背景知識(shí)六菌種保藏技術(shù)實(shí)用教案

1、 微生物會(huì)發(fā)生變化嗎？ 分離得到(d do)的微生物可以直接用于生產(chǎn)嗎？ 怎樣保存微生物？第1頁/共60頁第一頁，共61頁。知識(shí)節(jié)點(diǎn)一 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)知識(shí)節(jié)點(diǎn)二 原核微生物的基因(jyn)重組知識(shí)節(jié)點(diǎn)三 真核微生物的基因(jyn)重組知識(shí)節(jié)點(diǎn)四 微生物育種技術(shù)知識(shí)節(jié)點(diǎn)五 菌種保藏技術(shù)第2頁/共60頁第二頁，共61頁。知識(shí)(zh shi)節(jié)點(diǎn)一 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) 遺傳： 變異： 遺傳型/基因型： 表型：指某一生物體所具有的一切外表特征及內(nèi)在特性的總和，是遺傳型在合適環(huán)境下的具體體現(xiàn)。 飾變：指微生物的某些改變是指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯(zhun y)水平上的表型變化。

2、第3頁/共60頁第三頁，共61頁。 一、三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)證實(shí)(zhngsh)核酸是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) （一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：第4頁/共60頁第四頁，共61頁。2、細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn) 熱死S菌 不生長(shngzhng)肺炎雙球菌 活R菌 長出R菌 熱死S菌+活R菌 長出大量R菌+10-6S菌第5頁/共60頁第五頁，共61頁。 （二）噬菌體感染(gnrn)實(shí)驗(yàn) 第6頁/共60頁第六頁，共61頁。 （三）植物(zhw)病毒的重建實(shí)驗(yàn)TMV重建實(shí)驗(yàn)示意圖(箭頭表示遺傳信息的去向) 第7頁/共60頁第七頁，共61頁。 二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位(bwi)和方式 (一)細(xì)胞水平1 核染色體 2 質(zhì)粒 （1）致育

3、因子（F因子）又稱致育因子或性因子 （2）抗性因子（R因子） 又稱R質(zhì)粒 （3）產(chǎn)細(xì)菌素因子 （ 4）誘癌質(zhì)粒（Ti質(zhì)粒） （5）巨大質(zhì)粒（mega質(zhì)粒） （6）降解性質(zhì)粒 (二)分子水平核酸（DNA、RNA）第8頁/共60頁第八頁，共61頁。知識(shí)節(jié)點(diǎn)二 原核微生物的基因(jyn)重組 基因重組：將兩個(gè)不同性狀個(gè)體細(xì)胞內(nèi)的遺傳基因移到一個(gè)個(gè)體細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新的遺傳性個(gè)體的過程。 獲取外源DNA的方式 原核微生物 轉(zhuǎn)化 裸露的DNA 基因重組的方式 轉(zhuǎn)導(dǎo) 噬菌體作媒介 接合 細(xì)菌(xjn)之間的接觸 相同：基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致遺傳重組第9頁/共60頁第九頁，共61頁。一、轉(zhuǎn)化 （

4、一）定義 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用： 轉(zhuǎn)化因子：具有轉(zhuǎn)化活性的外來DNA片段 轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細(xì)胞 （二）轉(zhuǎn)化微生物的種類 肺炎鏈球菌、嗜血(sh xu)桿菌屬、芽孢桿菌屬、奈瑟氏球菌屬）、根瘤菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬和黃單胞菌屬 第10頁/共60頁第十頁，共61頁。 （三）轉(zhuǎn)化的條件能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞必須處于(chy)感受態(tài)，同時(shí)有外源DNA片段存在，才能實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化。 （四）轉(zhuǎn)化過程 （五）與轉(zhuǎn)染區(qū)別）抗鏈霉素基因(jyn)strr(jyn)strr鏈霉素敏感(mngn)型基因strs第11頁/共60頁第十一頁，共61頁。二、轉(zhuǎn)導(dǎo)完全缺陷(quxin)噬菌體：轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體/轉(zhuǎn)導(dǎo)顆

