酵母菌混合培養(yǎng)物對(duì)木質(zhì)纖維素稀酸水解液原位脫毒乙醇發(fā)酵

1、酵母菌混合培養(yǎng)物對(duì)木質(zhì)纖維素稀酸水解液原位脫毒乙醇發(fā)酵酵母菌混合培養(yǎng)物對(duì)木質(zhì)纖維素稀酸水解液原位脫毒乙醇發(fā)酵摘要：為降低抑制劑對(duì)乙醇發(fā)酵影響，同時(shí)能夠有效代謝木糖提高乙 醇產(chǎn)率，進(jìn)行了樹干畢赤酵母與高耐毒酵母共發(fā)酵未脫毒木質(zhì)纖維素稀酸 水解液研究。本實(shí)驗(yàn)室分離的釀酒酵母y5和東方伊薩酵母y4均能在發(fā)酵 過(guò)程中代謝稀酸水解液中的糠醛和5輕甲基糠醛，通過(guò)y5和樹干畢赤酵 母以及y4和樹干畢赤酵母兩組混合菌種的發(fā)酵比較表明：y5和樹干畢赤 酵母混合培養(yǎng)物在含糠醛和5 疑甲基糠醛合成培養(yǎng)基和未脫毒稀酸水解液 的乙醇產(chǎn)率分別為0.46g/g和0.44g/g,達(dá)到了理論產(chǎn)率的91.2%和87.5%。 實(shí)驗(yàn)

2、表明樹干畢赤酵母與y5混合培養(yǎng)物原位脫毒木質(zhì)纖維素稀酸水解液 是一種有效的方法。關(guān)鍵詞：木糖；糠醛和5輕甲基糠醛；樹干畢赤酵母；未脫毒水解液 乙醇發(fā)酵；混合菌0引言在以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇的研究開發(fā)領(lǐng)域中，稀酸水解是一種 有效且經(jīng)濟(jì)的處理方法之一。但稀酸水解法存在的主要問(wèn)題是水解產(chǎn) 物中存在微生物發(fā)酵抑制劑，如糠醛，5-hmf（ 5-甕甲基糠醛），甲酸、乙 酸、和苯系化合物，主耍抑制劑糠醛、5-hmf的含量對(duì)菌體生長(zhǎng)具有不同 程度影響。為了降低毒性，發(fā)酵之前對(duì)水解液進(jìn)行如堿中和處理、overliming法處理3、活性炭吸附、離子交換樹脂吸附4等脫毒方法會(huì)增加成本口 使發(fā)酵過(guò)程復(fù)雜化，利用能

3、降解某些毒性物質(zhì)的菌種作為發(fā)酵菌種是降低 抑制作用簡(jiǎn)單有效方法。據(jù)報(bào)道，只有少數(shù)酵母菌能夠耐受水解液中的 抑制劑，例如 saccharomyces cerevisiae tmb 3400 , s.cerevisiae tmb 3006 和coniochaeta ligniaria nrrl30616能夠?qū)⒖啡?- hmf轉(zhuǎn)變成低毒性物質(zhì) 發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇。但是這些菌大多不能代謝木糖產(chǎn)乙醇7。樹干畢赤 酵母能夠發(fā)酵木糖且有高的乙醇產(chǎn)率，而lohmeier - vogel等人研究 發(fā)現(xiàn)畢赤酵母對(duì)糠醛、疑甲基糠醛和乙酸等抑制因子比較敏感。因此， 利用樹干畢赤酵母和耐毒酵母混合發(fā)酵水解液是一種可行的

