常用飼用酶制劑檢測(cè)方法介紹實(shí)用教案

1、飼料(slio)酶制劑 現(xiàn)市場(chǎng)上常見(jiàn)(chn jin)的飼料酶制劑多為復(fù)合酶，其成分木聚糖酶、-淀粉酶、（酸性或中性）蛋白酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、-葡聚糖酶中的幾種。 如何準(zhǔn)確檢測(cè)其中的一種酶制劑的活性？第1頁(yè)/共37頁(yè)第一頁(yè)，共38頁(yè)。酶制劑檢測(cè)(jin c)原理 酶與一般催化劑最主要的區(qū)別之一是它具有(jyu)高度的專一性。第2頁(yè)/共37頁(yè)第二頁(yè)，共38頁(yè)。酶制劑檢測(cè)(jin c)原理 樣品檢測(cè)： 酶制劑檢測(cè)應(yīng)用酶對(duì)底物專一性的特點(diǎn)，采用高純度底物，專一檢測(cè)某種酶制劑對(duì)底物的降解，然后測(cè)定產(chǎn)物(chnw)含量（分光光度計(jì)）。 標(biāo)準(zhǔn)曲線： 通過(guò)用其高純度的產(chǎn)物(chnw)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)

2、分光光度計(jì)的讀數(shù)查出對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物(chnw)含量，然后計(jì)算酶活。第3頁(yè)/共37頁(yè)第三頁(yè)，共38頁(yè)。酶制劑檢測(cè)(jin c)原理第4頁(yè)/共37頁(yè)第四頁(yè)，共38頁(yè)。A. -淀粉酶 1.碘淀粉顯色法 利用淀粉遇碘變藍(lán)的反應(yīng)，檢測(cè)出未被淀粉酶分解的淀粉，運(yùn)用(ynyng)分光光度計(jì)測(cè)定碘反應(yīng)藍(lán)值的變化，然后查表讀取酶活。 特點(diǎn)：測(cè)定-淀粉酶的碘淀粉顯色法是專一性較高、操作較簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性也較高的方法。第5頁(yè)/共37頁(yè)第五頁(yè)，共38頁(yè)。A. -淀粉酶 2. DNS顯色法 原理：淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，將3，5二硝基水楊酸試劑還原(hun yun)生成3氨基5硝基水楊酸的顯色基團(tuán)，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺

3、與糖的濃度成正比，故可求出麥芽糖的含量。 特點(diǎn)：專一性不高，易受其他淀粉酶（主要是-淀粉酶）的干擾，因此，碘淀粉顯色法應(yīng)用較多。第6頁(yè)/共37頁(yè)第六頁(yè)，共38頁(yè)。B. 蛋白酶 1. Folin法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，產(chǎn)生酪氨酸等酚基氨基酸，在堿性條件下，酚基氨基酸與Folin試劑反應(yīng)生產(chǎn)藍(lán)色物質(zhì)(wzh)，于680nm比色測(cè)定光吸收值，計(jì)算酶活力。 該法的準(zhǔn)確性及靈敏度都較高，在國(guó)內(nèi)已得到公認(rèn)，是應(yīng)用最廣的方法，我國(guó)的部頒標(biāo)準(zhǔn)及各大酶制劑生產(chǎn)企業(yè)都采用該法。第7頁(yè)/共37頁(yè)第七頁(yè)，共38頁(yè)。B. 蛋白酶 2. 紫外分光(fn un)光度法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，產(chǎn)生酪氨酸等酚基氨基酸，利

4、用酪氨酸在280nm處有特征性吸收峰,測(cè)定計(jì)算酶活。 特點(diǎn)：紫外線操作比Folin法簡(jiǎn)便，但靈敏度僅為Folin法的1/10。第8頁(yè)/共37頁(yè)第八頁(yè)，共38頁(yè)。C. 產(chǎn)還原(hun yun)糖酶制劑 現(xiàn)今采用的還原糖法通常是比色法，黃色的3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顯色反應(yīng)與不同聚合度同源(tn yun)寡糖還原性末端的含量成正比。 特點(diǎn)：易于操作，價(jià)格低廉，方便快速，重復(fù)性好 第9頁(yè)/共37頁(yè)第九頁(yè)，共38頁(yè)。C. 產(chǎn)還原(hun yun)糖酶制劑 能產(chǎn)生還原糖的酶有：包括纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶等。 半纖維

