酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)基本原理

1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（elisa）基本原理|信息來(lái)源：本站原創(chuàng) 更新時(shí)間：2004-12-21 0:30:00基本原理1971年engvall和perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay, elisa）用于igg定量測(cè)定的文章，使得1966年開(kāi)始用于抗原定 位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。這一方法的基本原理是：使 抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接 成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí), 把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗

2、原或抗體按不同的步驟與固相載體表血的 抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)， 最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后, 底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反 應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從 而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。方法類型和操作步驟elisa可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本 的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種

3、不同類型的檢測(cè)方法。（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。（2）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，計(jì)標(biāo)本中的抗原與固相載體上 的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。（3）加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶 標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。（4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行 該抗原的泄性或泄量。根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可

4、用雙抗原夾 心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。（二）雙位點(diǎn)一步法在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗 體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作 一步（圖15-5） o這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)i'可，如應(yīng)用高親和力的 單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特并性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的elisa 提高到新水平。在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect）,類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶 現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本屮待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不 再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將

5、低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。（三）間接法測(cè)抗體i'可接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合 的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng) 洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相 抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去。（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗 滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾

6、病的抗體，可用酶 標(biāo)羊抗人igg抗體。（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。（四）競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原 競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如 下：（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。（2）待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶 標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與

7、固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)， 使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相 抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量。洗滌。（3）加底物顯色：參考管屮由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。 待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本屮抗原含量越多。（五）捕獲法測(cè)igm抗體血清中針對(duì)某些抗原的特異性igm常和特異性igg同時(shí)存在，后者會(huì)干擾igm抗體的 測(cè)定。因此測(cè)定igm抗本多用捕獲法，先將所有血清igm （包括異性igm和非特異性igm） 固定在固相上，在去除igg后再測(cè)定特異性igm。操作步驟如下：（1）將抗人igm抗體連接在固相載體上，形成

8、固相抗人igm。洗滌。（2）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的igm抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去 其他免疫球蛋白和血清屮的雜質(zhì)成分。（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性igm結(jié)合。洗滌。（4）加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性igm抗體存在，是為陽(yáng) 性反應(yīng)。（六）應(yīng)用親和素和生物素的elisa親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kd,每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可 以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維

9、生素h,分子量244.31,存在于蛋黃中。用化學(xué) 方法制成的衍生物，生物素一疑基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide, bnhs）可與 蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合， 雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分 子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的 復(fù)合體。因此把親和素和生物素與elis偶聯(lián)起來(lái)，就可大提高elisa的敏感度。親和素一生物素系統(tǒng)在elisa中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反 應(yīng)放大?？梢栽诠滔嗌舷阮A(yù)包被親和素，原用

10、吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合, 通過(guò)親和素一生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的 抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)elisa中的酶標(biāo)抗體也可用生物 素化的抗體替代，然后連接親和素一酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào)。elisa普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗(yàn).在這種方法川，通常標(biāo)準(zhǔn)配體是固定的，通 過(guò)加入溶液相受體或蛋白質(zhì)來(lái)使之成鍵.通過(guò)加入與受體特異性反應(yīng)的抗體來(lái)定量成鍵的 受體，而且最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測(cè)量.第二種抗體能識(shí)別抗體的末端， 在其末端的堿性磷酸酯或過(guò)氧化物酶等與酶發(fā)生反應(yīng)，從而使溶液顯色.elisa的試劑|信息來(lái)源

11、：本站原創(chuàng) 更新時(shí)間：2004-12-21 0:30:00在臨床檢驗(yàn)中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測(cè)定。前文（2.2）已述，elisa中有三個(gè)必要 的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。完整的elisa試劑盒包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定屮）；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液。3.1免疫吸附劑已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（28°c）干燥的條件下一般可保存6個(gè)月。有 些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗

12、體，檢測(cè)人員需自行包被。以下簡(jiǎn)述固相載體和包 被過(guò)程。3.1.1固相載體固相載體在elisa測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。可作elisa中載 體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附責(zé)白質(zhì)的性能，抗體或蛋 白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性，加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。聚 苯乙烯為塑料，可制成各種形式。elisa載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常 用，專用于eilsa的產(chǎn)品稱為elisa板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8x12的96孔式。 為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)elisa

