他汀類藥物的生物技術(shù)合成以及應(yīng)用

1、他汀類藥物的生物技術(shù)合成以及應(yīng)用摘要：他汀類藥物是一類可以非常顯著降低血液中膽固醇含量的藥物;還可以減少中風(fēng)或其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)。近幾年來報(bào)道，他汀類藥物還有其他的生物活性以及許多潛在的治療用途。天然他汀類藥物有洛伐他汀和康帕丁，而普伐他汀是通過生物轉(zhuǎn)化形成的。辛伐他汀，是領(lǐng)先市場(chǎng)的第二他汀類藥物，是一種洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀主要是由Aspergillus terrus（土曲霉）菌株合成的，而康帕丁是由penicillium citrinum菌株合成。洛伐他汀和康帕丁是通過液體深層發(fā)酵進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，但也固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)，這種新的生產(chǎn)方式具有一定的優(yōu)勢(shì)。洛伐他汀在生物化學(xué)和遺傳學(xué)上的一些研

2、究進(jìn)展讓辛伐他汀在新的生產(chǎn)方式方面得以發(fā)展。這種洛伐他汀衍生物可以通過monacolin J（無側(cè)鏈洛伐他汀）過程有效合成，這個(gè)過程是一個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶LovD進(jìn)行的。利用基因lovF的組合生物合成，可以通過一種不同的方法設(shè)計(jì)土曲霉，從而使聚酮合成酶在體內(nèi)合成2,2- dimethylbutyrate（simvastatin的側(cè)鏈）。這樣產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化菌株能通過直接發(fā)酵產(chǎn)生辛伐他汀而非洛伐他汀。關(guān)鍵字：他汀類藥物 生物合成和遺傳學(xué) 生物技術(shù)生產(chǎn)簡(jiǎn)介：據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)道，心血管疾病是威脅健康的主導(dǎo)因素。2005年，約有1750萬人死于這些疾病，死亡率占全球約30。這種疾病是由于血漿中的膽固醇含量提高而

3、致，因而膽固醇血癥成為了動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈疾?。↘annel等人，1961年）的主要危險(xiǎn)因素。一般來說， 人體中的膽固醇只有三分之一是從飲食取得的，而其三分之二是由肝臟合成，還有一小部分是由其他器官合成的（Furberg 1999年;Alberts等人1980年）。 出于這個(gè)原因，抑制膽固醇的生物合成來控制其含量成為一個(gè)重要策略，以降低膽固醇在血液中濃度，如manzoni和Rollini（2002）關(guān)于他汀類的一篇報(bào)道中如是說。 他汀類藥物可以選擇性抑制膽固醇的合成的限速酶，即HMG-CoA還原酶。因此，這些化合物便可以降低膽固醇含量，尤其是降低低密度脂蛋白（LDL）或低密度膽固醇（“壞膽

4、固醇”）含量，而稍微增加高密度脂蛋白膽固醇（“好膽固醇”）的含量，因此，防止動(dòng)脈內(nèi)斑塊的集結(jié)。此外，他汀類藥物已經(jīng)運(yùn)用于預(yù)防性藥物前列心血管疾病，因?yàn)榇罅康呐R床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，他汀類可以降低風(fēng)險(xiǎn)冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病率和死亡率。這就解釋了的他汀類藥物在醫(yī)療和商業(yè)領(lǐng)域取得巨大成功的原因。2006年，兩種他汀類藥物出現(xiàn)于Forbes雜志的的名單之首，并入美國(guó)的20個(gè)最暢銷藥物之中，同為8.4美元和44億美元的年銷售額，預(yù)計(jì)他汀類藥物使用量在增加。然而，由于有關(guān)他汀類藥物的專利即將關(guān)閉，再加上多種生產(chǎn)過程的盛行，他汀類藥物與仿制藥的競(jìng)爭(zhēng)也將更加的棘手。過去幾年里，天然他汀類藥物（洛伐他汀和康帕?。┑纳锘?/p>

5、學(xué)和遺傳方面在科學(xué)領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展。這些研究的生物技術(shù)開發(fā)創(chuàng)新也使衍生物的生產(chǎn)取得了顯著進(jìn)步。一組不同的研究已經(jīng)表明，他汀類治療已經(jīng)超越了降低高密度膽固醇水平的生物效應(yīng)。一些新的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了他汀類藥物許多新的生物（藥）活性，如在癌癥、阿爾茨海默氏癥和與年齡有關(guān)的骨質(zhì)流失等疾病的潛在應(yīng)用。他汀類藥物的歷史發(fā)展他汀類藥物可分為天然他汀類和半合成衍生物，以及合成他汀類藥物。所有的天然他汀類藥物都是hexahydronaphtalne內(nèi)酯。第一種他汀類藥物是由科學(xué)家Sankyo Co. Ltd在日本分離出來的，他在老鼠肝提取物通過真菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)了可以抑制HMG-CoA還原酶的化合物，這種物質(zhì)由Pen

6、icillium citrinum所生產(chǎn)的，即原名為ML236B或美伐他汀，以后叫做康帕丁（Endo et 等1976年）。一旦弄明白了這種新化合物的潛力，默克公司的科學(xué)家便可以通過真菌進(jìn)行選育。他們分離出了土曲霉，能夠產(chǎn)生一種非常有效的他汀類藥物：洛伐他汀（Alberts等人，1980年）。Endo et 等人（1979）從紅曲霉中同樣分離出同一種化合物，盡管這個(gè)物種不能經(jīng)過工業(yè)生產(chǎn)而得到代謝產(chǎn)物。除了額外的一個(gè)甲基，洛伐他汀與康帕丁的化學(xué)結(jié)構(gòu)是相同的。臨床試驗(yàn)證明洛伐他汀可以顯著降低低密度脂蛋白，而且副作用很小。1987年，食品和藥物管理局批準(zhǔn)洛伐他汀以Mevacor的名稱上市。Sanky