4、方法?；旌暇糜谀咎呛推咸烟腔旌咸前l(fā)酵和脫毒水解液有過(guò)報(bào)道,nan fu等人用 zymomonas mobilis和pachysolen tannophilus混合菌發(fā)酵木糖和葡萄糖混 合糖/旦是沒(méi)有研究抑制劑對(duì)發(fā)酵的影響10,錢名宇采用混合菌發(fā)酵稀酸 水解液，水解液在發(fā)酵之前己經(jīng)過(guò)煮沸脫毒處理llo用一種菌進(jìn)行水解液發(fā)酵也有過(guò)報(bào)道，keikhosro karimi等發(fā)現(xiàn) mucor indicus菌能夠利用葡萄糖和木糖并且耐受抑制劑，但是在水解液批 式發(fā)酵中菌體生長(zhǎng)完全抑制，補(bǔ)料批式發(fā)酵中，木糖只有部分利用12 o frank k等人用pichia stipitis cbs 6054發(fā)酵玉米

5、秸稈水解液，因該水解液的 糠醛量低于0.8g/l13,樹干畢赤酵母的生長(zhǎng)沒(méi)有受到太大影響。但是將混合菌用于未脫毒水解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇未見報(bào)道。s. cerevisiae y5 和issatchenkia orientalis y4是兩株分離的酵母菌'均能夠降解糠醛和疑甲基 糠醛，本研究將y5和y4分別與pichia stipitis cbs 6054混合,在含有和水解 液相同含量糠醛、釋甲基糠醛的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，尋找既能利用木糖 和葡萄糖產(chǎn)乙醇，又能耐受抑制劑的一種組合,將這種最優(yōu)組合用于未脫毒 稀酸水解液發(fā)酵。1 材料與方法1. 1菌種樹干畢赤酵母cbs6054 (pichia.

6、stipitis cbs6054)由首都師范大學(xué)微 牛物學(xué)系保藏，該菌種能夠同時(shí)代謝木糖和葡萄糖，釀酒酵母y5 ( s. cerevisiae)和東方伊薩酵母y4 ( i. orientalis)從糠醛廠分離篩選，y5 和y4均能夠代謝葡萄糖且具有高抑制劑耐受性。1. 2培養(yǎng)基(g/l)1. 2. 1增殖培養(yǎng)基：葡萄糖20,酵母膏10,蛋白月東20,ph5.05.51. 2. 2發(fā)酵培養(yǎng)基a：葡萄糖24,木糖13,酵母膏10,蛋白月東20,糠醛1.37, 5-hmf0.47, ph5.0b：葡萄糖24,木糖13,酵母膏10,蛋白月東20,ph5.0c：葡萄糖24,酵母膏10,蛋白腺20,糠醛1

7、.37, 5-hmf0.47,ph5.0d：葡萄糖24,酵母膏10,蛋白20, ph5.0e：木糖込 酵母膏10,蛋白腺20,糠醛1.37,5-hmf0.47zph5.0f：木糖13,酵母膏10,蛋白h東20,ph5.01. 3木質(zhì)纖維素稀酸水解液本研究所用木質(zhì)纖維素稀酸水解液由華東理工大學(xué)化學(xué)工程系提供, 滅菌后，測(cè)定其主要成分(g/l)：葡萄糖15.4,木糖66糠醛1.37, 5-hmf0.47,乙酸 10 等，發(fā)酵前向培養(yǎng)基中加入10 g/l酵母膏,20 "l蛋口腺，用ca (oh) 2調(diào) 節(jié) ph5.0o1. 4酵母接種物制備將斜面保藏的菌種接種于100ml增殖培養(yǎng)基中，30

8、 °c、150rpm樹干 畢赤酵母cbs6054培養(yǎng)12h, y5和y4培養(yǎng)14h。經(jīng)測(cè)定樹干畢赤酵母 cbs6054、y5 和 y4 的細(xì)胞干重分別為 3.0g/l、3.3g/l 和 2.7g/l01. 5 發(fā)酵1. 5. 1單菌發(fā)酵增殖培養(yǎng)的樹干畢赤酵母cbs6054、y5和y4菌液分別取5ml分別接 種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基a、c、d、e、f中,c和d、e和f形成對(duì)照。 30 °c、80rpm發(fā)酵，定時(shí)取樣，測(cè)定測(cè)定乙醇產(chǎn)量、殘?zhí)橇俊⒖啡┝亢?5hmf量。1. 5. 2混合菌發(fā)酵5ml樹干畢赤酵母cbs6054菌液和5ml y5菌液混合分別接種于100ml 發(fā)酵培養(yǎng)基

