細(xì)胞增殖MTT檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

1、細(xì)胞增殖檢測(cè)： MTT 實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)MTT 分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑 3-（ 4，5）-dimethylthiahiazo （ -z-y1 ）-3，5-di- phenytetrazoliumromide ， MTT 噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)。 MTT 為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈， 在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素 C 的作用下 tetrazolium 環(huán)開裂， 生成藍(lán)色的 formazan 結(jié)晶， formazan 結(jié)晶的生 成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原）。還原生成的 formazan 結(jié) 晶可在含50%的N, N-二甲基甲

2、酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7 ）的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo) 儀測(cè)定 490 nm 處的光密度 OD 值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用 DMSO 來(lái)溶解。MTT 粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來(lái)避 光，覺得這樣比較好。一、步驟1、接種細(xì)胞用含 10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔100010000 個(gè)細(xì)胞接種到 96 孔板，每孔體積200ul。2、培養(yǎng)細(xì)胞同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng) 35天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。3、呈色培養(yǎng) 35 天后，每孔加 MTT 溶液（ 5mg/ml 用 PBS 配） 20ul.

3、繼續(xù)孵育 4 小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi) 培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加 150ul DMSO ，振蕩 10 分鐘，使結(jié) 晶物充分融解。4、比色選擇 490nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo) 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。二、注意事項(xiàng)1、選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。2、 避免血清干擾：一般選小于10%的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。3、設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào) 零。MTT 實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在 0-0.7 之間，超出這個(gè)范圍就不是直

4、線關(guān)系，IC50 是半抑制率，意思是抑制率 50的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計(jì)算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50%抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品 2 倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！三、舉例各組濃度 0.1、0.01、0.001、0.0001 、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為 10，最大濃度為 0.1，抑制率為 0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21， 0.06。代入計(jì)算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lg

5、I=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1* (3.1-(3-0.95-0.06) /4)=-3.6025IC50=0.00025有一個(gè)公式可供參考；lgIC50=Xm-I (P-(3-Pm-Pn )/4)Xm ：lg 最大劑量I: Ig (最大劑量/相臨劑量)P:陽(yáng)性反應(yīng)率之和Pm：最大陽(yáng)性反應(yīng)率Pn：最小陽(yáng)性反應(yīng)率抑制率 =1- 加藥組 OD 值/對(duì)照組 OD 值公式中的最大最小陽(yáng)性反應(yīng)率就是最大最小抑制率例：用 96孔板培養(yǎng) SMMC-7721 肝癌做 MTT 測(cè)細(xì)胞活力， 應(yīng)該加多少 1640 培養(yǎng)基，多少 MTT 和 DMSO 合適 ? 根據(jù)書上說(shuō)的加 200ul1640，

6、20ulMTT ，150ulDMSO 加 DMSO 之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于 DMSO 溶解 甲臜顆粒進(jìn)行比色測(cè)定一般每孔4000個(gè)細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在 20000個(gè)/ml, MTT加20ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，注意不 要將甲瓉洗掉，然后每孔加 150ul DMSO ，在脫色搖床上振蕩 10 分鐘，然后測(cè)吸光值。一般要低于IC50，避免非調(diào)亡性殺傷的細(xì)胞太多， 造成流式細(xì)胞儀檢測(cè)碎片太多。 我一般用1/2-1/3的IC50， 作用時(shí)間為36h。一般腫瘤細(xì)胞系空白處理的調(diào)亡率應(yīng)低于 1%，用藥后一般為 5-10%(Annexin V)，細(xì) 胞周期的亞 G0 峰比較明顯。MTT 法心得M

7、TT 實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞活力的實(shí)驗(yàn)方法，由于細(xì)胞活力與細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，因此也常常用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖 情況。一、 MTT 的原理 活細(xì)胞有琥珀酸脫氫酶， 將 MTT 還原成棕褐色沉淀。 由于一般介紹園子里已經(jīng)很多， 筆者將自己的心得按 照實(shí)驗(yàn)流程與大家交流交流。二、 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)1、培養(yǎng)好細(xì)胞點(diǎn)板養(yǎng)細(xì)胞沒啥好說(shuō)的，如果不知道細(xì)胞如何養(yǎng)，那就看看相關(guān)的文獻(xiàn)方法。如果知道了細(xì)胞的名字，就可以 上 檢索細(xì)胞的培養(yǎng)信息，這個(gè)網(wǎng)站上的培養(yǎng)方法是標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法。當(dāng)然可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)要 求進(jìn)行修改。由于細(xì)胞計(jì)數(shù)很繁瑣，點(diǎn)板時(shí)的細(xì)胞濃度是最難掌握的，這一點(diǎn)筆者的心得如

