增強(qiáng)免疫力功能評價(jià)方法(征求意見稿)及修訂說明

1、附件 1：增強(qiáng)免疫力功能評價(jià)方法（征求意見稿）保健食品評價(jià)試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果判定Items, Principles and Result Assessment1 試驗(yàn)項(xiàng)目1.1 動物實(shí)驗(yàn)體重臟器 / 體重比值測定：胸腺 / 體重比值，脾臟 / 體重比值細(xì)胞免疫功能測定：小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)體液免疫功能測定：抗體生成細(xì)胞檢測，血清溶血素測定單核巨噬細(xì)胞功能測定：小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)細(xì)胞活性測定2 試驗(yàn)原則2.1所列的指標(biāo)均為必做項(xiàng)目2.2 分為正常動物實(shí)驗(yàn)方案和免疫功能低下模型動物實(shí)驗(yàn)兩種方案 , 可任選其一進(jìn)行實(shí)驗(yàn) .2.3 采用免疫功能

2、低下動物模型實(shí)驗(yàn)方案時(shí)需做外周血白細(xì)胞總數(shù)測定3 結(jié)果判定3.1 采用正常動物實(shí)驗(yàn)，受試樣品具有增強(qiáng)免疫力作用。在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核巨噬細(xì)胞功能及 NK細(xì)胞活性四個(gè)方面測定中，任兩個(gè)方面試驗(yàn)結(jié)果為陽性， 可以判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力作用。其中細(xì)胞免疫功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性， 判定細(xì)胞免疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。 體液免疫功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性， 判定體液免疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。單核巨噬細(xì)胞功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性，判定單核巨噬細(xì)胞功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。 NK 細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)的一個(gè)以上劑量結(jié)果陽性，判定 NK細(xì)胞活性結(jié)果陽性。正常動物實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行四個(gè)

3、方面的測定。3.2 采用免疫功能低下動物實(shí)驗(yàn)， 受試樣品對免疫功能低下者具有增強(qiáng)免疫力作用。在免疫功能低下模型成立條件下， 血液白細(xì)胞總數(shù)、 細(xì)胞免疫功能、 體液免疫功能、單核巨噬細(xì)胞功能及 NK細(xì)胞活性五個(gè)方面測定中，任兩個(gè)方面試驗(yàn)結(jié)果為陽性，判定該受試樣品對免疫功能低下者具有增強(qiáng)免疫力作用。其中細(xì)胞免疫功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性， 或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性， 可判定細(xì)胞免疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。 體液免疫功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性， 或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性， 可判定體液免疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。 單核巨噬細(xì)胞功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性，或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的

4、兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性， 可判定單核巨噬細(xì)胞功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。 NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)的一個(gè)以上劑量結(jié)果陽性，可以判定 NK細(xì)胞活性結(jié)果陽性。血液白細(xì)胞總數(shù)測定的二個(gè)以上劑量結(jié)果陽性， 可以判定血液白細(xì)胞總數(shù)結(jié)果陽性。免疫功能低下模型動物實(shí)驗(yàn)至少需進(jìn)行三個(gè)方面的測定。同時(shí)在各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，任何一項(xiàng)測試都不出現(xiàn)加重免疫抑制劑作用的結(jié)果。增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法Method for the Assessment of Enhancing Immune Function1. 原理：免疫系統(tǒng)主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴組織和全身各處的淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞等，還包括血液中的白細(xì)胞。淋巴細(xì)胞經(jīng)血液和淋巴使各處的

5、淋巴器官和淋巴組織連成一個(gè)功能整體。胸腺屬中央淋巴器官，主要功能是確保 T 淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性細(xì)胞；脾臟對抗原發(fā)生免疫應(yīng)答作用，脾竇的巨噬細(xì)胞具有清除功能，脾白髓含有記憶 B 細(xì)胞，產(chǎn)生對T 依賴抗原的體液免疫應(yīng)答。淋巴細(xì)胞是特異性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞群，按其表面標(biāo)志物，分為T 細(xì)胞、 B 細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞（ NK）三大+淋巴細(xì)胞。 B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞后類， T 細(xì)胞又分為 CD4（Th）細(xì)胞和 CD8T能合成和釋放抗原特異抗體，所有抗體都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白分子都具有抗體功能。免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異性免疫和非特異性免疫功能，檢測上述

