三黃益腎膠囊防治糖尿病腎病實驗研究

1、    三黃益腎膠囊防治糖尿病腎病實驗研究    呂樹泉 路菲菲 蘇秀海 王元松摘要 目的：比較三黃益腎膠囊與雷米普利膠囊對糖尿病腎病（dn）的干預(yù)作用，探析腎臟保護(hù)深層機(jī)制，為臨床防治dn提供實驗依據(jù)。方法：選用雄性sd大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組、雷米普利組、三黃益腎膠囊低劑量（0.4 g/kg）組、三黃益腎膠囊中劑量（0.8 g/kg）組、三黃益腎膠囊高劑量（1.6 g/kg）組6組，每組10只。給藥治療8周后，檢測各組大鼠肌酐（scr）、尿素氮（bun）、三酰甘油（tg）、總膽固醇（tc）及24 h尿微量白蛋白等指標(biāo)。光鏡下觀察

2、腎臟形態(tài)學(xué)變化。免疫組化觀察腎病蛋白（nephrin）、單核細(xì)胞超化蛋白-1（mcp-1）、胰島素樣生長因子（igf-1）蛋白表達(dá)，rt-pcr觀察nephrin mrna、mcp-1mrna及igf-1mrna表達(dá)水平。結(jié)果：造模后大鼠tg、tc、scr、bun、24 h尿微量白蛋白、mcp-1及igf-1mrna水平均明顯升高（p<0.05），nephrinmrna表達(dá)明顯降低（p<0.05），nephrinmrna水平明顯上升（p<0.05），并能改善大鼠腎組織病變。結(jié)論：三黃益腎膠囊可能通過下調(diào)igf-1、mcp-1mrna表達(dá)，上調(diào)nephrinmrna表達(dá)，改善腎

3、組織病變并起保護(hù)作用。關(guān)鍵詞 三黃益腎膠囊;糖尿病腎病;基因;蛋白;腎臟保護(hù)experimental study on the prevention and treatment of diabetic nephropathy of rats with sanhuang yishen capsuleslyu shuquan1，lu feifei2，su xiuhai1，wang yuansong1（1 department of endocrinology，cangzhou integrated traditional chinese and western medicine hospital

4、affiliated to hebei university of traditional chinese medicine，cangzhou 061001，china; 2 graduate school of hebei university of traditional chinese medicine，shijiazhuang 050200，china）abstract objective：to compare the intervention effects of sanhuang yishen capsules and ramipril capsule on rats with d

5、iabetic nephropathy，and to analyze the deep mechanism of renal protection，and to provide reliable experimental basis for clinical prevention and treatment of diabetic nephropathy.methods：male sd rats were selected and used and they were divided into 6 groups according to the random number table，name

6、ly a blank control group，a model control group，a ramipril group and the a sanhuang yishen capsules low，medium and high doses（0.4，0.8，1.6）g/kg groups，with 10 rats in each group.after 8 weeks of drug administration，the indexes of creatinine，urea，triglyceride，total cholesterol and 24 h urinary protein

7、were measured in each group.the morphological changes of the kidneys were observed under light microscope.the expression of nephrin，mcp-1 and igf-1 protein expression were observed by immunohistochemistry.the expression of nephrin mrna，mcp-1 mrna and igf-1 mrna were observed by rt-pcr.results：after

8、modeling，the levels of triglyceride，total cholesterol，creatinineq，urea，24-hour urinary microalbumin，mcp-1 and igf-1 mrna were significantly increased（pkeywords sanhuang yishen capsules; diabetic nephropathy; gene; protein; kidney protection：r285.5：adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.014糖尿病腎?。╠iabe