7、o研制出了普伐他汀，是一種更有效的康帕丁衍生物。這個(gè)公司與Bristol - Myers Squibb公司聯(lián)手注冊(cè)分發(fā)普伐他汀和銷售（如Pravachol銷售）。Merck研制的洛伐他汀第二代半合成衍生物，目前仍占領(lǐng)著他汀類藥物的第二大市場(chǎng)。這種衍生物就是辛伐他汀，雖然它是由洛伐他汀人工合成的，但它也可以利用生物技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。Merck贊助了納維亞辛伐他汀生存研究，對(duì)2221個(gè)被確診為中度高膽固醇血癥（200-300毫克/分升）的病人運(yùn)用了辛伐他汀。結(jié)果顯示，使用辛伐他汀的患者不僅降低了膽固醇（25）含量和低密度脂蛋白含量（35），更重要的是，還減少42他們的死亡率。這些成功的的業(yè)績(jī)吸引了其他

8、藥品公司進(jìn)入他汀類藥物市場(chǎng)。他們花費(fèi)一部分努力用于制造合成他汀類藥物，緊隨眾所周知的商業(yè)名稱為立普妥的阿托伐他汀之后，氟伐他?。⊿ando Ag，Lescol）成為第一個(gè)完全合成的他汀類藥物.這種產(chǎn)品很快成為了暢銷藥物。各種合成他汀類藥物的結(jié)構(gòu)是不同的，而且與天然他汀類藥物的結(jié)構(gòu)完全不同。只有戊二酰輔酶A的類成分，它負(fù)責(zé)抑制HMG-CoA還原酶，是常見的天然和合成他汀類藥物。(Manzoni 和 Rollini 2002)。正如前面提到的阿伐他汀（立普妥），是最重要的合成他汀類藥物，其次是氟伐他汀（Lescol），瑞舒伐他汀（Crestor），擁有較小的市場(chǎng)份額。還有匹伐他汀也出現(xiàn)在目前商業(yè)化

9、一些東方國(guó)家。洛伐他汀生物合成對(duì)紅曲霉早期的研究表明，莫納克汀 L和J是洛伐他汀的生物合成途徑中間體（Endo等人，1985）。結(jié)果表明，莫納克汀 L是由九個(gè)醋酸分子首先合成的，然后，反過來，經(jīng)羥基轉(zhuǎn)換為莫納J克汀因子。羥基化反應(yīng)中，18O2通過一個(gè)單加氧酶系統(tǒng)被納入莫納J，這個(gè)系統(tǒng)存在于紅曲霉中自由提取的細(xì)胞色素P -450中（Komagata等人，1989）。隨后的實(shí)驗(yàn)展示了莫納克汀J轉(zhuǎn)化為洛伐他汀的過程（Kimura等人，1990）。在土曲霉的研究中，經(jīng)過使用標(biāo)記前體表明，洛伐他汀的生物合成途徑也開始醋酸，醋酸分子相互之間頭尾相連連接成二聚鏈。甲基常常是在側(cè)鏈或蛋氨酸的C6上，并插入到結(jié)

10、構(gòu)中，然后關(guān)閉環(huán)（Shiao和Don 1987年）。然后，主練呈環(huán)化狀態(tài)，有些他汀類的主鏈還會(huì)通過側(cè)鏈C8主鏈環(huán)化。隨之，經(jīng)有氧氧化主鏈上的氧原子插入（Alberts等人1980，Greenspan和Yudrovitz 1985年，Moore等，1985年）。對(duì)P.citrinum 和 M.ruber進(jìn)行的研究途徑是相似的（Endo 1985; Chakravarti和Sahail 2004年）。因此，已經(jīng)證明，洛伐他汀是由聚醋酸通過派生途徑而來的（Moore等人，1985）。由Peeves、McAda和骨髓增生異常綜合征Panlabs公司的學(xué)者首創(chuàng)基因研究確定，I型聚酮合酶（PKS）基因?qū)τ?/p>

11、土曲霉合成洛伐他汀是必不可少的（亨德里克森等，1999年）。它的產(chǎn)品也就是現(xiàn)在的洛伐他汀nonaketide合酶（LNKS）已被證明（馬，唐 2007）要包括七個(gè)活性中心（活性中心序列：KS ketosynthase;MAT =丙二酰輔酶A：非加太?；D(zhuǎn)移酶; DH=脫水;MT=甲基轉(zhuǎn)移酶;KR= ketoreductase;ACP=?；d體蛋白; CON=縮合域）。在LNKS（lovB）基因的表征為理解二氫莫鈉L和洛伐他汀的碳鏈的組裝設(shè)置提供了一個(gè)平臺(tái)。此外，由于次生代謝的基因都存在于微生物體內(nèi)，該基因還為克隆和定性其他參與洛伐他汀合成的基因提供了一個(gè)方便的通道。Kennedy等人在1999

12、年將此基因用作探針從基因組文庫(kù)里面分離出兩個(gè)粘粒，這兩個(gè)粘粒包含完整的洛伐他汀基因產(chǎn)業(yè)集群。他們發(fā)現(xiàn)18個(gè)超過64 kb的基因的存在。這些基因中有兩個(gè)（lovB和lovF）編碼PKS。如前所述，基因lovB編碼LNKS，而lovF編碼diketide合酶（DKS）。在LNKS和DKS甲基域的存在表示，在這兩種物質(zhì)中甲基組可能是在聚合的過程中由S -腺苷甲硫氨酸添加上去的。此外，該基因的功能可能在很大程度上通過序列的比較而得到預(yù)測(cè)的。對(duì)其功能更多的了解，是通過功能誘變策略的缺失，通過中斷群集中的單個(gè)基因。 現(xiàn)在很清楚，洛伐他汀合成簇包含兩個(gè)I型聚（lovB和lovF）合成酶基因。此外，lovE編