6、免疫系統(tǒng)的各種代表性指標(biāo)的改變可對增強(qiáng)免疫力作用的功能做出相應(yīng)判定。2. 實(shí)驗(yàn)動物選擇推薦用近交系小鼠，如 C57BL/6J、BALB/C等， 68 周齡， 1822g（ BALB/C種可 16-18g ），單一性別，雌雄均可，每組1015 只。3. 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和 1 個(gè)陰性對照組。以人體推薦量的 10 倍為其中一個(gè)劑量，另設(shè)二個(gè)劑量組。必要時(shí)設(shè)陽性對照組。選做免疫低下模型法時(shí)，應(yīng)設(shè)模型對照組。受試樣品給予時(shí)間四周或 30 天。4免疫功能低下動物模型可選用環(huán)磷酰胺、氫化可的松或其他合適的免疫抑制劑進(jìn)行藥物造模。4.1造模原理：環(huán)磷酰胺主要通過 DNA烷基化破壞

7、DNA的合成而非特異性地殺傷淋巴細(xì)胞，并可抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化； 環(huán)磷酰胺對 B 細(xì)胞的抑制比 T 細(xì)胞強(qiáng)，一般對體液免疫有很強(qiáng)的抑制作用，對 NK細(xì)胞的抑制作用較弱。氫化可的松主要通過與相應(yīng)受體結(jié)合成復(fù)合物后進(jìn)入細(xì)胞核， 阻礙 NF-B 進(jìn)入細(xì)胞核， 抑制細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)的合成和釋放， 達(dá)到免疫抑制目的。 氫化可的松還可損傷漿細(xì)胞，抑制巨噬細(xì)胞對抗原的吞噬、處理、和呈遞作用，所以氫化可的松對細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞的吞噬、 NK 作用都有一定的抑制作用。4.2 免疫抑制劑劑量選擇環(huán)磷酰胺可選擇 40mgkg，腹腔注射，連續(xù)兩天，末次注射給藥后第5 天測定各項(xiàng)指標(biāo)；氫化可的松可選擇40mgk

8、g，肌內(nèi)注射，隔天一次，共5 次，末次注射給藥后次日測定各項(xiàng)指標(biāo)。各指標(biāo)對兩種模型敏感性不同，環(huán)磷酰胺模型比較適合抗體生成細(xì)胞檢測、血清溶血素測定、白細(xì)胞總數(shù)測定；氫化可的松模型比較適合遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、碳廓清實(shí)驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)、 NK 細(xì)胞活性測定，建議根據(jù)不同的免疫功能指標(biāo)選擇合適的模型。4.3受試物給予連續(xù)給予受試物 4 周或 30 天，在第 3 周后開始給予免疫抑制劑，進(jìn)行模型與預(yù)防性給藥相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)。5. 實(shí)驗(yàn)方法5.1 血液白細(xì)胞數(shù)測定小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)檢測方法(儀器法)全血用 EDTA·K2 抗凝后經(jīng)血細(xì)胞分析儀檢測，可測定白細(xì)胞數(shù)量，并可對

9、白細(xì)胞進(jìn)行分分類計(jì)數(shù)。儀器和材料乙二胺四乙酸二鉀（ EDTA·K2·2HO，MW404.47），離心管，全血細(xì)胞分析儀上樣管，眼科鑷子，振蕩器，加樣槍，冷凍離心機(jī)，全血細(xì)胞分析儀。實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制血液抗凝： EDTA·K2 能與血液中的鈣離子結(jié)合成為螯合物，從而阻止血液凝固， 1.5 2.2mg 的 EDTA·K2 可阻止 1ml 血液凝固?？鼓齽┡渲疲悍Q量8mg EDTA·K2 加純凈水至 100ml 制成抗凝劑， 50l抗凝劑可抗凝 1ml 小鼠全血。采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血， 采用干凈無菌的眼科鑷子摘取小鼠一側(cè)或雙側(cè)眼球，讓血液自

10、由滴入裝有抗凝劑的1.5ml 離心管（或商品化的抗凝管） 中，采血過程中不斷混勻血液與抗凝劑防止血液凝固，每只動物采集抗凝全血約1ml。檢測分析上機(jī)前血液顛倒混勻， 注意檢查是否存在凝塊。 在 24h 內(nèi)以全血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)。上機(jī)操作參照儀器說明書。數(shù)據(jù)分析一般采用方差分析， 按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)， 方差齊，計(jì)算 F 值， p 0.05 ，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性意義； F 值 F0.05 ，P 0.05 ，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)； 對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換， 待滿足正態(tài)或方差齊性要求后， 用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)

11、行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的白細(xì)胞總數(shù)顯著高于陰性對照組，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。5.2 ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)可任選下列方法之一法原理當(dāng) T 淋巴細(xì)胞受 ConA刺激后發(fā)生母細(xì)胞增殖反應(yīng)，活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞通過線粒體水解酶將 MTT（一種淡黃色的唑氮鹽） 分解為蘭紫色結(jié)晶而顯色， 其光密度值能反映細(xì)胞的增殖情況。儀器和材料RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、2- 巰基乙醇（ 2-ME）、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白 A（ConA）、鹽酸、異丙醇、 MTT、Hank's 液、 PBS緩沖液（ pH7.2-7.4 ）紗

