因組基因組DNA文庫：文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文庫文庫3.3.基因文庫的目的基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。目的基因。4.4.獲取目的基因的根據(jù)：獲取目的基因的根據(jù)： 見課本見課本P9提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當(dāng)?shù)南?/p>

6、制酶切用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉囊欢ù笮〉腄NADNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫基因組文庫5.5.基因文庫的構(gòu)建方法之一基因文庫的構(gòu)建方法之一（1 1）直接分離法）直接分離法( (鳥槍法鳥槍法) )cDNA合成過程 n第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與為模板合成一條與RNA互互補(bǔ)的補(bǔ)的DNA單鏈，形成單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。雜交分子。n第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNA-DNA雜交分子中的雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的鏈降解，使之變成單鏈的DNA。n第三步，以單鏈第三步，以單鏈

7、DNA為模板，在為模板，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈鏈，形成雙鏈DNA分子。分子。 5.5.基因文庫的構(gòu)建方法之基因文庫的構(gòu)建方法之基因組文庫和部分基因組文庫基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫文庫)比較比較 概念概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項(xiàng)在生物，是一項(xiàng)在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段原理：原理：DNADNA復(fù)制復(fù)制2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸(dNTP)(dNTP) 一對引物：

8、一對引物：熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA( DNA( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) MgMg2+2+( (激活劑激活劑) )緩沖溶液緩沖溶液一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物成引物利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理原理:DNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制前提前提:要有一段已知要有一段已知目的基因的脫目的基因的脫氧核苷酸序列，氧核苷酸序列，以便合成引物。以便合成引物。 過程過程高溫變性（高溫變性（解旋為單鏈解旋為單

9、鏈）低溫退火（低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）適溫延伸（適溫延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 與模板互補(bǔ)的與模板互補(bǔ)的DNADNA雙鏈雙鏈）重復(fù)循環(huán)重復(fù)循環(huán)預(yù)變性（預(yù)變性（增加增加DNADNA變性的概率變性的概率）2 2、具體過程、具體過程PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項(xiàng)在生物，是一項(xiàng)在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 _、_ _ 、 _._.等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n n為擴(kuò)增循為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體

10、外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復(fù)制復(fù)制四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物DNADNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）過程：過程：a a、DNADNA變性變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火、退火（復(fù)性復(fù)性55-6555-65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成

11、局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的合成與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈PCR技術(shù)擴(kuò)增與技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較PCR技術(shù)技術(shù)DNA復(fù)制復(fù)制相相同同點(diǎn)點(diǎn)原理原理原料原料條件條件不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋方式方式場所場所酶酶結(jié)果結(jié)果堿基互補(bǔ)配對堿基互補(bǔ)配對四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復(fù)制體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶聚合酶大量的大量

12、的DNA片段片段形成整個形成整個DNA分子分子以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使使RNARNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈補(bǔ)的單鏈DNADNA，然后在酶的，然后在酶的作用下合成雙鏈作用下合成雙鏈DNADNA，從而，從而獲得所需的基因。獲得所需的基因。3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：所需物質(zhì)：所需物質(zhì)：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。表達(dá)和發(fā)

13、揮作用。2 2、基因表達(dá)載體的組成：、基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)+ +目的基因目的基因+ +啟動子啟動子+ +終止子終止子+ +標(biāo)記基因標(biāo)記基因啟動子：啟動子：位于基因的首端的一段特殊位于基因的首端的一段特殊的的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結(jié)聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊位于基因的尾端的一段特殊的的DNADNA片斷，片斷，能終止能終止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用是的作用是為了為了鑒別鑒別受體細(xì)胞受

14、體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來基因的細(xì)胞篩選出來載體載體與與表達(dá)載體表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分原點(diǎn)兩部分DNADNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到既用到限制酶切割載體，又用到DNADNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子啟動子、終止

15、子對于目的基因表達(dá)必不可少對于目的基因表達(dá)必不可少目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。的方式攜帶進(jìn)去。注意注意三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-動物細(xì)胞n顯微注射法顯微注射法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-微生物細(xì)胞nCa2+處理處理 使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中的使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中的DNA-感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞四、目的基因的檢測與鑒定n檢測檢測:n是否插入目的基因是否插入目

16、的基因（DNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)）n是否轉(zhuǎn)錄是否轉(zhuǎn)錄（mRNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)）n是否翻譯是否翻譯（抗原抗原抗體雜交技術(shù)抗體雜交技術(shù)）n鑒定鑒定:n功能活性鑒定功能活性鑒定n抗性鑒定抗性鑒定分別提取什么進(jìn)行檢測歸納步驟DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNADNA分分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補(bǔ)子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會結(jié)合的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部

17、位，仍然是兩條游離的單鏈。列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 歸納: 基因工程的基本操作程序n獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫從基因文庫u利用利用PCRPCRu化學(xué)方法人工合成化學(xué)方法人工合成n構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建基因表達(dá)載體u目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因n將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法n目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定u檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯基因操作的基本步驟基因操作的基本步驟練習(xí)練習(xí)1：(2008理綜山東卷理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，為擴(kuò)大可耕地

18、面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，處，DNA連接酶作用于連接酶作用于 處。（填處。（填“a”或或“b”）aa練習(xí)練習(xí)1：(2008理綜山東卷理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)

19、用耐鹽基因培育出了耐鹽受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。水稻新品系。（2）將重組）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用利用 技術(shù)，該技術(shù)的核心是技術(shù)，該技術(shù)的核心是 和和 。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的要用放射性同位素標(biāo)記的 作探針進(jìn)行作探針進(jìn)行分子雜交檢測，又要用分子雜交檢測，又要用 方方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性?；驑尫ǎɑǚ酃芡ǖ婪ǎ┗驑尫ǎɑǚ酃芡ǖ婪ǎ┲参锝M織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)脫分化和再分化脫分化和再分化耐鹽基因耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌一定濃度鹽水澆灌1）以下說法正確的是）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接個限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代