8、下：自己先將細(xì)胞養(yǎng)一段時(shí)間，大概了解細(xì)胞的增殖情況，在 MTT 檢測(cè)時(shí)實(shí)際上要求細(xì)胞大概能長(zhǎng)滿96-孔板的 80-90% ，如果打算養(yǎng) 48 小時(shí)就檢測(cè)，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況反推點(diǎn)板時(shí)的細(xì)胞濃度狀況。這時(shí)可以將細(xì)胞不進(jìn)行計(jì)數(shù)，將消化好的細(xì)胞混勻后（可能是10ml）直接在一個(gè)廢棄（最好進(jìn)行過(guò)無(wú)菌處理）的 96孔板中依次加入 180、100、50微升細(xì)胞，將細(xì)胞放置幾分鐘就會(huì)沉到板底了，這時(shí)在顯微鏡下觀察，推測(cè)哪 個(gè)孔的細(xì)胞48 h能基本長(zhǎng)滿板底，假設(shè) 50微升的孔比較合適，而點(diǎn)板時(shí)沒孔需點(diǎn)200微升，那么就將細(xì)胞濃度再稀釋 4 倍就可以正式點(diǎn)板了，這時(shí)順便將細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)（因?yàn)閷?shí)驗(yàn)記錄要求寫?。?。這

9、樣就OK了！如果細(xì)胞還太多，將細(xì)胞稀釋 4 倍后再重復(fù)以上操作。注意：不要過(guò)分信賴細(xì)胞計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞計(jì)數(shù) 的取樣量為 20 微升左右，由于顆粒的分布不均勻，代表性是很差的。建議：細(xì)胞計(jì)數(shù)一定要會(huì)，但不要 完全依賴它。點(diǎn)板時(shí)一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，而且一定要混勻，最好用排槍，否則，MTT 的 SD 會(huì)狂大！2、點(diǎn)板布局其實(shí)這一點(diǎn)很多人不懈一顧。如果你的細(xì)胞要養(yǎng)48 h或更長(zhǎng)，建議不要吝嗇 96-孔板的四周邊孔，這 32個(gè)邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個(gè)孔的水分。因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，邊孔的水分蒸發(fā)很快，培養(yǎng)液及里面的藥物會(huì)出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象， 細(xì)胞的狀況就復(fù)雜了， 有些人稱之為 %2

10、6ldquo; 邊緣效應(yīng) %26rdquo; 這些孔的 SD 也會(huì)狂大，既然如此，不如不用。3、加 MTT如果確認(rèn)你考察的藥物沒有氧化還原性，你可以直接加入 MTT 溶液（總體積的 1/10），如果你沒有把握， 建議在加 MTT 前換一次液；如果你肯定考察的藥物的氧化還原性很強(qiáng)，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC ，那建議你用 PBS 將細(xì)胞洗洗，否則這些藥物會(huì)將 MTT 還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是你不需要的。4、加入 MTT 后的反應(yīng)時(shí)間為3-4h，此時(shí)棄去各孔中的液體在加入200微升的DMSO。為了將沉淀溶解完全，盡可能將水棄除干凈，加入DMSO后在搖床上震搖10min。提醒：如果你

11、的細(xì)胞貼壁不好， 此時(shí)的沉淀在棄去液體時(shí)易丟失， 因此貼壁不好的細(xì)胞在點(diǎn)板時(shí)記得將 96 孔板用多聚賴氨酸處理處理， 要么在棄液體時(shí)先用甩板機(jī)離心， 再 輕輕棄去液體。關(guān)于 DMSO 的量，每孔的體積有點(diǎn)兒差異不干擾檢測(cè)，只要能將沉淀完全溶解就行了。至 于 DMSO 的體積差異不同為什么不影響檢測(cè)值已經(jīng)被數(shù)學(xué)證明了，在此我不多說(shuō)，如果有人不明白我再證 明給他看。當(dāng)然為了養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣， DMSO 的體積還是一致的好。5、檢測(cè) MTT還原的MTT在460-630均有較好的吸收，如果你的酶標(biāo)儀是濾光片，可以選470 nm左右或630 nm左右的濾光片，如果酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)，你可以在檢測(cè)前掃描一下吸收譜，選用最大細(xì)說(shuō)波長(zhǎng)檢測(cè)就是了，最大波 長(zhǎng)，大概在 550nm 附近，必要時(shí)加一個(gè)參比波長(zhǎng)以扣除非特異性吸收。6