5、粒 部分缺陷(quxin)噬菌體：轉(zhuǎn)導(dǎo)子：獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞第12頁/共60頁第十二頁，共61頁。（一）普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhun do) 1 完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhun do)第13頁/共60頁第十三頁，共61頁。2 流產(chǎn)(li chn)轉(zhuǎn)導(dǎo) 第14頁/共60頁第十四頁，共61頁。（二）局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 1. 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) （LFT）部分缺陷噬菌體的形成當(dāng)部分缺陷噬菌體感染宿主細(xì)胞并整合在宿主的核基因組上時(shí)，可使宿主細(xì)胞成為一個(gè)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子（而不是(b shi)一個(gè)溶源菌， 對(duì)噬菌體不具有免疫性）。 第15頁/共60頁第十五頁，共61頁。第16頁/共60頁第十六頁，共61頁。2. 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) （HFT）當(dāng)雙重溶源

6、菌被紫外線等誘導(dǎo)時(shí)，其中的正常噬菌體的基因可補(bǔ)償dgal所缺失的部分基因功能，因而兩種噬菌體就同時(shí)獲得復(fù)制的機(jī)會(huì)。因此由雙重溶源菌所產(chǎn)生的裂解物中，含有(hn yu)等量的和dgal粒子，這就稱HFT（高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)）裂解物第17頁/共60頁第十七頁，共61頁。（三）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（三）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhun do)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhun do)的比較的比較比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生噬菌體形成噬菌體形成形成機(jī)制形成機(jī)制內(nèi)含內(nèi)含DNADNA轉(zhuǎn)導(dǎo)性狀轉(zhuǎn)導(dǎo)性狀轉(zhuǎn)導(dǎo)過程轉(zhuǎn)導(dǎo)過程轉(zhuǎn)導(dǎo)子轉(zhuǎn)導(dǎo)子自然發(fā)生自然發(fā)生 錯(cuò)誤的包裝錯(cuò)誤的包裝包裹選擇模型包裹選擇模

7、型只含宿主染色體只含宿主染色體DNADNA供體的任何性狀供體的任何性狀通過雙交換使轉(zhuǎn)導(dǎo)通過雙交換使轉(zhuǎn)導(dǎo)DNADNA替換了受替換了受體體DNADNA同源區(qū)同源區(qū)不能使受體菌溶源化不能使受體菌溶源化轉(zhuǎn)導(dǎo)特性穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)特性穩(wěn)定人工誘導(dǎo)如人工誘導(dǎo)如UVUV等等前噬菌體反常切除前噬菌體反常切除雜種形成模型雜種形成模型同時(shí)含有噬菌體同時(shí)含有噬菌體DNADNA和宿主和宿主DNADNA多為前噬菌體鄰近兩端的多為前噬菌體鄰近兩端的DNADNA片段片段轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)DNADNA插入，使受體菌為插入，使受體菌為部分二倍體部分二倍體為缺陷溶源菌為缺陷溶源菌轉(zhuǎn)導(dǎo)特性不穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)特性不穩(wěn)定第18頁/共60頁第十八頁，共61頁。 三

8、、接合 （一）定義 接合：供體菌（“雄”）通過其性菌毛與受體菌（“雌”）相接觸，前者傳遞不同長度的單鏈DNA給后者，并在后者細(xì)胞中進(jìn)行(jnxng)雙鏈化或進(jìn)一步與核染色體發(fā)生交換、整合，從而使后者獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象。接合子：通過接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞。第19頁/共60頁第十九頁，共61頁。（二）Ecoli的四種(s zhn)接合型菌株第20頁/共60頁第二十頁，共61頁。（三）幾種雜交的結(jié)果： + 與F-的雜交 雜交的結(jié)果：供體菌和受體菌均成為F+細(xì)胞 沒有(mi yu)供體菌染色體DNA的轉(zhuǎn)移 2. Hfr 與F- 的雜交 雜交后的受體細(xì)胞仍然是F- 部分供體菌DNA染色體轉(zhuǎn)移