12、布、 200 目篩網(wǎng)、 24 孔培養(yǎng)板， 96 孔培養(yǎng)板（平底），手術(shù)器械、大號注射器內(nèi)芯、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)、超凈工作臺、高壓滅菌器、無菌濾器。實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制完全培養(yǎng)液 RPMI1640 培養(yǎng)液過濾除菌，用前加入 10小牛血清， 1 谷氨酰胺（ 200mmol/L），青霉素（ 100U/mL），鏈霉素（ 100ug/L ）及 5×10 5mol/L的 2- 巰基乙醇，用無菌的 1mol/L 的 HCl 或 1mol/L 的 NaOH調(diào) pH 至 7.0-7.2 ，即完全培養(yǎng)液。ConA液 用雙蒸水配制成 100ug/mL 的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱（ -20 ）

13、保存。無菌 Hank's 液用前以 3.5 的無菌 NaHCO3調(diào) pH7.2-7.4 。MTT液將 5mgMTT溶于 1mL pH7.2 的 PBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用。酸性異丙醇溶液96mL 異丙醇中加入 4mL 1mol/L 的 HCl，臨用前配制。脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量（ 3-5ml ）無菌 Hank's 液平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎， 制成單個(gè)細(xì)胞懸液。 經(jīng) 200 目篩網(wǎng)過濾，用 Hank's 液洗 2 次，每次離心 10min（1000r/min ）。然后將細(xì)胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)脾細(xì)胞

14、，或用臺酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在 95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度為 3× 106 個(gè) /mL。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)將細(xì)胞懸液分兩孔加入 24 孔培養(yǎng)板中， 每孔 1mL，一孔加 75lConA 液（相當(dāng)于 7.5 g/mL），另一孔作為對照，置 5CO2，37CO2孵箱中培養(yǎng) 72h。培養(yǎng)結(jié)束前 4h，每孔輕輕吸去上清液 0.7mL，加入 0.7mL 不含小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT（5mg/mL）50l/孔，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，超聲震蕩（2 秒）或人工吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到 96 孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔分裝3 孔作為平

15、行樣，用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570nm波長測定光密度值。也可將溶解液直接移入2mL比色杯中，分光光度計(jì)上在波長 570nm測定 OD值。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算 F值，F(xiàn)值<F0.05, 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值F,P 0.05, 用0.05多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換， 待滿足正態(tài)或方差齊要求后， 用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用加 ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的

16、增殖能力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。注意事項(xiàng)ConA 的濃度很重要，濃度過低不能刺激足夠的細(xì)胞增殖，濃度過高會抑制細(xì)胞增殖，不同批號的 ConA在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試，以找到最佳濃度。法原理由于 MTT 經(jīng)還原所 產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，且溶解甲臜的有機(jī)溶劑有毒性，可選擇 XTT 法替代 MTT 法。其原理是： XTT 是二甲氧唑黃，在電子耦合試劑存在的情況下，活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶可將黃色的XTT 還原成水溶性的橘黃色的甲 臜，生成的甲 臜能夠溶解在組織培養(yǎng)基中， 不形成顆粒， 可直接用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測定吸光值。實(shí)驗(yàn)步驟脾細(xì)胞懸液制備同MTT 法；淋

17、巴細(xì)胞增殖反應(yīng)：調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107，取細(xì)胞懸液100l分別加入96 孔培養(yǎng)板中，一孔加510lConA 液，另一孔作為對照，設(shè)2 個(gè)平行孔，置375CO2 飽和濕度孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，向各孔中加入2050l的 XTT 工作液（按試劑盒說明現(xiàn)用現(xiàn)配） ，孵育 4 小時(shí)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處檢測每孔的光密度。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算 F 值， F 值< F 0.05 , 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值 F0.05 ,P 0.05, 用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

18、；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換， 待滿足正態(tài)或方差齊要求后， 用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用加 ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。注意事項(xiàng)細(xì)胞濃度及培養(yǎng)時(shí)間在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試，以找到最佳效果。溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記酶聯(lián)免疫吸附測定法(BrdU-ELISA 法)原理T 淋巴細(xì)胞在有絲分裂原 ConA等的刺激下產(chǎn)生增殖反應(yīng)， BrdU 可競爭摻入到增殖細(xì)胞中新合成的 DNA鏈內(nèi)，將 BrdU 標(biāo)記的細(xì)胞作為抗原結(jié)合到固相載