5、素酶是分解半纖維素(包括各種( zhn)降戊糖與聚己糖)的一類酶的總稱,主要包括-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。第10頁(yè)/共37頁(yè)第十頁(yè)，共38頁(yè)。C. 產(chǎn)還原(hun yun)糖酶制劑 1. 還原糖法 2. 粘度(zhn d)法 3. 瓊脂平板擴(kuò)散法 4. 可溶性的染色底物第11頁(yè)/共37頁(yè)第十一頁(yè)，共38頁(yè)。1. 還原(hun yun)糖法 還原(hun yun)糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原(hun yun)糖，雙糖和多糖不一定是還原(hun yun)糖，其中乳糖和麥芽糖是還原(hun yun)糖，蔗糖和淀粉是非還原(hun yun)糖。第12頁(yè)/共37頁(yè)第十

6、二頁(yè)，共38頁(yè)。2. 粘度(zhn d)法 原理：酶作用于具粘性的非淀粉多糖底物，使粘度下降，通過(guò)粘度計(jì)測(cè)定流速改變來(lái)計(jì)算酶活力。該法靈敏度較高，可形象反映外切酶在動(dòng)物體內(nèi)的作用方式，較適宜于飼用酶活性的測(cè)定。 特點(diǎn)：重復(fù)性差 ，費(fèi)時(shí)、操作(cozu)復(fù)雜、單位難以換算成國(guó)際單位 。第13頁(yè)/共37頁(yè)第十三頁(yè)，共38頁(yè)。3. 瓊脂(qingzh)平板擴(kuò)散法 原理：將NSPS 底物與瓊脂混融制成瓊脂平板，將酶樣點(diǎn)于瓊脂板上的小孔中，培養(yǎng)一定時(shí)間，選用能與底物發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑染色，顯示出染色背景區(qū)和無(wú)色透明的水解區(qū)，水解區(qū)直徑與酶量的對(duì)數(shù)呈正相關(guān)，由水解區(qū)直徑計(jì)算酶活力。 特點(diǎn)：靈敏度高，是還

7、原糖法的100倍，測(cè)定(cdng)所需樣品量微，無(wú)需特殊設(shè)備。第14頁(yè)/共37頁(yè)第十四頁(yè)，共38頁(yè)。4. 可溶性的染色(rns)底物 原理：人工合成的含色原基團(tuán)的底物在酶的作用下釋放出有色物質(zhì)，利用分光(fn un)光度計(jì)比色測(cè)定有色物質(zhì)含量，計(jì)算酶活力。 特點(diǎn)：重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，靈敏度較高 ，但合成底物與天然底物有區(qū)別，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性可能有影響 ，并且底物昂貴。第15頁(yè)/共37頁(yè)第十五頁(yè)，共38頁(yè)。D. 脂肪酶 原理：脂肪酶在一定條件下 ，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油，所釋放(shfng)的脂肪酸，可用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行中和滴定，用pH或酚酞指示反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)消耗的堿量，計(jì)算其酶活

8、。 反應(yīng)式為： RCOOH + NaOH RCOONa + H2O第16頁(yè)/共37頁(yè)第十六頁(yè)，共38頁(yè)。E. 植酸酶 1.國(guó)標(biāo)法（釩鉬酸銨法） 原理：利用植酸酶水解植酸鈉產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷，再加入酸性鉬釩試劑終止(zhngzh)反應(yīng)，同時(shí)與無(wú)機(jī)磷反應(yīng)生成黃色釩鉬磷絡(luò)和物，在415nm比色測(cè)定含磷量，再以標(biāo)準(zhǔn)植酸酶為參照物，間接計(jì)算被測(cè)樣品中植酸酶的含量。第17頁(yè)/共37頁(yè)第十七頁(yè)，共38頁(yè)。E. 植酸酶 2.硫酸亞鐵鉬藍(lán)法 原理：利用植酸酶可以水解植酸酶釋放無(wú)機(jī)磷的原理，通過(guò)加入鹽酸使水解反應(yīng)停止(tngzh)，然后加入鉬酸銨及FeSO47H2O的混合液使溶液顯色，在720nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸收值，以標(biāo)