9、到受體菌中 3. F與F-雜交 受體細(xì)胞也就變成了F 部分宿主細(xì)胞的DNA隨F因子進(jìn)入受體菌細(xì)胞第21頁/共60頁第二十一頁，共61頁。（四）原生質(zhì)體融合 是將遺傳性狀不同的兩種菌融合為一個(gè)新細(xì)胞的過程 主要(zhyo)包括原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合、原生質(zhì)體再生和融合子的選擇等步驟。第22頁/共60頁第二十二頁，共61頁。知識(shí)節(jié)點(diǎn)三 真核微生物的基因(jyn)重組 一、有性雜交 一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組(zhn z)，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù) 二、準(zhǔn)性生殖 是一種類似于有性生殖，但比有性生殖更為原始的一種生殖方式，它可使同種物兩個(gè)不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融合，并不經(jīng)

10、過減數(shù)分裂就能導(dǎo)致基因重組(zhn z)的生殖過程 第23頁/共60頁第二十三頁，共61頁。 準(zhǔn)性生殖和有性生殖(yuxng shngzh)的比較第24頁/共60頁第二十四頁，共61頁。知識(shí)節(jié)點(diǎn)(ji din)四 微生物育種 微生物菌種選育(xun y)途徑：自然選育(xun y)、定向選育(xun y)、誘變育種、雜交育種 一、利用自發(fā)突變進(jìn)行的育種 （一）自發(fā)突變原因 1.環(huán)境因素對(duì)微生物的誘變作用 各種短波輻射和高溫等 復(fù)制 3.微生物自身產(chǎn)誘變物質(zhì) 第25頁/共60頁第二十五頁，共61頁。（二）自發(fā)突變與育種 1.自然選育 在日常生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變，從而選育

11、出優(yōu)良菌種的過程 2.定向育種 是指在某一特定條件下，用某一特定因素長期處理某微生物的群體，同時(shí)不斷地對(duì)它們進(jìn)行移種傳代，以積累自發(fā)突變，并最終(zu zhn)獲得優(yōu)良菌株的過程 第26頁/共60頁第二十六頁，共61頁。 二、誘變育種 指用人工的方法處理均勻而分散的微生物細(xì)胞群，促使它們發(fā)生(fshng)突變，再從中篩選出符合要求的突變菌株，供生產(chǎn)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)用 （一）誘發(fā)突變原因誘變劑 1.物理因素的誘變 （1）紫外線 （2）x射線和r射線（3）熱和激光等 第27頁/共60頁第二十七頁，共61頁。 2.化學(xué)因素的誘變 （1）堿基結(jié)構(gòu)類似物 5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、

12、8-氮鳥嘌呤(piolng)（8-NG）、2-氨基嘌呤(piolng)（2-AP）和6-氯嘌呤(piolng)（6-CP） （2）與核酸上堿基起化學(xué)反應(yīng)的誘變劑 結(jié)果使A H（次黃嘌呤(piolng)） G X（黃嘌呤(piolng)） C U（尿嘧啶）（3）移碼突變 第28頁/共60頁第二十八頁，共61頁。（二）誘變(yu bin)育種誘變(yu bin)育種的基本過程如圖： 1.誘變(yu bin)育種的基本過程操作方法第29頁/共60頁第二十九頁，共61頁。 2.產(chǎn)量(chnling)突變株的篩選第30頁/共60頁第三十頁，共61頁。3.抗藥性突變株的篩選抗藥性基因(jyn)：選擇性遺傳

13、標(biāo)記、重要的生產(chǎn)菌種。篩選方法：（ a）梯度平板法 ：梯度平板法定向篩選抗異煙肼的吡多醇高產(chǎn)酵母菌突變株第31頁/共60頁第三十一頁，共61頁。（b）影印(yngyn)平板培養(yǎng)法第32頁/共60頁第三十二頁，共61頁。4.營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選（1）營養(yǎng)缺陷型（2）與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基MM-： 完全(wnqun)培養(yǎng)基CM+： 補(bǔ)充培養(yǎng)基SMA/B：（3）與營養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體 第33頁/共60頁第三十三頁，共61頁。（4）營養(yǎng)(yngyng)缺陷型的篩選方法夾層(jicng)培養(yǎng)法及其結(jié)果影印(y(yngyn)ngyn)接種法及其結(jié)果第34頁/共6