19、體表面，加入酶連接的抗 -BrdU 抗體，使 BrdU 抗原與酶標(biāo)抗體充分結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物與底物作用后產(chǎn)生有色物質(zhì)，其光密度可反映細(xì)胞增殖的程度。儀器和材料低溫離心機(jī)，全自動酶標(biāo)儀、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、96 孔培養(yǎng)板（平底）、倒置顯微鏡、移液器、手術(shù)器械、200 目篩網(wǎng)、細(xì)胞活性分析儀；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hank's 液、PBS緩沖液（ pH7.2-7.4 ）、BrdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒（ ELISA）、純凈水、終止液。實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制完全培養(yǎng)液 RPMI1640 培養(yǎng)液過濾除菌， 用前加入 10小牛血清， 1谷

20、氨酰胺（ 200mmol/L），青霉素（ 100U/mL），鏈霉素（ 100g/L ）及 5×105mol/L 的 2- 巰基乙醇，用無菌的 1mol/L 的 HCl 或 1mol/L 的 NaOH調(diào) pH至 7.0-7.2 ，即完全培養(yǎng)液。ConA液 用雙蒸水配制成100ug/mL 的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱（ -20 ）保存。無菌 Hank's 液用前以 3.5 的無菌 NaHCO3調(diào) pH7.2-7.4 。BrdU 標(biāo)記液將標(biāo)記劑（試劑盒 No.1）按 1：100 的比例加到培養(yǎng)液中混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用?？贵w貯存液（母液） 在 Anti-BrdU-POD （試劑盒 No.3

21、）中加 1.1ml 雙蒸水充分混合，存于 -20 備用?？贵w工作液每 100l抗體母液加 10ml 抗體稀釋液（試劑盒No.4），現(xiàn)配現(xiàn)用。洗液每 10ml 清洗緩沖液（試劑盒No.5）加 100ml 雙蒸水。脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's 液平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾，用Hank's 液洗 2 次，每次離心 10min（1000r/min ）。然后將細(xì)胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)脾細(xì)胞，或用臺酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在 95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度為2

22、5;107 個(gè)/mL。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞加入 96 孔培養(yǎng)板中，10l/孔，每份細(xì)胞加 2 孔，第 1 孔再加入 90l1640 培養(yǎng)液，第 2 孔加入 85l1640 培養(yǎng)液和 5.3 lConA，同時(shí)設(shè) 3 個(gè)空白孔，每孔僅加 100l1640 培養(yǎng)液，置 5%CO2、37培養(yǎng)箱孵育 72h，培養(yǎng)結(jié)束前 4 h 加入 BrdU 標(biāo)記液， 10l/孔，培養(yǎng)結(jié)束后離心（ 1000r/min,10min ）, 棄上清，吹干細(xì)胞，放 4冰箱保存待測。酶聯(lián)免疫吸附測定每孔加 200l固定液，常溫放置 30min 后, 吸棄固定液。加入 100lBrdU 抗體工作液， 37孵育 60min；吸棄未結(jié)合

23、的抗體，加 250l洗液洗 3 次，輕拍移去洗液。加底物溶液（含 TMB）100l/孔，常溫孵育 15min。用酶標(biāo)儀測量吸光值，不加終止液時(shí)，測定發(fā)射波長為 370nm（記為 A370），參考波長 492nm（記為A492）；加終止液時(shí)，測定發(fā)射波長為 450nm（記為 A450），參考波長 690nm（記為A690）。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定計(jì)算每孔標(biāo)記指數(shù) （ LI ），LI= （A370- A 空白 370）- （A492 - A 空白 492）或 LI= （A450-A 空白 450）- （ A690- A 空白 690）。用加 ConA孔的 LI 值減去不加 ConA 孔的 LI 值所得

24、的差值代表淋巴細(xì)胞的增殖程度。采用方差分析對標(biāo)記指數(shù)差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算 F 值， F 值< F 0.05 ，則各組均數(shù)間差異無顯著性； F 值 F0.05 ,P 0.05, 用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)； 若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的， 改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的 LI 值差值顯著高于對照組的 LI 值差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。注意事項(xiàng)選擇有絲分裂原時(shí) ConA的濃度很重要， ConA的濃度過高會產(chǎn)

25、生抑制作用，不同批號的 ConA在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試，以找到最佳刺激分裂濃度。5.3遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（ DTH）遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是細(xì)胞免疫的體內(nèi)檢測法，當(dāng)致敏 T 細(xì)胞再次與抗原接觸，引起 T 細(xì)胞活化，釋放出多種細(xì)胞因子， 致局部組織發(fā)生以單核細(xì)胞為主的炎癥反應(yīng)，一般在 2448h 達(dá)高峰?？扇芜x下列方法之一試驗(yàn)。二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH（耳腫脹法）原理二硝基氟苯（ DNFB）稀釋液可與腹壁皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺激 T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞。47d 后再將其涂抹于耳部進(jìn)行抗原攻擊，使局部腫脹，一般在抗原攻擊后24 48h 達(dá)高峰，其腫脹程度可以反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。材料DNFB 、丙酮、