9、準(zhǔn)酶為參照物，間接計(jì)算被測(cè)樣品中植酸酶的含量。 第18頁(yè)/共37頁(yè)第十八頁(yè)，共38頁(yè)。E. 植酸酶 3.丙酮磷鉬酸銨法 原理：磷酸鹽與過(guò)量(guling)的鉬酸銨在酸性條件下混合后，可慢慢生成黃色磷鉬酸銨，加入丙酮后使黃色物質(zhì)提出來(lái)，在355nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，靈敏度增加10倍。 特點(diǎn)：釩鉬酸銨法靈敏度最高，丙酮法穩(wěn)定性最好，抗干擾能力較強(qiáng)。第19頁(yè)/共37頁(yè)第十九頁(yè)，共38頁(yè)。E. 植酸酶 4. VC鉬藍(lán)法 原理：該方法是利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無(wú)機(jī)磷的原理，通過(guò)加入三氯乙酸使反應(yīng)停止，然后加人鉬酸銨與VC的混合液，使溶液(rngy)顯色，在820nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，再以標(biāo)準(zhǔn)磷溶液(r

10、ngy)的吸光度及磷溶液(rngy)濃度對(duì)應(yīng)的酶活單位建立直線回歸方程，最后以待測(cè)樣品吸光度代人方程，計(jì)算出酶活性。 第20頁(yè)/共37頁(yè)第二十頁(yè)，共38頁(yè)。影響酶活力(hul)的主要因素A.底物種類(zhngli)和濃度B.酶活力單位定義C.酶反應(yīng)pH值D.酶反應(yīng)溫度E.酶反應(yīng)時(shí)間第21頁(yè)/共37頁(yè)第二十一頁(yè)，共38頁(yè)。A.A.底物(d w)(d w)種類和濃度 同種方法采用不同底物測(cè)定，結(jié)果相差很大。 例如木聚糖酶的檢測(cè)(jin c)，燕麥木聚糖與樺木木聚糖的測(cè)定結(jié)果就有明顯差距。 第22頁(yè)/共37頁(yè)第二十二頁(yè)，共38頁(yè)。底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度(fn yng s d)的影響圖第23頁(yè)/共37頁(yè)

11、第二十三頁(yè)，共38頁(yè)。B. 酶活力(hul)單位定義 國(guó)際酶學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化(zhunhu)1umol底物的酶量，稱一個(gè)國(guó)際單位（IU）。 酶活計(jì)算公式： 酶活性 (U/g) = A D 1000 0.210150.13 W其中:A 比色測(cè)定的木糖量，mg/ml；D 稀釋倍數(shù)；1000 當(dāng)量換算因數(shù)，mmol- umol ；W 酶樣品重量，g；150.13 木糖的分子量，mg/mmol；10 反應(yīng)時(shí)間，分鐘。第24頁(yè)/共37頁(yè)第二十四頁(yè)，共38頁(yè)。B. 酶活力(hul)單位定義 木聚糖酶的活性定義A：在測(cè)定(cdng)條件下，1秒鐘從燕麥木聚糖中產(chǎn)生1nmol木糖所需

12、的酶量。 酶活計(jì)算公式： 酶活（IU）= A D 1,000,000 0.2 600 150.13 W 其中: A 比色測(cè)定(cdng)的木糖量，mg/ml； D 稀釋倍數(shù)； 1,000,000 當(dāng)量換算因數(shù)，mmol- nmol； W 酶樣品重量，g； 150.13 - 木糖的分子量，mg/mmol。 600 反應(yīng)時(shí)間，秒。第25頁(yè)/共37頁(yè)第二十五頁(yè)，共38頁(yè)。C. 酶反應(yīng)(fnyng)pH值 pH影響酶活力的因素: 影響酶蛋白構(gòu)象，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)使酶變性(binxng)。影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。影響酶和底物分子中另一些基團(tuán)解離，這些基團(tuán)的離子