9、tic nephropathy，dn）是一種以持續(xù)性蛋白尿為特征的臨床綜合征，表現(xiàn)為腎小球濾過率進(jìn)行性下降，血壓升高，心血管發(fā)病率和死亡率增加，為糖尿病患微血管嚴(yán)重并發(fā)癥之一1。據(jù)統(tǒng)計，20%40%的1型糖尿病與2型糖尿病會發(fā)展為dn2，更以42.8%的高比例成為終末期腎病（esrd）首要病因3。dn發(fā)病機(jī)制雖然研究較多但仍闡釋不明，涉及遺傳因素、糖脂代謝紊亂、炎性遞質(zhì)、細(xì)胞因子、生長因子等諸多方面，是綜合作用的結(jié)果。單核細(xì)胞超化蛋白-1（mcp-1）、胰島素樣生長因子（igf）等在dn發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明確。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)推崇以對癥治療為主，飲食調(diào)攝等為輔，嚴(yán)格限制蛋白攝入，控制血糖、血壓，糾

10、正脂代謝紊亂，進(jìn)而改善腎臟微循環(huán)，但多治標(biāo)不治本，同時acei類藥物易引起干咳、升高血鉀等，療效不穩(wěn)且不良反應(yīng)大。而中醫(yī)眾多醫(yī)家認(rèn)為本病病因病機(jī)在于“氣陰兩虛，腎絡(luò)瘀阻”，依此組方，辨證用藥療效顯著4。本研究所用的三黃益腎膠囊由第六批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師蘇秀海主任醫(yī)師及河北省名中醫(yī)王元松教授經(jīng)驗方轉(zhuǎn)化而來，立論于早期腎病的病機(jī)為脾腎氣陰兩虛夾瘀血，治以“益氣養(yǎng)陰，健脾補(bǔ)腎，活血通絡(luò)”5，用之臨床初顯療效，但與西藥療效的比較研究較少，深層機(jī)制待揭示。本研究采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，stz）制備大鼠dn模型，采用rt-pcr檢測三黃益腎膠囊對大鼠模型腎組織n

11、ephrin、mcp-1、igf-1 mrna表達(dá)的影響，從分子水平探討其可能的作用機(jī)制，為中藥治療dn提供新的思路。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動物 健康雄性sd大鼠60只，體質(zhì)量210230 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供，動物合格證號11401300065459，許可證號syxk（津）2014-0002。自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，環(huán)境溫度（20±2），濕度40%70%。12 h/12 h明暗晝夜交替（倫理審批號：2017091）。1.1.2 藥物 三黃益腎膠囊（由黃芪、西洋參、山藥、山茱萸、菟絲子、黃精、地黃、芡實、金櫻子、益母草、丹參、川芎、蒼術(shù)、

12、赤芍、王不留行組成），河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室制備，批號：z20050795。按比例加入純凈水制成混懸液。雷米普利賽諾菲（北京）制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字h20060766。1.1.3 試劑 鏈脲佐菌素（stz）（sigma公司，美國，貨號：l-2880）。trizol（invitrogen，貨號：15596-026）;氯仿（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，貨號：a14140）;異丙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，貨號：1.01040.4008）;無水乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，貨號：10009218）;depc水（北京索萊寶科技有限公司，貨號：rt121-02）;tianscript r

13、t kit（天根生物科技有限公司，貨號：kr107）;superreal premix plus（sybr green）（天根生物科技有限公司，貨號：fp205-01）。1.2 方法1.2.1 分組及模型制備 健康sd大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法選出10只作為正常組，剩余50只作為造模組。造模采用stz誘導(dǎo)建立dn大鼠模型6，造模前禁食12 h，一次性腹腔注射stz（65 mg/kg）。stz用前使用枸櫞酸鈉緩沖液（0.1 mol/l，ph=4.5）配制，在10 min內(nèi)用完;72 h后，尾靜脈取血測血糖，連續(xù)3次，取平均值，血糖16.7 mmol/l為造模成功，成功率