26、麻油、硫化鋇、打孔器。實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制DNFB溶液 DNFB 溶液應(yīng)新鮮配制，稱取DNFB50mg，置清潔干燥小瓶中，將預(yù)先配好的 5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油 =1：1），倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封。混勻后，用250l注射器通過瓶蓋取用。致敏每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3cm× 3cm、用 DNFB 溶液 50l均勻涂抹致敏。的產(chǎn)生與測定5 天后，用 DNFB 溶液 10 l均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊。攻擊后24h 頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑 8mm的耳片，稱重。數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差

27、齊，計(jì)算 F 值， F 值< F 0.05 , 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值 F0.05 ,P 0.05, 用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換， 待滿足正態(tài)或方差齊要求后， 用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受試樣品組的重量差值顯著高于與對照組的重量差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。注意事項(xiàng)：操作時(shí)應(yīng)避免 DNFB與皮膚接觸。綿羊紅細(xì)胞（ SRBC）誘導(dǎo)小鼠 DTH（足跖增厚法）原理SRBC 可刺激 T 淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞，4 天

28、后，當(dāng)再以 SRBC攻擊時(shí)，攻擊部位出現(xiàn)腫脹，其腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。儀器與材料游標(biāo)卡尺（精密度0.02mm）、 SRBC、微量注射器（ 50l）、足趾容積測量儀。實(shí)驗(yàn)步驟致敏小鼠用 2 (v/v)SRBC 腹腔或靜脈免疫，每只鼠注射 0.2mL（約1×108 個(gè) SRBC）。的產(chǎn)生與測定 免疫后 4 天，測量左后足跖部厚度或腫脹度，然后在測量部位皮下注射 20 (v/v)SRBC ，每只鼠 20l（約 1× 108 個(gè) SRBC），注射后于 24h 測量左后足跖部厚度或腫脹度，同一部位測量三次，取平均值。測量方法：用游標(biāo)卡尺測量肉眼讀數(shù)。 或用足趾容積測量儀進(jìn)

29、行測量足跖部腫脹度，操作方法按儀器操作指引進(jìn)行。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算 F 值， F 值< F 0.05 , 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值 F0.05 ,P 0.05, 用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換， 待滿足正態(tài)或方差齊要求后， 用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以攻擊前后足跖厚度或腫脹度的差值來表示DTH 的程度。受試樣品組的差值顯著高于對照組的差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。注意事項(xiàng)前后兩次測量

30、足跖厚度時(shí)， 最好由專人來進(jìn)行。 卡尺緊貼足跖部， 但不要加壓，否則會影響測量結(jié)果。攻擊時(shí)所用的 SRBC要新鮮（保存期不超過1 周）。5.4抗體生成細(xì)胞檢測（改良法）原理溶血空斑試驗(yàn)是檢測產(chǎn)生 IgM、IgG 等抗體分泌細(xì)胞數(shù)體外試驗(yàn)法。用綿羊紅細(xì)胞（ SRBC）免疫的小鼠脾細(xì)胞懸液與一定量的 SRBC混合，在補(bǔ)體參與下，使抗體分泌細(xì)胞周圍的 SRBC溶解，形成肉眼可見的空斑。儀器和材料溶血空斑自動圖象分析儀、 二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴、離心機(jī)、手術(shù)器械、 200 目篩網(wǎng)、 SRBC、補(bǔ)體（豚鼠血清）、Hank's 液、RPMI1640培養(yǎng)液、 SA緩沖液（ C4H4 N2O3 0.

31、46g, MgCl2 0.1g, CaCl2.2H2 O 0.2g, NaCl 8.38g, NaHCO30.252g and C8H11N2 NaO3 0.3g, 加蒸餾水至 1000mL）、滅菌生理鹽水、瓊脂糖。實(shí)驗(yàn)步驟 ：綿羊頸靜脈取血， 將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中， 朝一個(gè)方向搖動，以脫纖維，生理鹽水 2500rpm/min ，15min，洗滌 3 次，制備壓積SRBC，放入 4冰箱保存?zhèn)溆?。完全培養(yǎng)基的制備：新生小牛血清經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（ v/v ，5：1）吸收，4， 30-60min 后，加入不完全培養(yǎng)基 RPMI 1640 中，制備成含 20%小牛血清的完全培養(yǎng)基。補(bǔ)體制備股動