13、 板相同。elisa板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出 結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的elisa檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保 溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是 對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于i'可接 法測(cè)抗體時(shí)空白值較人。良好的elisa板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各 孔z間、同一板各孔z間性能相近。聚苯乙烯elisa板由于原料的不同和制作工藝的差 別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號(hào)的elisa板在使用前須事先檢查

14、其性能。 常用的檢查方法為：以一定濃度的人igg （一般為10ng/ml）包被elisa板各孔，洗滌后 每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人igg抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分 別測(cè)每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的 平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%o與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為elisa固相載體，聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板 薄，可剪割，價(jià)廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對(duì)蛋 白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。為比較不同固相在某一 elisa測(cè)定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗(yàn)：用其他

15、免疫學(xué)測(cè)定 方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體 上按預(yù)定的elisa操作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié) 果差別最大，這種載體就是這一 elisa測(cè)定項(xiàng)目的最合適的固相載體。在elisa屮，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附 面積大大增加。elisa板孔的吸附面積約為200mm2,小珠均為1000mm2,將近elisa 板孔的5倍。吸附而積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表而弧 度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露血處于最佳反應(yīng)狀態(tài)，因此珠式 elisa的反應(yīng)往

16、往更為靈敏。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌徹底，使用特殊的洗滌器， 使小珠在洗滌過(guò)程屮滾動(dòng)淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難 度較大，小珠的均一性較差。小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。板式及珠 式elisa的標(biāo)本量一般為100-200ui,而小試管可根據(jù)需要加人反應(yīng)體積，標(biāo)本反應(yīng)量的增 加有助于試驗(yàn)敏感性的提高。小試管還可以當(dāng)作比色杯，最后直接放入分光光度計(jì)中比 色。也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為elisa固相載體的。其優(yōu)點(diǎn)是表面 積極大，反應(yīng)在懸液屮進(jìn)行，其速率與液相反應(yīng)近似。以含鐵的磁性微粒作為elisa固相 載體，反應(yīng)后

17、用磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。3.1.2 包被的方式將抗原或抗體固定在過(guò)程稱為包被（coating）o換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固 相載體表面的過(guò)程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分 子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用于。這種物理吸附是非特異性 的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同 的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表 面。igg對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露 于外，因此抗體的包被一般均采用直接

18、吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方 法包被。當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原 決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用i'可接的捕獲包被法， 即先將針對(duì)該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié) 合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表血，其抗原決定簇也得以充分暴露。問(wèn)接包被的抗原經(jīng)固相 抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采 用捕獲包被法（見(jiàn)2.2.4），試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包 被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/

19、100。不易吸附在聚苯乙烯載體 上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測(cè)抗dna抗體時(shí)，需用dna作為 包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。可將聚苯乙烯板先經(jīng)紫外線照射 （例如30w紫外燈，75cm照射12小時(shí)），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白 質(zhì)，如聚賴氨酸、魚(yú)精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系 統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的dna,這種包被方法均勻、 牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）屮溶解后加入elisa 板孔屮，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒

20、精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?？剐?磷脂抗體的elisa試劑一般采用這種包被方式。3.1.3 包被用抗原用于包被固相載體的抗原按其來(lái)源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三 大類。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。如 hbsag可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白 成份抗原可從富含此抗原的材料屮提取等（例如afp從臍帶血或胎肝屮提?。?。重組抗原 是抗原基因在質(zhì)粒體屮表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的 優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無(wú)傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌 為質(zhì)粒體的重

21、組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于elisa,在反應(yīng)屮可出現(xiàn)假陽(yáng)性， 因不少受檢者受人腸桿菌感染而在血清屮存在抗人腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能 用基因工程制備某些無(wú)法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝炎病毒（hcv）尚不 能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清屮hcv抗原含量極微。目前檢測(cè)抗hcv elisa屮所用包被 抗原大多為根據(jù)hcv的基因克隆表達(dá)而制備的重組抗原。在傳染病診斷屮，不少重組抗原 如hbsag、hbeag和hiv抗原等均在elisa屮取得應(yīng)用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原 分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個(gè)抗原決 定簇，純度高，特異