14、約為70%，剔除未成模大鼠。造模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、雷米普利組、三黃益腎膠囊高觀察組、三黃益腎膠囊中觀察組、三黃益腎膠囊低觀察組5組，每組10只，另10只作為正常組，共計6組。正常組與模型組以蒸餾水灌胃，1次/d。三黃益腎中劑量觀察組（18 g溶于50 ml水中，2 ml/只/d）、高劑量觀察組（24 g溶于50 ml水中，2.5 ml/只/d）、雷米普利組（2.5 mg/片）溶于50 ml水中，2 ml/只/d）。4組均1次/d，連續(xù)8周。實驗期間未使用胰島素和其他降糖藥物。1.2.2 樣品制備 所有大鼠模型給藥8周后，以頸靜脈采血后處死。所采血液放置于離心機(jī)，3 000

15、r/min高速離心15 min，取上清液，置于-80 備用。取大鼠雙側(cè)腎臟，濾紙清潔表面血漬，另取部分腎臟組織放置于4%多聚甲醛液中固定，其余剩余腎臟組織則-80 保存?zhèn)溆谩?.2.3 蘇木素刊尹紅（he）染色 取腎臟組織進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋，切片，石蠟切片厚度為4 m，進(jìn)行he染色，顯色后顯微鏡下觀察組織病理變化。1.2.4 免疫組化法檢測 采用免疫組化法檢測腎組織中nephrin、單核細(xì)胞超化蛋白-1（mcp-1）、胰島素樣生長因子（igf）表達(dá)，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，加一抗1100兔抗鼠nephrin、mcp-1、igf-1，4 過夜。二抗選用1400稀釋山羊抗兔抗體，嚴(yán)格按照n

16、ephrin、mcp-1、igf-1試劑盒說明操作，計算nephrin、mcp-1、igf-1蛋白表達(dá)相對含量。1.2.5 rt-pcr 采用trizol提取組織樣本中總rna，步驟如下：1）用研缽研磨組織樣品，于加有1 ml trizol的離心管中，靜置510 min;2）加入0.2 ml氯仿上下劇烈混勻1530 s，然后靜置3 min（冰浴或室溫）;3）4 ，12 000 r/min，離心15 min，離心半徑13.5 cm;4）取水相到新的ep管中，加入0.5 ml異丙醇，混勻，冰浴10 min;5）4 ，12 000 r/min，離心10 min，離心半徑13.5 cm;6）傾倒上層液

17、體，用75%冰乙醇沉淀（1 ml），混勻;7）4 ，12 000 r/min，離心5 min，離心半徑13.5 cm;8）干燥。加入depc處理水溶解rna，測濃度，-80 保存。后取5 lrna用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測rna的完整性。再用tianscript rt kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，用rnase-free ddh2o將反應(yīng)體系稀釋到50 l，-20 保存。最后用熒光定量pcr儀，采用2-ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)相對定量分析，計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個樣品相對于對照樣品目的基因mrna轉(zhuǎn)錄水平的差異。1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用spss 18.0統(tǒng)計軟件

18、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，自身前后對照比較應(yīng)用配對t檢驗;計數(shù)資料比較采用2檢驗。以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 各組大鼠治療后24 h尿微量白蛋白定量比較與正常組比較，模型組、雷米普利組、三黃益腎膠囊各劑量組24 h尿微量白蛋白定量均明顯升高（均p<0.05）。見表1。2.2 各組大鼠治療后bun、scr、tg及tc水平比較與正常組比較，模型組scr、bun、tg、tc等水平明顯升高，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）;與模型組比較，雷米普利組、三黃益腎膠囊低劑量組、三黃益腎膠囊中劑量

19、組及三黃益腎膠囊高劑量組的tg、tc、scr、bun明顯降低（p<0.05）;與雷米普利組比較，三黃益腎膠囊低、中、高劑量組tg、tc、scr、bun明顯降低（p<0.05）。2.3 各組大鼠治療后nephrin mrna、mcp-1mrna、igf-1mrna表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組igf-1mrna及mcp-1mrna表達(dá)顯著升高（p<0.05）;與模型組比較，雷米普利組及三黃益腎膠囊高、中、低組igf-1mrna及mcp-1mrna表達(dá)均降低（p<0.05），而nephrinmrna表達(dá)升高，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），其中三黃益