13、碼一個(gè)擁有典型的雙核鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控蛋白質(zhì)。lovE中斷突變體不能產(chǎn)生洛伐他汀或中間體，而過多的中斷突變?cè)斐僧a(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物。據(jù)推測(cè)，lovE在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)洛伐他汀的生產(chǎn)。然而，哈欽森等人于2000年發(fā)現(xiàn)有第二個(gè)具有相似的結(jié)構(gòu)基因lovH。由于Keller和霍恩在1997年發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)次生代謝產(chǎn)物集群包含一個(gè)專門的調(diào)節(jié)基因，所以洛伐他汀生物的合成過程是如何應(yīng)用這兩個(gè)調(diào)控基因的，這并不明顯。另一方面，lovA和ORF 17編碼細(xì)胞色素450單加氧酶。主要nonaketide -派生骨架合成需要LNKS（lovB），還需要至少一種其他蛋白（烯酰還原酶lovC）與LNKS相互作用，并負(fù)責(zé)處

14、理所需要的正確成長(zhǎng)鏈，在沒有l(wèi)ovC的情況下，LNKS就會(huì)形成共軛吡喃酮類化合物。LNKS是包含七個(gè)活性部位的聚酶物質(zhì)，并以某種類似于動(dòng)物脂肪酸合成酶方式和I型PKS的細(xì)菌的功能。此外，LovB正在減少迭代酶，使得病因不同于模塊化、細(xì)菌型酶。LovB的最小領(lǐng)域是反復(fù)使用丙二酰輔酶A合成nonaketide萘烷核心。不同程度的polyketide剪裁后進(jìn)行修改,每個(gè)縮合一步LovB由組合不同催化領(lǐng)域(包括上述所提到的分離enoylreductase,LovC)提供了關(guān)鍵中間體dihydromonacolin L。LovB也包含了一個(gè)C-terminus領(lǐng)域內(nèi)同序列的一個(gè)nonribosomal-

15、peptide合成酶相似的領(lǐng)域。在其領(lǐng)域中，不了解dihydromonacolin生物的功能。最近,催化酶作為一個(gè)個(gè)體的領(lǐng)域已被用來分析生化和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及其他特點(diǎn)。馬和唐(2007)檢查了最小的洛伐他汀nonaketide合成酶didomain與蛋白質(zhì)。他們調(diào)查表明,大多數(shù)檢查的領(lǐng)域都能表示為獨(dú)立的蛋白質(zhì),除了KS領(lǐng)域。LovB墊的顯示板上對(duì)malonyl-CoA acetyl-CoA有強(qiáng)的選擇性。這種LovB墊相比于哺乳動(dòng)物的FAS墊領(lǐng)域顯示明顯的不同特性,特別是在acetyl-CoA基體的特殊性上。有趣的是我注意到, KS和FAS領(lǐng)域的廣泛專一性是針對(duì)外源ACP領(lǐng)域，也提供機(jī)會(huì),讓新穎的p

16、olyketide實(shí)體進(jìn)行組合生物合成。莫納J要求用細(xì)胞色素P450氧酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可能由lovaA和ORF 16基因編碼。 五碳側(cè)單元側(cè)鏈通過乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A縮合合成了其他聚合酶的lovF產(chǎn)品（也稱為作為L(zhǎng)DKS）。由該LDKS組成了七域線性排列，依次是：KS，MAT，DH，MT，ER（enoylreductase），KR，ACP。diketide經(jīng)過剪裁甲基化與還原由單個(gè)LovF催化結(jié)構(gòu)域生產(chǎn)的-S-methylbutyryl tyioester共價(jià)連接到 phosphopantetheine臂?；d體LovF蛋白域 (Kennedy et al. 1999年）。編碼基因lovD 2

17、-mehtylbutyryl/monacolin transesterase催化的最后一步是連接在一起的二聚洛伐他汀，即transacylates組件，酰基從LovF到莫納C8的羥基用來生產(chǎn)洛伐他?。▓D2）。尤其是這種高度降低PKSs類型獨(dú)特的特征之一是缺乏一個(gè)內(nèi)置卸載域以便于完成發(fā)行產(chǎn)品。這是形成鮮明對(duì)比的細(xì)菌I型或非還原PKSs真菌，其中一個(gè)專門的thioesterasedomain是在megasynthase末端追加，催化聚酮所釋的放。如前所述， 從LovF diketide側(cè)鏈轉(zhuǎn)移到莫納 J的羥基是由一個(gè)分離酰基轉(zhuǎn)移酶催化 LovD而生成（Kennedy et al.1999年）。使用

18、策略重組催化領(lǐng)域的個(gè)別酶。 （2009a的）表明，proteinprotein LovF和LovD之間的相互作用在促進(jìn)作用底物從LovF到LovD的diketide快速卸載發(fā)揮關(guān)鍵作用，以確保洛伐他汀的有效合成。也只有完全量身定制，RSmethylbutyryl - 機(jī)場(chǎng)核心計(jì)劃才能由LovD訪問（即無中間體的?；D(zhuǎn)移）。一個(gè)可能的機(jī)制，可以將這一現(xiàn)象解釋為， 甲基轉(zhuǎn)移，脫水和烯酰削減步驟從acetoacetyl-ACP到KS活性部位可能發(fā)生的非常迅速。另一個(gè)可能性是，acetoacetyl-ACP可能無法訪問的 LovD在裁剪步驟。 從應(yīng)用的觀點(diǎn)來看，可以看出，這些知識(shí)對(duì)于品種遺傳改良是非常