22、性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原 的包被一般需先使其與無(wú)關(guān)貴白質(zhì)如牛血清白貴白質(zhì)（bsa）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固 相載體的吸附，i'可接地結(jié)合到固相載體表血。應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測(cè)與 其相應(yīng)的抗體。一種責(zé)白質(zhì)抗原往往含有多個(gè)不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受 檢血清屮的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時(shí)往往發(fā) 生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。3.1.4 包被用抗體包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的 腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原屮含有

23、雜質(zhì)（即便是極微量的），在抗血清屮將出現(xiàn)雜抗 體，必須除去（可用吸收法）后才能用于elisa,以保證試驗(yàn)的特異性?？寡宀荒苤苯?用于包被，應(yīng)先提取igg,通常釆用硫酸錢鹽析和sephadex凝膠過(guò)濾法。一般經(jīng)硫酸錢鹽 析粗提的igg己可用于包被，高度純化的igg性質(zhì)不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以 提 高試驗(yàn)的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性igg。腹水中 單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適 當(dāng)稀釋后直接包被，必要時(shí)也可用純化的igg。應(yīng)用單抗包被時(shí)應(yīng)注意，一種單抗僅針對(duì) 一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被

24、，可取得更好的效果。3.1.5 包被的條件包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的ph等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材 料的性質(zhì)而選定。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用ph9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用 ph7.2的磷酸鹽緩沖液及ph78的tris-hcl緩沖液作為稀釋液的。通常在elisa板孔中加 入 包被液后，在48°c冰箱屮放置過(guò)夜，37°c屮保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包 被 的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的 濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml3.1.6 封閉封閉（blockin

25、g）是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程?？乖蚩贵w 包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相 關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在elisa其后的步驟屮干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手 續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血 清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，英最大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可 以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶 粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備屮較少應(yīng)用。封閉是否必要，取決于elisa的模式及具體的實(shí)

26、驗(yàn)條件。并非所有的elisa固相均需 封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活 性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)杲。特別是用單抗腹水直接包被時(shí)， 因其屮大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。 但在間接法測(cè)定屮，封閉一般是不可少的（見(jiàn)222） o包被好的elisa板干燥后放入密 封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。3.2 結(jié)合物結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是elisa中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是 既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物屮酶與抗體（或抗 原）之i'可有恰當(dāng)?shù)姆肿?/p>

27、比例，在結(jié)合試劑屮應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶 或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。3.2.1 酶用于elisa的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn) 定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好 在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn) 物易于測(cè)定等。在elisa中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase, hrp）和堿性磷 酸酶（alkaline phosohatase, ap）o在少數(shù)商品elisa試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化

28、 酶、bd半乳糖昔酶和麻酶等。國(guó)產(chǎn)elisa試劑一般都用hrp制備結(jié)合物。hrp是一種糖蛋白，含糖量約為18%, 分子量為44000,是一-種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一 種嚇咻蛋白質(zhì)。主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵u卜咻 環(huán)，在403nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰。hrp的純度用rz（reinheit zahl,徳文，意為純度 數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度z比，高純度的hrp的rz2?.0°hrp除符合上述的elisa中標(biāo)記酶的要求外，更有價(jià)格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點(diǎn)。值 得注意的是，在選用酶制劑時(shí)，除其純度

29、rz外，更應(yīng)注意酶的活力。高純度的酶如保存不 當(dāng)，活力也會(huì)降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對(duì)底物作用后生成產(chǎn)物 量的測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn)。國(guó)外很多elisa試劑采用堿性磷酸酶（ap）作為標(biāo)記酶。常用的ap有兩個(gè)來(lái)源，分 別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來(lái)源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取 的ap分子量為80000,酶作用的最適合ph為8.0；用小牛腸膜屮提取的ap分子量為 100000,最適ph為9.6。在elisa屮，ap系統(tǒng)的敏感度一般高于hrp系統(tǒng)，空白值也較 低，但ap價(jià)格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較hrp低。3.2.2 抗原和抗體制備結(jié)合物時(shí)所用抗體一般均為純度較髙的