9、a、b中，5ml樹干畢赤酵母cbs6054菌液和5ml y4菌液混合 分別接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基a、b中，a和b形成對(duì)照。30 °c、80rpm 發(fā)酵，定時(shí)取樣，測(cè)定乙醇產(chǎn)量、殘?zhí)橇俊⒖啡┝亢?-hmf量。1. 5. 3未脫毒稀酸水解液發(fā)酵5ml樹干畢赤酵母cbs6054菌液和5ml y5菌液混合接種于100ml未經(jīng) 任何脫毒處理的稀酸水解液中，30 °c、80rpm發(fā)酵，定時(shí)取樣，測(cè)定乙 醇產(chǎn)量、殘?zhí)橇?、糠醛量?-hmf量。1. 6分析方法1. 6. 1糖濃度測(cè)定樣品經(jīng)0.12 u m微型過(guò)濾器過(guò)濾，用高效液相色譜儀(high-liquidchromatograph

10、y hplc, waters 2690)測(cè)定樣品中葡萄糖和木糖的含量。測(cè)定 條件：氨柱(200 x4. 6mm),柱溫40°c, waters410視差測(cè)器，流動(dòng)相已 水二85： 15,進(jìn)樣量 20 hl.1. 6. 2乙醇含量測(cè)定樣品經(jīng)0.12 u m微型過(guò)濾器過(guò)濾，用sp-3420氣相色譜測(cè)定乙醇含量。測(cè)定條件:柱溫80 °c,注射室溫度150 °c,檢測(cè)器溫度50 °c,進(jìn)樣量0.5 u l o1. 6. 3糠醛量和5-hmf含量測(cè)定樣品經(jīng)0.12 u m微型過(guò)濾器過(guò)濾，用sp-3420氣相色譜測(cè)定乙醇含量。測(cè)定條件:柱溫120°c,注射

11、室溫度200 °c,檢測(cè)器溫度50 °c,進(jìn)樣量0.5 p l o 1.6. 4發(fā)酵液中混合菌相對(duì)比例測(cè)定在顯微鏡下混合菌的形態(tài)大小很容易分辨，通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定發(fā) 酵液中混合菌的相對(duì)比例。1. 7計(jì)算方法高效液相色譜和氣相色譜的計(jì)算方法均采用樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積相比較獲得。乙醇含量的計(jì)算方法：x = (s1 xc)/s2 xloo %式中,x 樣品中乙醇含量,g/l;sl 樣品峰面積;c 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度g/l; s2 標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積?？啡┖?-hmf含量計(jì)算方法同乙醇含量。乙醇生成率計(jì)算公式:x = cl/( c2 x0.51)xl00%式中,x 乙醇生成率;cl 測(cè)得

12、的乙醇含量;c2 消耗糖的量g/l2結(jié)果與討論2. 1單菌發(fā)酵2.1.1 y5、y4和樹干畢赤酵母cbs6054的單糖發(fā)酵從圖1、圖2和圖3可以看出，純葡萄糖培養(yǎng)基中，無(wú)抑制劑存在時(shí)，y5和y4比樹干畢赤酵母利用葡萄糖的速度快，y5和y4發(fā)酵12 h,將 葡萄糖用完，樹干畢赤酵母需要24 h,發(fā)酵培養(yǎng)基中的糠醛和5輕甲基糠 醛，使樹干畢赤酵母葡萄糖利用時(shí)間延遲到36 h,但對(duì)y5和y4沒(méi)有明 顯影響。純木糖培養(yǎng)基中，無(wú)抑制劑存在時(shí)，樹干畢赤酵母80 rpm發(fā)酵72 h 將木糖用完，木糖濃度11.4g/l,乙醇產(chǎn)率5.3g/l (圖4),而y5和y4不 能利用木糖。當(dāng)加入1.37g/l糠醛和0.