19、重要的。例如，來源于洛伐他汀相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列可用于基礎(chǔ)選擇配置報(bào)道，以迅速確定改進(jìn)洛伐他汀生產(chǎn)株，Askenazi等。 （2003年）構(gòu)建的菌株含有l(wèi)ovF啟動(dòng)基因融合的竹葉（phleomycin電阻）。這個(gè)轉(zhuǎn)化子是經(jīng)過誘變和電鍍轉(zhuǎn)化在phleomycin瓊脂培養(yǎng)基上形成的。由此產(chǎn)生抗性種群表現(xiàn)出洛伐他汀的產(chǎn)量顯著增加，可見這是一個(gè)復(fù)雜的有效合理的選拔制度。在其他一方面，有趣的是可以操縱lovB 生成新的化合物。然而，操縱生產(chǎn)的lovF不同側(cè)鏈的化合物是更容易設(shè)想的，刪除這個(gè)基因的活動(dòng)也許會(huì)加進(jìn)一步模塊，可能允許在預(yù)測(cè)生物技術(shù)中生產(chǎn)各種洛伐他汀類似物，用化學(xué)過程策略來代替而合成有價(jià)值的衍生

20、品，像辛伐他汀(見相應(yīng)的部分)。生物合成康帕丁 在P. citrinum and M. ruber中提出對(duì)洛伐他汀和康帕丁碳結(jié)合的研究，預(yù)測(cè)出了新的方法途徑（1985年遠(yuǎn)藤等。查克拉瓦提和Sahai1（2004年）。后來，安倍等。（2002）康怕汀的克隆及其特征從桔青霉康帕丁中使用基因簇中得到類似的策略。九個(gè)基因，mlcA到mlcH和mlcR （調(diào)節(jié)器）在38 kb的區(qū)域集群，當(dāng)康帕丁工作時(shí)分別轉(zhuǎn)錄。這些預(yù)測(cè)的氨基酸是由這九個(gè)基因所編碼的，與洛伐他汀生物合成的編碼基因相似。之后，在mlcA和mlcB和其他一些基因簇的啟動(dòng)子中，特殊途徑的轉(zhuǎn)錄活化劑MlcR化合物序列被確認(rèn)及定位。值得特別注意的是

21、，如果（compactin？）也是如此，引進(jìn)多余拷貝的調(diào)節(jié)基因mlcR提高了代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。洛伐他汀和康帕汀的生產(chǎn)洛伐他汀（mevinolin或者monacolinK）是在馬德里的CIBE實(shí)驗(yàn)室中從一種分離自土壤菌株中獲得的并被分類于土曲霉一類；另外它也可以從M.ruber中獲取(命名為monacolinK)。數(shù)年之后，洛伐他汀也可以從17種不同種屬的monascus中提?。ㄌ貏e是包括M.ruber在內(nèi)的一下菌種）。值得注意的是，種屬monascus中，特別是anka和M purpureus這兩個(gè)菌種,傳統(tǒng)上在亞洲國(guó)家應(yīng)用為“紅曲”為，也應(yīng)用于發(fā)酵食品(紅麴大米)和飲料產(chǎn)品，同時(shí)還有紅色染料。

22、然而,商業(yè)生產(chǎn)洛伐他汀是建立在terreus分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上而且大多數(shù)的文獻(xiàn)資料是關(guān)于這個(gè)菌種的。A.terreus次發(fā)酵通常在約為28°C，pH5.8-6.3，溶氧水平控制在40%的空氣飽和度的條件下進(jìn)行。分批次發(fā)酵一般進(jìn)行大約10天。A.terreus的增長(zhǎng)以及洛伐他汀的生產(chǎn)都是由Casas-Lopez研究的。研究結(jié)果表明洛伐他汀的生產(chǎn)受到了以下類型的碳源(乳糖、甘油但沒有果糖甜)和氮源(酵母提取物、玉米發(fā)酵酒和大豆)的使用影響，并且C：N在培養(yǎng)基中的質(zhì)量比也有影響。慢慢加入代謝的碳源(乳糖)同時(shí)結(jié)合要么豆粕或在N源控制下的酵母，可以提供最高的類似條件和特定的產(chǎn)量。洛伐他汀在生物

23、量方面最大的產(chǎn)量系數(shù)價(jià)值為30毫克/ g，只是在使用乳糖/大豆以及乳糖/酵母提取物作為培養(yǎng)基的條件下。最適的獲得高產(chǎn)量的初始碳氮質(zhì)量比洛伐他汀40。有些研究已開始采用響應(yīng)面的方法確定培養(yǎng)基對(duì)洛伐他汀生的影響。自有了它的發(fā)現(xiàn),洛伐他汀的生產(chǎn)研究就在搖瓶,實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器并且在復(fù)雜和確定的培養(yǎng)基中進(jìn)行。. Novak和Kumar為了提高洛伐他汀的產(chǎn)量提出了不同的分批培養(yǎng)策略，同時(shí)Porcel提出了一個(gè)分兩階段的培育策略。顆粒形態(tài)以及它與在曝氣池中水動(dòng)力條件和洛伐他汀發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基中耗氧量的關(guān)系也同樣進(jìn)行調(diào)查研究。最近,碳源和氮源以及發(fā)酵參數(shù)對(duì)洛伐他汀生產(chǎn)的影響也被Bizukojc和Ledak