30、igg,以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干 擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀 釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。如用f（ab*）2 iit行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本屮rf的干擾。 在elisa屮用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。3.2.3 結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò) 它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊 二醛直接加入酶與抗體的混合物屮，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。elisa屮常用的酶一

31、般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡(jiǎn)便、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%） 和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié) 合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之i'可也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法屮， 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先 將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比 例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較 一步法低。（2）過(guò)碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記常用 此法。反應(yīng)時(shí)，過(guò)碘酸鈉將hrp分子表

32、面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基 形成schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其最佳比例為：酶/抗體=12/仁此 法簡(jiǎn)便有效，一般認(rèn)為是hrp最可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈，各批 實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物屮混有 的游離酶一般不影響elisa屮最后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)徹底洗滌，游離酶可被除去，并 不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，從而減 少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體 后用于檢測(cè)，效果更好。純化的方法很多，分離大

33、分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸鍍鹽 析法最為簡(jiǎn)便，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶，但相當(dāng)數(shù)量的 游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開(kāi)。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高 效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取 得最佳的分離效果，但費(fèi)用較貴。結(jié)合物制得后，在用作elisa試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過(guò)濃的結(jié)合 物，既不經(jīng)濟(jì)，乂可使本底增高；結(jié)合物的濃度過(guò)低，則乂影響檢測(cè)的敏感性。所以必須 對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度吋，能維護(hù)-個(gè) 低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和

34、測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo) 抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽(yáng)性反 應(yīng)的最高稀釋度。例如某一 hrp：抗人igg制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000,表示該制劑經(jīng) 1:5000稀釋后，在與人igg包被的固相作elisa試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。但在用于具體 的elisa檢測(cè)屮，酶標(biāo)抗體的最適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度 以及整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和吋i'可等的影響，因此必須在實(shí)際測(cè)定條件下進(jìn) 行”滴配”選擇能達(dá)到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒屮的工作濃度。3.2.4結(jié)合物的保存酶標(biāo)抗體屮的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失

35、活。高濃度的結(jié)合物較 為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過(guò)程中引起活力的減低，而且 使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液屮加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的 冰格屮較長(zhǎng)時(shí)問(wèn)保存。早期的elisa試劑盒屮的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配以 稀釋液（見(jiàn)3.2.5）臨用時(shí)按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作液。現(xiàn)在較先進(jìn)的elisa試劑盒均已 用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在48°c保存期可達(dá)6個(gè)月。由于蛋白 質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活，需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和 防腐劑（hrp結(jié)合物加硫柳泵，ap結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

36、3.2.5 結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體 上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白），通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)以 抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑， 如吐溫20, 0.05%的濃度較為適宜。在間接測(cè)定抗體時(shí)，血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測(cè)定，也 可應(yīng)用這種稀釋液。3.3 酶的底物3.3.1 hrp的底物hrp催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過(guò)氧化物為h2o2,其反應(yīng)式如下：dh2+ h2o2 d+ h20上式中，dh2為供氧體，h2o2為受氫體。在elisa中，dh2 般為無(wú)色化合物，經(jīng)

37、 作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺(0 phenylenediamine,opd)> 四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'tetramethylbenzidine,tmb)和 abts 2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)oopd氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度 高，比色方便，是hrp結(jié)合物最常用的底物。opd本身難溶于水，opd - 2hcl為水溶 性。曾有報(bào)道opd有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。opd見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底 物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒屮，opd和h202 -般分成二組分，opd 可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過(guò)氧化紅則配 入底物緩沖液屮，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸飾水稀釋。先進(jìn)的elisa試劑盒屮 則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% h2o2的應(yīng)用液，只需加入opd后即可作為底物 應(yīng) 用液。tmb經(jīng)hrp作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。tmb性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試 劑，只需與h2o2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，tmb又有無(wú)致癌性等 優(yōu)點(diǎn),因此