13、47g/l 5-羥甲基糠醛時(shí)，樹干畢赤酵 母生長(zhǎng)受到抑制。從以上結(jié)果得出：y5和y4具有很高的耐毒性，并且高效利用葡萄糖 產(chǎn)乙醇，但是不能代謝木糖，樹干畢赤酵母既可以代謝葡萄糖又可以代謝 木糖產(chǎn)乙醇，耐毒性不高。圖1 y5葡萄糖發(fā)酵(“ + ”表示加入1.37g/l糠醛和0.47g/l5輕甲基 糠醛)figi glucose fermentation of y5(<< + , addingl.37g/l furfural and 0.47g/l 5-hmf)圖2 y4葡萄糖發(fā)酵fig2 glucose fermentation of y4圖3樹干畢赤酵母cbs6054葡萄糖發(fā)酵fi

14、g3 glucose fermentation of pichia stipitis cbs6054圖4樹干畢赤酵母cbs6054木糖發(fā)酵fig4 xylose fermentation of pichia stipitis cbs60542.1.2 y5、y4和樹干畢赤酵母cbs6054葡萄糖和木糖混合發(fā)酵對(duì)樹干畢赤酵母進(jìn)行混合糖發(fā)酵(圖5),糠醛和拜甲基，樹t畢赤酵母出 現(xiàn)72 h延滯期，葡萄糖96h代謝完，木糖沒(méi)有利用完全，乙醇產(chǎn)量為15.8g/l, 為理論產(chǎn)量的88%.對(duì)y5和y4進(jìn)行混合糖發(fā)酵(圖6圖7), y5和y4只能利 用葡萄糖，不能利用木糖，乙醇產(chǎn)量分別為12.8g/l和9.

15、8g/lo圖5樹干畢赤酵母cbs6054混合糖發(fā)酵(+ ) ( “ + ”表示加入1.37g/l糠醛和0.47g/l 5輕甲基糠醛)fig5 fermentation of glucose/xylose mixtures using p.stipitis cbs6054("+addingl37g/lfurfural and 0.47g/l 5-hmf)圖6 y5混合糖發(fā)酵(+)fig6 fermentation of glucose/xylose mixtures usingy5(+)圖7 y4混合糖發(fā)酵(+)fig7 fermentation of glucose/xylose m

16、ixtures using y4(+)2.2混合菌混合糖發(fā)酵水解液成分復(fù)雜，糠醛和5-hmf是主要抑制劑，向發(fā)酵培養(yǎng)基加入和 水解液中等量的糠醛和5-hmf,進(jìn)一步篩選出能夠用于未脫毒水解液發(fā)酵 的混合菌。圖8看出，y5和樹干畢赤酵母混合發(fā)酵，木糖在144 h全部用完，發(fā) 酵培養(yǎng)基的糠醛和5-hmf 12 h全部降解完。發(fā)酵oh, 12h和144h,發(fā)酵液 中兩種菌的相對(duì)比例分別為2:3, 2:1和1:4,乙醇產(chǎn)量為16.6g/l,乙醇產(chǎn) 率0.46g /g,達(dá)到理論產(chǎn)率的91.2%,圖8和圖9比較可以得出，y5生長(zhǎng) 降解抑制劑，解除了樹t畢赤酵母生長(zhǎng)因抑制劑存在而出現(xiàn)的延滯期，同 時(shí)發(fā)酵液中