24、owics進(jìn)行了評(píng)估檢測(cè)。然而,A.terreus也能夠生物合成其他化合物,從而使工業(yè)生產(chǎn)得凈化階段變得復(fù)雜。一個(gè)主要的生物代謝合成階段是二苯甲酮，同樣對(duì)引發(fā)自一個(gè)聚酮化合物的途徑有反應(yīng)。這種化合物是由典型誘變和篩選出的抑制劑的目標(biāo)產(chǎn)物，并且有助于洛伐他汀增產(chǎn)。獲得采用遺傳工程工具等也會(huì)有同樣的結(jié)果，即基因破壞。另一個(gè)重要的生物代謝合成是geodine,這也是聚酮化合物途徑的一個(gè)產(chǎn)物。一些研究者探索了在控制發(fā)酵參數(shù)的洛伐他汀發(fā)酵過程中降低晶體，特別是在通風(fēng)和pH控制值下降的情況下的對(duì)應(yīng)策略。 用于工業(yè)生產(chǎn)生產(chǎn)過程洛伐他汀生產(chǎn)創(chuàng)立于1980年，當(dāng)時(shí)使用一個(gè)土曲霉A。發(fā)展過程包含了不同發(fā)酵參數(shù)的分

25、析，比如培養(yǎng)的同源性，不同碳源的影響，ph，溶氧量，以及攪拌裝置的設(shè)計(jì)。生產(chǎn)菌株的再分離以及ph控制和緩慢流加碳源，特別是甘油的使用，可以提高產(chǎn)量至最初的五倍。很顯然,生產(chǎn)水平,是達(dá)到了180毫克/升。大部分的工業(yè)生產(chǎn)過程使用攪拌釜反應(yīng)器,連續(xù)或間斷的加入含氮的培養(yǎng)基。P. citrinum 進(jìn)行相似的研究，用來發(fā)展發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)康百汀。幾個(gè)重要的因素影響了康百汀的產(chǎn)量，如真菌的形態(tài)，pH，表面活性劑，培養(yǎng)基組分，以及被研究和優(yōu)化的喂養(yǎng)的策略。在P. citrinum 和 P. cyclopium,的例子中，pellet-like發(fā)酵湯有較低的粘度，比絲狀湯有較高的產(chǎn)量。重要的努力，用來發(fā)現(xiàn)較高

26、的洛伐他汀或康百汀菌株用來商業(yè)生產(chǎn)。菌株突變一般是通過紫外線或化學(xué)誘變劑，進(jìn)而隨機(jī)或者有意的提高產(chǎn)量。這種策略的有效性可以通過巨大增長(zhǎng)的工業(yè)人工變種生產(chǎn)看到。明顯的，A. terreus ATCC 20542（最初的洛弗斯塔特因生產(chǎn)商）的生產(chǎn)效率大概在每升15g。同樣的，康帕丁工業(yè)菌種的生產(chǎn)率也已經(jīng)增長(zhǎng)到了大約15g每升。一種從Streptomyces carbopilus得到的突變體菌種，可以抵抗3 mg/l的康百汀和80%的轉(zhuǎn)換產(chǎn)量被Metkinen (2009)得到。然而，隨著洛伐他汀和康帕丁生物合成物以及其相應(yīng)基因克隆領(lǐng)域知識(shí)的發(fā)展（stepping stones toward），并通

27、過分子遺傳學(xué)技術(shù)方面的進(jìn)步，提高了弗斯塔特因和康帕丁的商業(yè)生產(chǎn)。洛伐他汀的固態(tài)發(fā)酵盡管洛伐他汀傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)是用液面發(fā)酵，然而固體發(fā)酵很快成為了一種可以替代的工業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)。固態(tài)發(fā)酵是一種自古以來被很多東方國(guó)家使用的微生物培養(yǎng)系統(tǒng) ，使用大豆大米等谷物來調(diào)制各種各樣的發(fā)酵食品。在最近的20年不同的固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)出了新的用途功效。幾個(gè)比較研究表明，社保基金理事會(huì)經(jīng)常SMF的優(yōu)勢(shì)，包括更高，更快的生產(chǎn)產(chǎn)品，改善過程。此外，一些抗生素只產(chǎn)于社?；鹄硎聲?huì)，即使相應(yīng)的生產(chǎn)者，真菌可以隨時(shí)在SMF培養(yǎng)。在社?；鹄硎聲?huì)此不同的生理原因尚不完全清楚，但它通常被稱為“固體培養(yǎng)基生理學(xué)”。幾年前，印度B

28、iocon公司開始發(fā)生了什么事情，就成為一個(gè)非常成功的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)洛伐他汀的社?；鹄硎聲?huì)（和其他次生代謝物）。后來，美國(guó)食品和藥物管理局（美國(guó)FDA）批準(zhǔn)臨床藥物社?；鹄硎聲?huì)用于生成真菌的起源（Suryanarayan 2003）。兩種類型的系統(tǒng)社保基金理事會(huì)對(duì)使用的固相性質(zhì)的基礎(chǔ)進(jìn)行區(qū)分：在天然固體基質(zhì)上，這是最常見的系統(tǒng)。顯然，該技術(shù)是基于對(duì)Plafractor，大規(guī)模的社保基金理事會(huì)生物反應(yīng)器的使用，盡管這些發(fā)酵，也可在其他類型的社?；鹄硎聲?huì)反應(yīng)堆進(jìn)行發(fā)酵，甚至在托盤里，其中固體培養(yǎng)加載在薄層托盤和其余的隔幾厘米，放在溫室里。第二個(gè)SSF系統(tǒng)包括對(duì)微生物在在液體培養(yǎng)及表面的生存。這