32、脈取血，靜置30-60min ，2500rpm/min，15min 分離血清，將 5-10 只豚鼠血清混合后，與壓積SRBC以 5：1（v/v ）比例混合， 4冰箱放置 30-60min ，間或震蕩， 2500rpm/min，15min 分離血清，分裝， -80 冰箱保存。用時(shí)以完全培養(yǎng)基1：10（v/v ）比例稀釋。免疫動物壓積 SRBC以生理鹽水制成2%（v/v ）的細(xì)胞懸液（約1× 108 個(gè) SRBC），每只鼠腹腔注射 0.2mL。脾細(xì)胞懸液制備將 SRBC免疫 4-5 天后的小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾臟，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液

33、， 200 目篩網(wǎng)過濾， 1000rpm/min， 10min，去上清， Hank液洗 2 遍，以完全培養(yǎng)基 RPMI 1640 制備成 5×106 1×107 個(gè)細(xì)胞 /mL 的脾細(xì)胞懸液?？瞻叩臏y定底層培養(yǎng)基制備0.5g 瓊脂糖加入 100mL滅菌生理鹽水中，加熱溶解，待溫度于 50左右時(shí)，以 1mL/孔的量加至六孔培養(yǎng)板中，瓊脂凝固后備用。頂層培養(yǎng)基制備0.5g瓊脂糖加入 100mLHank s 液中（PH7.2-7.4 ）,加熱溶解，以 0.5mL/ 試管的量加至46-50 恒溫的試管中。鋪板： 50 l20%SRBC（生理鹽水配制，v/v ）、 200l脾細(xì)胞懸液

34、先后加入含有 0.5mL 頂層的試管中，迅速混勻，倒入六孔板中并鋪平頂層混合液，每個(gè)樣本做兩個(gè)平行孔?？瞻邷y定：已制備好培養(yǎng)板放入37、 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 1h，然后每孔加入 500l以完全培養(yǎng)基稀釋的補(bǔ)體（v/v ， 1： 10），繼續(xù)孵育 2h，自動圖象分析儀讀取溶血空斑圖象分析軟件計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。取平行孔空斑數(shù)的平均值為樣本的溶血空斑數(shù)值，以空斑數(shù)/10 6 脾細(xì)胞表示。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算 F 值，F(xiàn) 值< F0.05, 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性； F 值 F0.05,P 0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)

35、對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后， 用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用空斑數(shù) /10 6 脾細(xì)胞或空斑數(shù) / 全脾細(xì)胞來表示，受試樣品組的空斑數(shù)顯著高于對照組的空斑數(shù)，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。5.5血清溶血素的測定可任選下列方法之一。血凝法原理用 SRBC免疫動物后，產(chǎn)生抗 SRBC抗體（溶血素），利用其凝集 SRBC的程度來檢測溶血素的水平。儀器和材料SRBC 、生理鹽水、微量血凝實(shí)驗(yàn)板、離心機(jī)實(shí)驗(yàn)步驟綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)方向搖動，

36、以脫纖維，放入4冰箱保存?zhèn)溆?，可保? 周。免疫動物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3 次，每次離心(2000r/min)10min。將壓積 SRBC用生理鹽水配成2（ v/v ）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射 0.2ml 進(jìn)行免疫。 45d 后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min 離心 10min，收集血清。凝集反應(yīng)用生理鹽水將血清倍比稀釋， 將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100l，再加入 100l0.5 (v/v) 的 SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37溫箱孵育 3h，觀察血球凝集程度。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一

37、般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算 F 值， F 值< F 0.05 , 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值 F0.05 ,P 0.05, 用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換， 待滿足正態(tài)或方差齊要求后， 用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。血清凝集程度一般分為5 級（ 0）記錄，按下式計(jì)算抗體積數(shù)，受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于對照組的抗體水平，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性?？贵w水平（ S1+2S+3S3nSn）式中 1、2、3n 代表對倍稀釋的指

38、數(shù)， S 代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0 級紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清皙。級紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成園點(diǎn)狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞。級凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個(gè)疏松的紅點(diǎn)。級凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層, 中心隱約可見一個(gè)小紅點(diǎn)。級凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時(shí)成卷折狀。注意事項(xiàng)血清稀釋時(shí)要充分混勻。最后一個(gè)稀釋度應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。半數(shù)溶血值（ HC50）的測定原理用 SRBC免疫動物后，產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素），在補(bǔ)體參與下，與SRBC一起孵育，可發(fā)生溶血反應(yīng)， 釋放血紅蛋白， 通過測定血

39、紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量。儀器和材料分光光度計(jì)、全自動酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、96 孔培養(yǎng)板、離心機(jī)、恒溫水浴、SRBC、補(bǔ)體（豚鼠血清）、SA緩沖液（ C4H4N2O3 0.46g, MgCl2 0.1g, CaCl2.2H2O 0.2g, NaCl 8.38g, NaHCO 3 0.252g and C 8H11N2 NaO3 0.3g, 加蒸餾水至 1000mL）、都氏試劑（碳酸氫鈉 1.0g 、高鐵氰化鉀 0.2g 、氰化鉀 0.05g ，加蒸餾水至 1000mL）實(shí)驗(yàn)步驟綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個(gè)方向搖動，以脫纖維，放入4冰箱保存?zhèn)溆?，可保? 周