17、兩種菌的比例說(shuō)明y5和樹干畢赤酵母不存在很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)，使 樹干畢赤酵母生長(zhǎng)良好并能將木糖利用完。圖10看出，y4將糠醛和5-hmf12h全部降解，綜合圖10和圖可 以得出，木糖幾乎沒(méi)被利用，說(shuō)明y4在發(fā)酵液中是優(yōu)勢(shì)菌，將樹干畢赤 酵母排擠，從而木糖幾乎沒(méi)有減少。圖8和圖10比較，y5和樹干畢赤酵母混合發(fā)酵效果較好，既可以降 解糠醛和5-hmf,又可以代謝木糖提高乙醇產(chǎn)量，同時(shí)解除了樹干畢赤酵 母生長(zhǎng)因高濃度抑制劑存在而出現(xiàn)的延滯期。圖8樹干畢赤酵母cbs6054和y5混合菌混合糖發(fā)酵(+)fig8 fermentation of glucose/xylose mixtures using p.s

18、tipitis cbs6054 and y5 (+)圖9樹干畢赤酵母cbs6054和y5混合菌混合糖發(fā)酵fig9 fermentation of glucose/xylose mixtures using p.stipitis cbs6054 and y5圖10樹干畢赤酵母cbs6054和y4混合菌混合糖發(fā)酵(+)figlo fermentation of glucose/xylose mixtures using p.stipitis cbs6054 and y4(+)圖n樹干畢赤酵母cbs6054和y4混合菌混合糖發(fā)酵figll fermentation of glucose/xylose

19、 mixtures using p.stipitis cbs6054 and y42. 3未脫毒稀酸水解液發(fā)酵將y5和樹干畢赤酵母混合培養(yǎng)物進(jìn)一步用于未脫毒稀酸水解液發(fā)酵, 圖12結(jié)果表明80rpm發(fā)酵，葡萄糖16 h用完，糠醛和5-hmf在葡萄糖用 完之前已降解,168h木糖用完。最大乙醇產(chǎn)量9.6g/l,乙醇產(chǎn)率0.44g /g , 達(dá)到理論值的87.5%,發(fā)酵oh, 16h和168h,發(fā)酵液中兩種菌的相對(duì)比例 分別為2:3, 2:1和l:7o圖12 y5和樹干畢赤酵cbs6054混合菌未脫毒稀酸水解液發(fā)酵figl2 ferme ntation of non detoxified hydr

20、olysate with co-culture of y5 and pichia stipitis cbs6054frank k.等研究了轉(zhuǎn)速對(duì)樹干畢赤酵母cbs6054水解液發(fā)酵的影響，當(dāng) 轉(zhuǎn)速為100 rpm時(shí)發(fā)酵時(shí)間96 h,轉(zhuǎn)速為150rpm時(shí)發(fā)酵時(shí)間縮短為48 h13,但是轉(zhuǎn)速提高使更多糖用于菌體生長(zhǎng)而轉(zhuǎn)變成乙醇的量降低，因此 為了提高乙醇產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)速80 rpm,木糖利用時(shí)間會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng), 但乙醇產(chǎn)率較高。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)抑制劑時(shí)，y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌發(fā)酵 144h將木糖代謝完全，比樹干畢赤酵母單獨(dú)代謝木糖時(shí)間長(zhǎng),可能是y5在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙醇和乙酸等代謝

21、產(chǎn)物對(duì)樹干畢赤酵母有反饋抑制，具 體原因有待于進(jìn)一步研究。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基屮有1.37g/l糠醛和047g/l5輕甲基糠醛時(shí)，樹干畢赤 酵母沒(méi)有將木糖代謝完全。y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌同樣144h 將木糖代謝完全，這說(shuō)明y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌發(fā)酵未脫毒 水解液具有可行性。發(fā)酵oh, 16h和168h,水解液中兩種菌的相對(duì)比例分別為2:3, 2:1和 1:7,發(fā)酵開始葡萄糖利用階段y5生長(zhǎng)速度很快，一旦葡萄糖利用完全， y5停止生長(zhǎng)，畢赤酵母開始利用木糖產(chǎn)乙醇，在水解液中兩種菌最后的比 例為1:7,說(shuō)明它們的兼容性很好。y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌發(fā)酵未脫毒水