29、種方法有很多潛在的應(yīng)用，包括在自然研究及高生產(chǎn)商業(yè)系統(tǒng)。差不多所有的惰性支持物都是糖甘蔗，最近Baños et al發(fā)展了一個(gè)新的洛伐他汀生產(chǎn)過程，通過SSF，在一個(gè)人工惰性支持物PUF上。這個(gè)系統(tǒng)使用TUB F-514菌株，固體培養(yǎng)基的理化性質(zhì)可以被控制，30層的洛伐他汀可以被獲得，這與在SMF獲得具有相似的條件。此外，從SSF里每毫克菌絲生產(chǎn)洛伐他汀815g，而每毫克SMF的菌絲體，只生產(chǎn)洛伐他汀54.7g，在SSF里，一個(gè)特定的生產(chǎn)超過14倍。為了了解分子事件在SSF與SMF中代表的不同，作者表明分析了在洛伐他汀的生物合成的兩種基因。結(jié)果表明，在SSF中與高洛伐他汀生產(chǎn)相關(guān)的兩

30、個(gè)基因有較高的轉(zhuǎn)錄積累水平，要有更長(zhǎng)的時(shí)間。lovE比smF要高4.6倍的積累水平，同樣的，lovF與在SMF上獲得的高水平的菌絲比，有高于兩倍的積累。這些結(jié)果表明，第一次，在SSF上高產(chǎn)量的菌絲，是由于其生物合成基因的高轉(zhuǎn)錄。最重要的是，這些高轉(zhuǎn)錄水平是由于lovE的轉(zhuǎn)錄因子的高水平導(dǎo)致。而且，在SSF中的次級(jí)代謝中，這很可能含蓄的導(dǎo)致了它的高產(chǎn)。后來，這組的研究基于環(huán)境刺激，有著產(chǎn)生的理化變化導(dǎo)致菌絲高產(chǎn)。這允許用基因提升方法，產(chǎn)生適用于SSF的高產(chǎn)菌株。用這些方法可以獲得突變，從原生性中獲得。TUB F-514可以再PUF SSF系統(tǒng)中生產(chǎn)每單位27.9mg的菌絲。最近在報(bào)道用SSF生產(chǎn)

31、康百汀，Shaligram在小麥的bran-based SSF中達(dá)到每單位生產(chǎn)0.815mg.這從盤尼西林的野生菌株獲得。普伐他汀的生產(chǎn)盡管康百汀不能用于制藥，他是個(gè)重要的生產(chǎn)普伐他汀的來源，一個(gè)更有效地衍生。在第一階段桔青霉生產(chǎn)康百汀。普伐他汀在第二階段有鏈霉菌中的康百汀的生物轉(zhuǎn)化得到。再生產(chǎn)普伐他汀的幾個(gè)用來工業(yè)神產(chǎn)的有效過程中，進(jìn)行了幾組研究來達(dá)到高轉(zhuǎn)化速率，著通過在培養(yǎng)基中加入大量的康百汀。一個(gè)重要的問題是增加量康百汀會(huì)到至細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。高濃度會(huì)導(dǎo)致菌絲體的分解，康百汀轉(zhuǎn)變成普伐他汀的轉(zhuǎn)化提升。由Park等人提出，設(shè)計(jì)的過程是康百汀的持續(xù)培養(yǎng)，是它的集中濃度在100 mg l1。普伐

32、他汀的產(chǎn)量高于在間斷喂養(yǎng)康百汀時(shí)的1.5倍。另一方面，Chen等人設(shè)計(jì)的快速篩選方法分離康百汀的抑制菌株，對(duì)康百汀的6進(jìn)行羥基化。大約2%的目標(biāo)微生物可以這么篩選獲得。有趣的是，在分離培養(yǎng)基時(shí)找到了可偵查的產(chǎn)物。Ykema 等人的很重要的通知時(shí)用一步生物合成過程生產(chǎn)普伐他汀。通過用S. carbophilus的氫化基因轉(zhuǎn)化P. citrinum菌株，是康百汀轉(zhuǎn)變成普伐他汀。一些轉(zhuǎn)化后的模板可以生產(chǎn)量到達(dá)9.5 mg/L，這很低。一個(gè)低康百汀生產(chǎn)用菌株是要轉(zhuǎn)化的，用來當(dāng)這種模式的例子。通過生物技術(shù)生產(chǎn)辛伐他汀，在菌絲研究的發(fā)展和康百汀的生化和基因，通過生物技術(shù)獲得半合成衍生物也獲得了更多的關(guān)注。

33、例如，辛伐他汀可以通過用康白汀的生物合成直接發(fā)酵，也可以用?；D(zhuǎn)移酶LovD從monacolin J中分解。辛伐他汀從洛伐他汀的半合成中獲得，用Merck as Zocor標(biāo)記。是美國(guó)第二暢銷藥。在2005的年銷量達(dá)到12 billion美元。洛伐他汀與辛伐他汀的不同在側(cè)鏈的8號(hào)位碳原子上。在這個(gè)位置,洛伐他汀攜帶2-methylbutyrate基,sinvastatin有2、2-dimethylbutyrate基。如今人們已習(xí)慣于這種化學(xué)讓洛伐他汀直接烷基化。然而,化學(xué)反應(yīng)條件非常穩(wěn)固,最終產(chǎn)品很難凈化、勞動(dòng)保護(hù)和環(huán)境保護(hù)的要求是非常高的。這幾步過程是辛苦,從而利于辛伐他汀的價(jià)近5倍的高于洛

34、伐他汀。一個(gè)生物技術(shù)的生產(chǎn)方法是辛伐他汀的酶催化合成monacolin J，用?；D(zhuǎn)移酶 LovD.。在2006年, lovD基因克隆在土曲霉菌中,過量的酶表達(dá)在大腸桿菌。通過這種方式，我們不能說它有選擇的轉(zhuǎn)化了在-methylbutyryl的C8組，生產(chǎn)洛伐他汀。作者表明, LovD在面對(duì)酰基組具有廣闊的基體的特殊性。更重要的是LovD用 acyl-CoA可以直接催化monacolin?；蛘哒f，膜滲透酰基供體N-acetylcysteamine(SNAC)thioesters。這工作表明，獲得用LovD作為生物催化用來用-dimethylbutyryl-S-NAC作為基質(zhì)合成辛伐他汀。然而，