20、腎膠囊高劑量組療效更佳（p<0.05）。見表3。2.4 各組大鼠治療后nephrin、mcp-1、igf-1蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組igf-1及mcp-1蛋白表達(dá)顯著升高（p<0.05），而nephrin蛋白表達(dá)顯著降低（p<0.05）;與模型組比較，三黃益腎膠囊高、中、低劑量組igf-1及mcp-1蛋白表達(dá)均降低明顯（p<0.05），而nephrin蛋白表達(dá)升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），其中三黃益腎膠囊高劑量組療效更佳（p<0.05）。見圖1。2.5 三黃益腎膠囊不同劑量對大鼠腎組織病理改變的影響 he染色可見：空白組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)大致正

21、常;模型組大鼠腎小球體積增大，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，部分腎小管上皮顯示空泡樣變性，間質(zhì)區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤。各觀察組大鼠腎臟組織病理損傷，均較模型組大鼠有不同程度的減輕，其中以三黃益腎膠囊中劑量組、三黃益腎膠囊高劑量組、雷米普利組大鼠損傷減輕更為明顯。見圖2。3 討論dn科歸于中醫(yī)學(xué)“虛勞”“腎勞”“水腫”“腎消”“關(guān)格”“尿濁”之列，屬于消渴并發(fā)水腫范疇7?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病屬于內(nèi)分泌代謝常見病，患者常伴眼、腎、血管、神經(jīng)等組織器官病變等多種慢性并發(fā)癥，以持續(xù)性蛋白尿，頑固難愈為顯著臨床特點(diǎn)。常通過控制血糖、血壓、血脂等治療，同時采用維生素或礦物質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)充治療8。主要依賴藥物是acei或ar

22、b降壓藥、蛋白激酶c抑制劑或羅格列酮等ppar-激動劑等，雖短期降糖作用明顯，但治療方法單一且不良反應(yīng)較大，危重病患療效不顯著9。近些年諸多研究顯示：dn的發(fā)生、發(fā)展與糖代謝紊亂及腎臟血流動力學(xué)改變存在密切關(guān)系，同時與多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)、遺傳基因易感性、氧化應(yīng)激等因素存在相關(guān)性10。本研究中，我們設(shè)置三黃益腎膠囊高、中、低劑量組，同時比較臨床常用西藥雷米普利11，結(jié)果顯示三黃益腎膠囊對于dn大鼠的異常指標(biāo)調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于雷米普利，表現(xiàn)出優(yōu)于西藥的治療效果，與既往實驗結(jié)果相吻合12。三黃益腎膠囊由黃芪、當(dāng)歸、芡實、生地黃等組成。臨床研究發(fā)現(xiàn)益腎膠囊可明顯降低24 h尿微量白蛋白含量，改善dn患者

23、臨床癥狀13-14，近期研究也提出聯(lián)合用藥，比如聯(lián)合胰激肽原酶腸溶片治療dn效果更好15。但是其中機(jī)制如何，一直未研究清楚。研究表明：劉秀麗等16研究認(rèn)為三黃益腎膠囊通過下調(diào)腫瘤壞死因子（tnf-）表達(dá)，上調(diào)腎臟基質(zhì)金屬蛋白酶（mmp-9）表達(dá)而延緩糖尿病大鼠的腎臟損害。另有研究也提出三黃益腎膠囊可能通過升高dn大鼠腎組織勻漿no及nos含量而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用17。遲秀娥等既往研究提示三黃益腎膠囊可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子1（tgf-1）和血管內(nèi)皮生長因子（vegf）在腎臟的表達(dá)延緩糖尿病大鼠的腎損傷12。但三黃益腎膠囊具體通過何種機(jī)制治療dn尚存在爭議。本研究中，我們聚焦nephrin、mcp-