13、化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構(gòu)象。影響酶與底物的結(jié)合，極度pH的條件引起酶蛋白的變性(binxng)。第26頁(yè)/共37頁(yè)第二十六頁(yè)，共38頁(yè)。C. 酶反應(yīng)(fnyng)pH值最適pH：使酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)的介質(zhì)(jizh)pH。 最適pH一般接近在48 之間.第27頁(yè)/共37頁(yè)第二十七頁(yè)，共38頁(yè)。D. 酶反應(yīng)(fnyng)溫度 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響(yngxing)有兩個(gè)方面： 提高溫度，加快反應(yīng)速度。 提高溫度，酶變性失活。 這兩種因素共同作用，在小于最適溫度時(shí)，前一種因素為主；在大于最適溫度時(shí)，后一種因素為主。 最適溫度就是這兩種因素綜合作用的結(jié)果。 第28頁(yè)/共37頁(yè)第二十八

14、頁(yè)，共38頁(yè)。D. 酶反應(yīng)(fnyng)溫度第29頁(yè)/共37頁(yè)第二十九頁(yè)，共38頁(yè)。E. 酶反應(yīng)時(shí)間 酶反應(yīng)方程式： 隨著生成物濃度的增加，酶反應(yīng)速度減慢( jin mn)，當(dāng)生成物達(dá)到某一濃度，酶反應(yīng)即停止。E + S ES E + PK3K4K1K2第30頁(yè)/共37頁(yè)第三十頁(yè)，共38頁(yè)。E. 酶反應(yīng)時(shí)間 從圖中可以看到，反應(yīng)速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，由于底物濃度降低，產(chǎn)物反饋抑制，逆反應(yīng)速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反應(yīng)速度逐漸(zhjin)下降，最后完全停止。第31頁(yè)/共37頁(yè)第三十一頁(yè)，共38頁(yè)。E. 酶反應(yīng)時(shí)間 在測(cè)定酶促反應(yīng)速度(fn yng s d)

15、時(shí)，要避免以上干擾因素，必須在酶促反應(yīng)初期進(jìn)行，在最初這段時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速度(fn yng s d)稱之為反應(yīng)初速度，在過(guò)量的底物存在下，反應(yīng)初速度與酶濃度成正比。第32頁(yè)/共37頁(yè)第三十二頁(yè)，共38頁(yè)。F.激活劑、抑制劑 凡是能提高酶活性的物質(zhì)，都稱為激活劑。 激活劑作用包括兩種情況：一種是由于激活劑的存在，使一些本來(lái)有活性的酶活性進(jìn)一步提高，這一類激活劑主要是離子或簡(jiǎn)單有機(jī)(yuj)化合物。另一種是激活酶原，無(wú)活性有活性，這一類激活劑可能是離子或蛋白質(zhì)。第33頁(yè)/共37頁(yè)第三十三頁(yè)，共38頁(yè)。G.舉例(j l) 2種木聚糖酶測(cè)定方法的比較(bjio)測(cè)定條件測(cè)定條件 方法1 方法方法2 溫度

16、溫度 55 50 pH 5.3 5.5緩沖液緩沖液 0.05M醋酸鈉緩沖液 0.1M 醋酸鈉緩沖液 反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)時(shí)間 10min 30min 底物濃度底物濃度 1木聚糖 1.2%木聚糖 加酶量加酶量 0.2ml 1ml 底物量底物量 1.8ml 1ml 反應(yīng)終止液反應(yīng)終止液 DNS 2ml DNS 3ml 顯色時(shí)間顯色時(shí)間 10min 10min 加水量加水量 10ml 第34頁(yè)/共37頁(yè)第三十四頁(yè)，共38頁(yè)。G.舉例(j l)木聚糖酶測(cè)定(cdng)結(jié)果標(biāo)識(shí)值(U/g)方法1 (U/g)方法2(U/g)樣本129,00025,868 11,189 樣本250,00039,918 30,583 第35頁(yè)/共37頁(yè)第三十五頁(yè)，共38頁(yè)。THE ENDTHANK YOU!第36頁(yè)/共37頁(yè)第三十六頁(yè)，共38頁(yè)。謝謝您的觀看