40、。制備補(bǔ)體采集豚鼠血，分離出血清（至少5 只豚鼠的混合血清），將 1mL壓積 SRBC加入到 5mL豚鼠血清中，放 4冰箱 30min，經(jīng)常振蕩， 離心取上清，分裝， 70保存。用時(shí)以 SA緩沖液按 18 稀釋。免疫動物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3 次，每次離心(2000r/min)10min。將壓積 SRBC用生理鹽水配成2（ v/v ）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射 0.2mL 進(jìn)行免疫。 45d 后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，使血清充分析出， 2000r/min離心 10min，或 6000r/min,4min,收集血清。5.5.2.3.4 溶血反應(yīng)測定檢測方法 1（分光光度

41、計(jì)測定）：取血清用 SA緩沖液稀釋（一般為 200 500 倍）。將稀釋后的血清 1mL置試管內(nèi)，依次加入 10(v/v)SRBC 0.5mL ，補(bǔ)體 1mL（用 SA液按 1:8 稀釋）。另設(shè)不加血清的對照管（以 SA 液代替）。置 37恒溫水浴中保溫 1530min 后，冰浴終止反應(yīng)。 2000r/min 離心 10min。取上清液 1mL，加都氏試劑 3mL，同時(shí)取10(v/v)SRBC 0.25mL 加都氏試劑至 4mL，充分混勻，放置 10min 后，于 540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。檢測方法 2( 全自動酶標(biāo)儀測定 ) ：設(shè)樣品孔和空白對照孔，樣品孔：取血清10

42、l,用 1mL1:5 稀釋的 SA緩沖液稀釋；每孔加入稀釋后的血清100l；空白對照孔：每孔加入100l1:5 稀釋的SA緩沖液，再依次加入 10 (v/v)SRBC 50 l，補(bǔ)體 100l（用 SA溶液或 PBS溶液按 1:8 稀釋），置 37恒溫水浴中保溫 30min，1500r/min 離心 10min。然后樣品孔和空白對照孔各取上清液 50l加入另一個(gè) 96 孔培養(yǎng)板內(nèi) , 加都氏試劑150l。同時(shí)設(shè)半數(shù)溶血孔 ,加入 10(v/v)SRBC 12.5 l,再加都氏試劑至 200l。用震蕩器充分混勻， 放置 10min 后，于 540nm處用全自動酶標(biāo)儀測定各孔光密度值。數(shù)據(jù)處理及結(jié)

43、果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算 F 值， F 值< F 0.05 , 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值 F0.05 ,P 0.05, 用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換， 待滿足正態(tài)或方差齊要求后， 用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下列公式計(jì)算：樣品光密度值樣品 HC50×稀釋倍數(shù)SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值樣品光密度值- 空白光密度值或樣品 HC50×稀釋倍數(shù)S

44、RBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值- 空白光密度值受試樣品組的 HC50 顯著高于對照組的HC50，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。5.6小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)原理在一定范圍內(nèi)，碳顆粒的清除速率與其劑量呈指函數(shù)關(guān)系。以血碳濃度對數(shù)值為縱座標(biāo)，時(shí)間為橫座標(biāo)，兩者呈直線關(guān)系。此直線斜率(K)可表示吞噬速率。動物肝、脾重量影響吞噬速率，一般以校正吞噬指數(shù)a 表示。儀器和試劑分光光度計(jì)、全自動酶標(biāo)儀、計(jì)時(shí)器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3實(shí)驗(yàn)步驟溶液配制注射用墨汁將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋34 倍。Na2CO3溶液取 0.1gNa2CO3，加蒸餾水至 100mL。注射墨汁稱體重，從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁，按每 1

45、0g 體重0.1mL 計(jì)算。待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。測定注入墨汁后 2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20l，并立即將其加到2mL0.1%Na2CO3 溶液中。用分光光度計(jì)或全自動酶標(biāo)儀在600nm 波長處測光密度值（ OD），以 Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)a：lgOD1-lgOD 2Kt2t 1吞噬指數(shù)體重a 肝重脾重×3K數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算 F值，F(xiàn)值<F0.05, 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F