24、1、igf-1等關(guān)鍵位置的基因與蛋白表達(dá)水平，試圖探索其可能的dn大鼠腎臟保護(hù)機(jī)制。一方面，dn患者蛋白尿的產(chǎn)生與裂孔隔膜關(guān)系密切，裂孔隔膜是連接相鄰足細(xì)胞足突間的特殊蛋白復(fù)合體，nephrin是其上重要跨膜蛋白，異常表達(dá)會造成過膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能障礙。本研究中，模型大鼠給藥三黃益腎膠囊后，nephrin基因及蛋白表達(dá)升高。另一方面，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在腎組織的廣泛浸潤與dn有關(guān)，mcp-1是其特異性的趨化因子，具有單核巨噬細(xì)胞特異性趨化激活作用，對其具有很強(qiáng)的趨化作用，可促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生。banba等18認(rèn)為dm患者的系膜細(xì)胞產(chǎn)生的mcp-1在對單核巨噬細(xì)胞的浸潤及激活中起了重要作用，并

25、且導(dǎo)致和加重了dn。本研究中，模型大鼠給藥三黃益腎膠囊后，mcp-1水平降低，從而抑制腎臟表達(dá)多種因子，降低血管通透性，改善蛋白尿19。另外，igf-1作為多肽類神經(jīng)營養(yǎng)因子，具備廣泛生物學(xué)活性，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織生長，促進(jìn)骨骼生長和細(xì)胞的分化成熟等。其結(jié)構(gòu)和功能類似于胰島素，能發(fā)揮胰島素樣作用，提高機(jī)體胰島素敏感性，影響外周組織對葡萄糖的攝取來維持正常血糖20。許多研究表明：igf-1不但可有效地改善糖代謝，還可改善脂代謝21。igf-1會伴隨dn大鼠血糖升高而升高，且當(dāng)腎小球位于高糖環(huán)境中時，igf-1以自分泌方式在腎臟中合成增加。本試驗提示三黃益腎膠囊可能通過降低血糖、改善腎小球微循環(huán)下

26、調(diào)igf-1含量，達(dá)到保護(hù)腎臟的作用。早期研究表明：dn早期患者的腎小球濾過率增加與腎微血管增殖是一種可逆的病理變化，故抑制腎微血管病理變化對于健康恢復(fù)至關(guān)重要22。張戟風(fēng)等光鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變后發(fā)現(xiàn)：dn模型大鼠的腎組織表現(xiàn)為腎小球內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、系膜細(xì)胞增多，腎小管上皮腫脹，部分壞死且腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤。但三黃益腎膠囊可起到腎組織改善作用23。故在本研究中，我們通過成功建造dn大鼠模型，取樣并進(jìn)行he染色，發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠腎臟組織細(xì)胞出現(xiàn)增生，排列混亂且腎小球內(nèi)細(xì)胞減少。進(jìn)行干預(yù)后，取樣所得大鼠腎臟組織細(xì)胞排列整齊，腎小球內(nèi)細(xì)胞無明顯變化，進(jìn)而從細(xì)胞形態(tài)層面證實了三黃益腎膠囊對腎細(xì)胞

27、的修復(fù)作用?？傊狙芯客ㄟ^實驗觀察到三黃益腎膠囊對nephrin、mcp-1、igf-1基因及蛋白表達(dá)的影響和dn大鼠腎臟給藥前后的形態(tài)變化，證實了三黃益腎膠囊對dn大鼠的腎臟保護(hù)作用，同時推測三黃益腎膠囊可能通過上調(diào)nephrin及下調(diào)mcp-1、igf-1基因及蛋白表達(dá)以減少蛋白尿，保護(hù)腎臟。致謝：本實驗研究的順利進(jìn)行，感謝河北省王元松名中醫(yī)傳承工作室的資金贊助及科研相關(guān)支持。參考文獻(xiàn)1umanath k，lewis jb.update on diabetic nephropathy：core curriculum 2018j.american journal of kidney dis

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