35、因?yàn)镸CJ的基質(zhì)的高濃度抑制，需要?；磻?yīng)的低轉(zhuǎn)變。這是由于較弱的聯(lián)合acyl和 lovD，因此MCJ可以競(jìng)爭(zhēng)抑制DMB-S-NAC。后來的研究，認(rèn)識(shí)了動(dòng)力學(xué)的超級(jí)acyl。發(fā)現(xiàn)增加1到3的?；溈梢蕴岣哂H和力。動(dòng)力學(xué)研究表明，增加親和力和轉(zhuǎn)變可以被MCJ的基質(zhì)抑制所保護(hù)。由于經(jīng)濟(jì)原因，選擇的acyl是DMB-S-MMP。因此在這個(gè)外媒的過程中作者得到的不超過60%中間濃度的莫納可林。由于競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，他增加了辛伐他汀到MCJ的轉(zhuǎn)化速率。作為辛伐他汀濃度的增加。這產(chǎn)生了一個(gè)無效的過程。驚奇的是，當(dāng)作者分析外部過程時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)變反應(yīng)能低75倍，暗示這是個(gè)可行的過程。這個(gè)方便的現(xiàn)象是用于解毒機(jī)制，如

36、射流泵。把辛伐他汀從細(xì)胞中帶出來，一起滲透細(xì)胞膜表達(dá)到辛伐他汀。用這種全細(xì)胞的生物催化過程。可以獲得99%的轉(zhuǎn)化率，達(dá)到10 到15 mM or 4 到 6 g/L. 另一項(xiàng)工作使凡是反應(yīng)過程更快更便宜。當(dāng)從大腸桿菌刪除基因H時(shí)，產(chǎn)生YT2菌種，這種基因編碼的酯酶同工酶可以降解側(cè)鏈前體DMB-S-MMP。用這種方法可以用12小時(shí)可以轉(zhuǎn)化15 mM MCJ 和25 mM DMB-S-MMP辛伐他汀。一個(gè)更長(zhǎng)遠(yuǎn)的提升過程包含提升可溶解的LovD在大腸桿菌中的表達(dá)。觀察50%的 LovD酶。由細(xì)菌合成，被認(rèn)為是不溶物的聚合作為應(yīng)用一個(gè)相同模式的策略。在任意蛋白工程中的Cys的替代，Cys是僅有的天然

37、氨基酸，它包含可反應(yīng)的巰基團(tuán)，他可以形成內(nèi)部和外部分子的聯(lián)合。導(dǎo)致在大腸桿菌中不溶蛋白的聚集，在這個(gè)工作里，LovD中的Cys40和Cys60的丙氨酸和精氨酸被替代通過直接為點(diǎn)的突變，雙突變C40/A and C60/N表明在LovD中增加了50%的課溶性和50%的協(xié)同。進(jìn)而增加了整個(gè)LovD細(xì)胞的活力。在這種條件下，整個(gè)細(xì)胞的生物催化過程把MCG轉(zhuǎn)變成辛伐他汀，進(jìn)而在18小時(shí)約產(chǎn)生18 g/L。另一種方法會(huì)操作A. terreus進(jìn)而通過發(fā)酵直接產(chǎn)生辛伐他丁。Van den Berg等人用了這種最新的方法作者提議不活化LovF基因。防止內(nèi)部積累2MB，在這個(gè)過程中，使用A. terreus菌

38、株進(jìn)而可以合成DMB。最近作者表明A. terreus也可以使用DMB作為側(cè)鏈，因此生成辛伐他汀替代洛伐他汀，盡管DMB不是有這些真菌正常生成，替代這些A. terreus通過lovF生成2MB。盡管這些單一的縮合在acetyl-CoA和 a malonyl-CoA。然而作者觀察在這個(gè)反應(yīng)里A. terreus (LovF)可以合并甲基丙二酸單酰輔酶A生成DMB，然后產(chǎn)生洛伐斯丁，盡管是一個(gè)小比例，由于lovf接受malonyl-CoA。這個(gè)問題可以在兩個(gè)階段被解決，通過真菌菌株的修飾。a操作lovF基因合成DMB。在一個(gè)途徑中提供A.terreus用來甲基丙二酸單酰輔酶A的生成。A. ter

39、reus用一個(gè)途徑操作，甲基丙二酸單酰輔酶A的生成，這通過克隆Rhizobium sp malonyl-CoA合成基因，這些酶生產(chǎn)催化malonate到malonyl-CoA的反應(yīng)，表現(xiàn)出不同尋常的高基質(zhì)容忍力，所以體內(nèi)生產(chǎn)甲基丙二酸單酰輔酶A需要甲基丙二酸的喂養(yǎng)。這需要PCR擴(kuò)增，再合適的條件下克隆A.nidulans促進(jìn)子，插入到A. terreus基因組。甲基丙二酸單酰輔酶A可以通過轉(zhuǎn)化生成，當(dāng)培養(yǎng)基持續(xù)喂已甲基丙二酸。在第二個(gè)階段，作者操作lvf繼而增加活性生成dmb，在以前解釋聚酮化合物合成lvf是有下面的幾步組成的，KS MAT DHMTKRERACP。作者操作這個(gè)基因來形成一個(gè)蛋