14、0頁第三十四頁，共61頁。知識(shí)節(jié)點(diǎn)五 菌種保藏(bocng)技術(shù)一、菌種衰退和菌種的復(fù)壯1 1、什么是菌種的衰退？2 2、菌種衰退有怎樣的表現(xiàn)？3 3、菌種退化的原因是什么？4 4、如何防止菌種衰退？5 5、如何復(fù)壯菌種？二、菌種保藏(bocng)(bocng)1 1、菌種保藏(bocng)(bocng)的目的是什么？2 2、菌種保藏(bocng)(bocng)的原理是什么？3 3、常用的菌種保藏(bocng)(bocng)方法有哪些？各如何操作？第35頁/共60頁第三十五頁，共61頁。一、菌種衰退(shuitu)(shuitu)和菌種的復(fù)壯1 1、菌種衰退(shuitu)(shuitu)：指

15、生產(chǎn)菌株性狀的劣化或遺傳標(biāo)記丟失的現(xiàn)象。純菌種純菌種自發(fā)自發(fā)(zf)突變突變突變突變(tbin)個(gè)體個(gè)體傳代增殖傳代增殖原始個(gè)體原始個(gè)體不純菌種不純菌種衰退菌種衰退菌種第36頁/共60頁第三十六頁，共61頁。2 2、菌種衰退表現(xiàn) 菌落和細(xì)胞形態(tài)改變 生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降，即出現(xiàn)負(fù)突變 致病菌對(duì)宿主侵染(qn rn)(qn rn)能力下降 對(duì)外界不良條件的抵抗能力下降等第37頁/共60頁第三十七頁，共61頁。3 3、菌種衰退的原因基因變異主要原因菌種衰退的基本原因是有關(guān)基因發(fā)生負(fù)突變， 連續(xù)傳代加速衰退 不適宜的培養(yǎng)(piyng)(piyng)和保藏條件加速衰退第3

16、8頁/共60頁第三十八頁，共61頁。4 4、菌種衰退的防止 控制傳代(chun di)(chun di)次數(shù) 創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 利用不易衰退的細(xì)胞移種傳代(chun di)(chun di) 采用有效的菌種保藏方法 講究菌種選育技術(shù) 定期進(jìn)行分離純化第39頁/共60頁第三十九頁，共61頁。5 5、菌種的復(fù)壯狹義的復(fù)壯消極的措施 是指在菌種已經(jīng)(y jing)(y jing)發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)測定，從中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。廣義的復(fù)壯積極的措施 是指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)地采取純種分離和生

17、產(chǎn)性狀測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體。第40頁/共60頁第四十頁，共61頁。菌種復(fù)壯的主要方法純種分離法：分離仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞淘汰法：處理（如藥物(yow)(yow)、低溫、高溫等）衰退菌種，淘汰已衰退個(gè)體遺傳育種法：退化的菌種重新進(jìn)行遺傳育種宿主體內(nèi)復(fù)壯法：對(duì)于寄生性微生物的衰退菌株，可通過接種到相應(yīng)宿主體內(nèi)來提高菌株的毒性 第41頁/共60頁第四十一頁，共61頁。二、菌種保藏菌種保藏是一種保持微生物菌株的生活力和原有性狀的方法。1 1、菌種保藏的目的菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保(qubo)(qubo)菌種不死亡、不被污染、不變異變異不可

18、避免, ,但可減緩變異速度。第42頁/共60頁第四十二頁，共61頁。 2 2、菌種保藏的原理人為地創(chuàng)造環(huán)境條件（如：干燥、低溫和缺氧），使微生物長期處于休眠狀態(tài)挑選(tioxun)(tioxun)典型菌種的優(yōu)良純種進(jìn)行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等第43頁/共60頁第四十三頁，共61頁。3、常用(chn yn)的菌種保藏方法第44頁/共60頁第四十四頁，共61頁。菌種保藏(bocng)(bocng)技術(shù) （1 1）斜面低溫保藏(bocng)(bocng)法 （2 2）蒸餾水保藏(bocng)(bocng)法 （3 3）真空冷凍干燥保藏(bocng)(bocng)法/ /冷凍干燥