22、解液，木糖代謝時(shí)間 延長(zhǎng)，乙醇產(chǎn)率為0.44g/g ,低于合成培養(yǎng)基的乙醇產(chǎn)率，可能由于水解液 中還含有乙酸和酚類等毒性物質(zhì)，對(duì)菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵具有抑制作用。今后我們可以通過(guò)對(duì)混合菌固定化或 采用補(bǔ)料批式發(fā)酵等方法做進(jìn)一步研究，縮短水解液發(fā)酵時(shí)間，降低其它 毒性物質(zhì)如乙酸和酚類的抑制作用。3結(jié)論綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出以下結(jié)論：(1) 兩株分離的酵母y4和y5能夠耐受和降解糠醛和5疑甲基糠醛并且 在12h將葡萄糖用完但是不能利用木糖，而樹干畢赤酵母80rpm72h代謝 完木糖產(chǎn)乙醇但是對(duì)抑制劑耐受度不高，綜合這三種菌的優(yōu)點(diǎn)，采用了混 合菌發(fā)酵。(2) 混合糖發(fā)酵培養(yǎng)中加入和水解液中相同量糠

23、醛和5疑甲基糠醛，y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合發(fā)酵效果較好，能夠代謝完木糖產(chǎn)乙醇，同 時(shí)將1.37g/l糠醛和047g/l5疑甲基糠醛降解完,發(fā)酵oh, 12h和144h, 發(fā)酵液中兩種菌的相對(duì)比例分別為2:3, 2:1和1:4,乙醇產(chǎn)量為16.6g/l , 乙醇產(chǎn)率為0.46g/g達(dá)到理論值的91.2%。y4和樹干畢赤酵母cbs6054混 合發(fā)酵雖然可以將1.37g/l糠醛和0.47g/l5疑甲基糠醛降解完，但是木糖 沒(méi)有利用。所以y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合是最優(yōu)組合。(3) y5和樹干畢赤酵母cbs6054共發(fā)酵未脫毒木質(zhì)纖維素稀酸水解液， 木糖用完，糠醛和5梵甲基糠醛降

24、解完，發(fā)酵oh, 16h和168h,發(fā)酵液中 兩種菌的相對(duì)比例分別為2:3, 2:1和1:7,乙醇產(chǎn)量為9.6g/l ,乙醇產(chǎn)率 為0.44g/g達(dá)到理論值的87.5%o因此y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌 發(fā)酵未脫毒稀酸水解液是一種可行的方法。今后應(yīng)該摸索更好的發(fā)酵條件, 相信可以達(dá)到更好的實(shí)驗(yàn)效果。參考文獻(xiàn)1 tania i. georgieva , birgitte k. ahring.evaluation of continuous ethanol fermentation of diluteacid corn stover hydrolysate using thermophi

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32、for ethanol production by pichia stipitis and hightoxic tolerance saccharomyces abstract: in order to reduce negative effect of inhibitory compounds in ethanol production and utilize xylose efficiently to increase ethanol yield ,co-fermentation of nondetox訐ied dilute-acid hydrolyzsate by pichia stip

33、itis and saccharomyces with high toxic tolera nee was con ducted. two n ewly isolated strai ns in our lab, saccharomyces cerevisiae y5 and issatchenkia orientalis y4, which can metabolize furfural and 5hydroxymethyl furfural were combined with p.stipitis cbs6054 respectively the results indicated y5

34、 and p.stipitis cbs6054 is the optimum co-culture ,and the ethanol yield in synthetic medium with furfural and 5 hydroxymethyl furfural and in non detox 訐 ied dilute-acid hydrolyzsate were 0. 47g/g and 0. 44g/g respectively, corresp on ding to 92. 2 % and 87.5% of theoretical ethanol yield. these results dem on strate that co-fermen