40、白質(zhì)，進(jìn)而增加活性來生成DMB，這個(gè)被生成是通過替代MAT領(lǐng)域的多孢菌屬的合成deoxyerythronolide B領(lǐng)域的MAT，用lovF。這是通過克隆進(jìn)而生成PgpdA-lovF/hybrid PKS- TpenDE來表達(dá)反應(yīng)。再講這個(gè)構(gòu)建轉(zhuǎn)化給土曲霉，便轉(zhuǎn)運(yùn)到methylmalonyl輔酶A的合成途徑。作者通過交換lovF的MT片段來測(cè)試另一種混合PKS。最后，帶有其他類型雜交無PSk的土曲霉經(jīng)轉(zhuǎn)，在有甲基丙二酸的發(fā)酵液中分批發(fā)酵，產(chǎn)生辛伐他汀。雖然這是一項(xiàng)很有意思的工作，但這項(xiàng)專利的作者應(yīng)用了一個(gè)低產(chǎn)物的土曲霉鏈，并沒有提取到特定的產(chǎn)物。他汀類藥物現(xiàn)有的和潛在用途 流行病學(xué)和病理研究

41、臨床表明，他汀類藥物具有顯著的降血脂作用，因而大大減少冠心病的發(fā)生。（Farnier和Davignon 1998，Galánetal. 2004，Nash 2005，Morideetal.2008，Seenivasan等人 2008）。此外，這些化合物可以預(yù)防中風(fēng)并減少周圍血管疾病的發(fā)生（Maron等人，2000年）。除了在低密度脂蛋白膽固醇方面的應(yīng)用，他汀類藥物還具有其他生物效應(yīng)，包括動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定，修正動(dòng)脈粥樣硬化，改善血管內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，防止血栓的形成（Wang等人 2008; Seenivasan等人 2008年）。他汀類藥物的多重效應(yīng)日益受到認(rèn)可，并可有在臨

42、床上廣泛應(yīng)用與心血管和非心血管方面（Davignon and Leiter 2005年）。這有關(guān)于他汀類藥物還可以抑制類異戊二烯合成這一事實(shí)（farnesylpyrophosphate 和geranylgeranylpyrophosphate），異戊二烯是細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子重要的脂肪物質(zhì)。因此，有人認(rèn)為，他汀類藥物可能通過直接抑制GTP結(jié)合蛋白的作用，因而會(huì)有 “多效”效果，（Ras,Rho,Rac,and Rap圖3）。鑒于isoprenylated蛋白質(zhì)可以不同的細(xì)胞功能，他汀類可能具有降低血脂以外的其他效果這就并不奇怪了（Wang等人，2008年）。最近的數(shù)據(jù)表明，他汀類可以直接影響增殖和

43、凋亡的平衡，降低炎性趨化因子，這些G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞喜好的傳遞。（Seenivasan等人2008年）。由于他汀類具有多種功能，這些藥物被懷疑可能會(huì)引起慢性疾病。代謝癥候群（MTS）和糖尿?。―M）：由于患者具有血脂異常，血糖升高，高低密度脂蛋白膽固醇和高血壓等的危險(xiǎn)因素，因而得名代謝癥候群。這與2型糖尿病和易患心血管疾病緊密聯(lián)系。 代謝癥候群和糖尿病都與相關(guān)炎癥流程有關(guān)（Nash 2005年）。他汀類藥物可能有溫和的降壓效果，并能促進(jìn)冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)，改善心臟衰竭狀況，并可能對(duì)糖代謝和胰島素敏感性良好的效果 （Massy和Guijarro 2001年）。他汀類藥物治療的幾個(gè)試驗(yàn)結(jié)果表明，這些藥

44、物降低了糖尿病患者心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)（Nash 2005年）。 癌癥：幾種研究表明，接受他汀類藥物的癌癥患者發(fā)病率在降低。該AFCAPS / TexCAPS試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新的黑色素瘤的發(fā)病率顯著下降，說明洛伐他汀具有預(yù)防心血管疾病的功效。他汀類藥物對(duì)心血管預(yù)防實(shí)驗(yàn)證明了癌癥患者死亡率在下降（Dulak和Józkowicz 2005年）。此外，最近觀察研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用他汀類藥物以后，各種癌癥（結(jié)腸癌，乳腺癌）的風(fēng)險(xiǎn)大大減少（20-55）（Bonovas等人2006，Glynn等人2008年）。他汀類藥物對(duì)Ras和Rho蛋白異戊烯化的作用或許可以解釋為對(duì)腫瘤細(xì)胞的效果，因?yàn)镽as突變發(fā)現(xiàn)了大約30

45、的癌癥患者。體外研究證實(shí)了這種效果，因?yàn)樗☆愃幬镆种萍?xì)胞增殖，并引發(fā)細(xì)胞凋亡腫瘤細(xì)胞（Dulak和Józkowicz 2005，Glynn等人，2008年）。但是，仍然有一些不一樣結(jié)果（Glynn等 2008; Bonovas等 2006年） 骨質(zhì)疏松癥：他汀類藥物也被認(rèn)為可以運(yùn)用與骨骼方面的疾病，如骨質(zhì)疏松癥（Pahan 2006年）。其中一個(gè)最近的趨勢(shì)是，洛伐他汀用于可以治療骨骨折。Mundy等人第一次發(fā)現(xiàn)他汀類藥物對(duì)骨形成也有一定作用（1999年）。后來，流行病學(xué)研究表明，他汀類藥物對(duì)骨密度有有利影響，減少了骨折的危險(xiǎn) （Edwards和Spector 2002年; Pahan 2006年）。辛伐他汀，美伐他汀，fluxastatin，以及洛伐他汀都能夠刺激骨形成（Edwards和Spector 2002年）。 不過，他汀類藥物對(duì)骨作用的機(jī)制仍有待進(jìn)一步了解（Cummings和Bauer 2000年）。 阿茲海默?。毫餍胁W(xué)研究表明他汀類藥物可以降低老年癡呆癥即阿茲海默病的風(fēng)險(xiǎn)（AD;Pedrini等