19、保藏(bocng)(bocng)法 （4 4）液氮冷凍保藏(bocng)(bocng)法第45頁/共60頁第四十五頁，共61頁。（1 1）斜面(ximin)(ximin)低溫保藏法常用保藏法 菌種在適宜的斜面(ximin)(ximin)上 4 4冰箱中 生長完全 保藏 每隔一定時(shí)間（保藏期 1-6 1-6個(gè)月）后 新的斜面(ximin)(ximin)上 4 4 生長 保藏此法廣泛適用于各大類微生物菌種的短期保藏第46頁/共60頁第四十六頁，共61頁。此法的主要保藏措施是低溫。原理是低溫抑制生長。此法的主要保藏措施是低溫。原理是低溫抑制生長。優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，容易優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，容易(rngy)(

20、rngy)推廣，存活率高；推廣，存活率高；缺點(diǎn)是保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易缺點(diǎn)是保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易(rngy)(rngy)發(fā)生變異和被污染。發(fā)生變異和被污染。螺旋口試管替代傳統(tǒng)的棉塞、減少培養(yǎng)基碳水化合物的含量螺旋口試管替代傳統(tǒng)的棉塞、減少培養(yǎng)基碳水化合物的含量 第47頁/共60頁第四十七頁，共61頁。（2）蒸餾水保藏法：菌種制備 蒸餾水滅菌 接入菌種 不要沾濕棉塞 塞緊 室溫(sh wn)保藏螺旋口試管或加橡皮塞試管 10 或18可保藏1年左右適用于絲狀真菌、酵母型真菌及細(xì)菌中的腸道菌科。思考：原理、優(yōu)缺點(diǎn)、改進(jìn)第48頁/共60頁第四十八頁，共61頁。 其原理是對(duì)菌絲體造

21、成營養(yǎng)饑餓，從而抑制菌絲的生長。 簡便，使用方便，取后剩余(shngy)可繼續(xù)保藏 也可用不含養(yǎng)分的溶液如磷酸緩沖液（）或生理鹽水第49頁/共60頁第四十九頁，共61頁。（3 3）真空冷凍干燥保藏法/ /冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法：一般菌種可保存(bocn)5(bocn)5年-15-15年。除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對(duì)病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母及絲狀真菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存(bocn)(bocn)的微生物不到2%2%（霉菌、蕈菌、藻類）。第50頁/共60頁第五十頁，共61頁。 安瓿管 菌種菌種要純 配制保護(hù)劑如脫脂牛奶、海 藻糖、血清白蛋白、糊精 酸洗、水洗 培養(yǎng)生長良好

22、分裝 烘干 制備菌懸液濃度應(yīng)高 滅菌 滅菌 分裝安瓿管 預(yù)凍低溫冰箱20-60m或冷凍劑5-10m至-30 真空干燥在30m內(nèi)達(dá)到（） 裝在歧管上抽真空慢干至 火焰上熔封安瓿管口 檢測真空 保藏(bocng)冰箱或室溫暗處第51頁/共60頁第五十一頁，共61頁。冷凍干燥保藏(bocng)管 一種簡易冷凍干燥裝置 思考：原理、優(yōu)缺點(diǎn)第52頁/共60頁第五十二頁，共61頁。 是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏(bocng)(bocng)的方法 冷凍干燥保存的菌種存活時(shí)間長、變異率低、效果好，便于大量保藏(bocng)(bocng)，還具有體積小、不易污染、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)是設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。第53頁/共60頁第五十三頁，共61頁。 （4）液氮冷凍保藏法： 原則是“慢凍快融” 許多細(xì)菌可保藏15年以上。 此法除適宜于一般微生物的保藏外，一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子(boz)的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞都適用第54頁/共60頁第五十四頁，共61頁。準(zhǔn)備安瓿管 加保護(hù)劑與滅菌能耐受溫度突然變化 霉菌(mjn)菌絲體：安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑 接菌種入安瓿管細(xì)菌10的甘油蒸餾水菌懸液 霉菌(mjn)菌絲體用滅菌