46、值F,P 0.05, 用0.05多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)； 對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換， 待滿足正態(tài)或方差齊要求后， 用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組的吞噬指數(shù)，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。注意事項(xiàng)靜脈注入碳粒的量、取血時(shí)間、取血量一定要準(zhǔn)確。墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，臨用前應(yīng)搖勻。使用新的墨汁時(shí)，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前摸索一個(gè)最適墨汁注入量，即正常小鼠在 2030min 內(nèi)不易廓清。5.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球試驗(yàn)方法原理：激活的巨噬細(xì)胞具有吞噬表面帶有陽性可調(diào)理基團(tuán)的熒

47、光微球，將含有巨噬細(xì)胞的腹腔液與調(diào)理過的熒光微球孵育一定時(shí)間后，去除多余未被吞噬的微球，收集以巨噬細(xì)胞為主的標(biāo)本，用流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞，計(jì)數(shù)吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞，計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)， 據(jù)此判定巨噬細(xì)胞的吞噬能力。儀器和材料Hank's 液，小牛血清， PBS緩沖液，生理鹽水，熒光微球(2 m)， 1 小牛血清白蛋白（ BSA）。流式細(xì)胞儀，超聲清洗儀，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，離心機(jī)，6 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞刮，過濾器（ 75 m）, 流式上樣管，流式細(xì)胞儀專用鞘液，移液槍及吸頭，白細(xì)胞計(jì)數(shù)板，手術(shù)器械一套，注射器，滴管，膠頭吸管。實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制含 5小牛血清的Hank's

48、液：取 10ml 小牛血清加入 200ml Hank's液中，混勻，臨用前配。PBS緩沖液的配制方法：KH2PO4 6.66g ，Na2HPO4·12HO 6.38g ，將上述試劑溶于 1000ml 蒸餾水中調(diào) PH值至 7.2 即成。綿羊紅細(xì)胞懸液的配制方法：實(shí)驗(yàn)前取綿羊頸靜脈血，置于盛有玻璃珠（ 20 個(gè)左右）的三角瓶內(nèi)，連續(xù)順一個(gè)方向充分搖動5 10 分鐘，除去纖維蛋白，用生理鹽水洗滌3 次，每次 1500rPm，離心 10 分鐘，4冰箱保存。實(shí)驗(yàn)前棄去上清，按血球壓積用生理鹽水配制成2的紅細(xì)胞懸液。BSA的配制： 0.5gBSA 溶于 50mlPBS緩沖液中，臨用前配

49、較好。熒光微球預(yù)調(diào)理： 100l熒光微球與10ml 1 BSA 37避光孵育30min,超聲處理 5min，臨用前配。腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球過程實(shí)驗(yàn)前 4 天給每只小鼠腹腔注射0.2ml 2%綿羊血紅細(xì)胞激活小鼠巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's 液 3ml/ 只，輕輕按揉腹部 20 次，以充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞，然后將腹壁剪開一個(gè)小口，吸取腹腔洗液 2ml 用 75 m過濾器過濾至試管內(nèi)，調(diào)整巨噬細(xì)胞數(shù)為4 6× 105/ml 。用移液槍吸取 1ml 腹腔洗液于 6 孔培養(yǎng)板中，加入已經(jīng)預(yù)調(diào)理過的熒光微球（1× 107/ 板）

50、，37二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（或室溫）避光孵育 90 120 分鐘，孵育結(jié)束后棄上清（含未貼壁細(xì)胞和多余熒光微球） ，每次使用 1.0mlPBS 緩沖液輕輕洗滌 2 次，去上清后再加入 4 PBS緩沖液 0.3ml ，用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞，輕輕吹打均勻后經(jīng) 75 m過濾器過濾后上機(jī)分析。流式細(xì)胞儀檢測分析設(shè)門：首先設(shè)立 FSC-SSC二維散點(diǎn)圖，通過調(diào)節(jié) FSC和 SSC電壓值，以巨噬細(xì)胞設(shè)門界定分析的巨噬細(xì)胞群， 最大限度地排除其它有核細(xì)胞、 細(xì)胞碎片等的干擾；獲?。涸跓晒馕⑶虬l(fā)射光的熒光通路檢測巨噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，每份樣本獲取 5000 個(gè)巨噬細(xì)胞，數(shù)據(jù)可顯示于二維散點(diǎn)圖和直方圖中。在二維散點(diǎn)圖中可通過設(shè)門圈定未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群和吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群；在直方圖中可通過標(biāo)尺標(biāo)定未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群和吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群，全部數(shù)據(jù)經(jīng)相關(guān)軟件分析未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞和吞噬不同數(shù)量熒光微球的巨噬細(xì)胞的比例。吞噬一個(gè)熒光微球吞噬二個(gè)熒光微球圖 1吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞圖( 熒光顯示400 )R2R3 R4 R5 R6R1圖 2 吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞FSC-SSC 和 FL2-SSC 二維散點(diǎn)圖R1: 總巨噬細(xì)胞群R2: 未吞噬熒光微球的巨