細(xì)胞周期同步化

1、細(xì)胞周期同步化在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞多處于不同的細(xì)胞周期時(shí)相中，其中有少數(shù)細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂活動(dòng)，其余細(xì)胞分別處于G1、S和G2各期。不同時(shí)相的細(xì)胞對(duì)藥物干預(yù)存在不同反應(yīng)，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，因此，需要獲得周期一致性的細(xì)胞。利用細(xì)胞同步化技術(shù)可使細(xì)胞大 量的處于同一細(xì)胞時(shí)期，并可獲得該時(shí)期大量的物質(zhì)，如細(xì)胞中期時(shí)的染色體。細(xì)胞周期同步化 （synchronization） 是指為了研究某一時(shí)相細(xì)胞的代謝、增殖、基因表達(dá)或凋亡， 借助某種自然或人為的實(shí)驗(yàn)手段 , 使細(xì)胞群體中處于細(xì)胞周期不同時(shí)相的細(xì)胞停留在同一時(shí) 相（除了 G0期的細(xì)胞）的現(xiàn)象。細(xì)胞同步化本質(zhì)上包括用一定的方法獲得一定數(shù)量的同步

2、 化細(xì)胞群和使細(xì)胞進(jìn)入同步化生長(zhǎng)的兩層含義。DNA合成抑制法是通過(guò)抑制DNA合成將細(xì)胞同步于同一時(shí)期的方法。高濃度 TdR（胸腺嘧 啶核苷 ）雙阻斷法是目前常用的抑制 DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制 DNA 合成，而 不影響其他時(shí)期細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終可將細(xì)胞群阻斷在 S 期或 G1 /S 交界處。其原理是 : Td R是細(xì)胞DNA合成不可缺少的前體，但向培養(yǎng)基中加入過(guò)量TdR，可形成過(guò)量的三磷酸腺苷，后者能反饋抑制其他核苷酸的磷酸化，從而抑制DNA 合成。它將細(xì)胞同步于 G1 /S 期交界處，同步化程度高，適用于任何培養(yǎng)體系，可將幾乎所有的細(xì)胞同步化，但是容易產(chǎn) 生非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體

3、積增大。 TdR 雙阻斷法因?yàn)楹?jiǎn)單易行且可逆，在腫瘤藥理方面 對(duì)細(xì)胞周期同步化的實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。羥基脲、5-氟脫氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高濃度 ADR GDR也屬于DNA合成抑制劑，它們與 TdR作用相似，均可通過(guò)抑制 DNA合成達(dá)到同步化的目的。中期阻斷法是利用破壞微管的藥物將細(xì)胞阻斷在M期從而得到同一時(shí)期細(xì)胞的方法，常用的藥物有秋水仙素等。秋水仙素通過(guò)抑制微管的聚合，進(jìn)而抑制有絲分裂裝置的形成， 將細(xì)胞阻斷于有絲分裂中期然后再釋放使細(xì)胞達(dá)到同步化。中期阻斷法非平衡生長(zhǎng)問(wèn)題不 明顯，但可逆性比較差，當(dāng)阻斷時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，許多細(xì)胞產(chǎn)生異常分裂。過(guò)去研究中也發(fā)現(xiàn)， 同步后的細(xì)胞的生長(zhǎng)能

4、力明顯不如撤去阻斷劑后得到的S期細(xì)胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole 也是目前常用的中期阻斷劑。經(jīng)過(guò)同步化之后的細(xì)胞可以通過(guò) 流式細(xì)胞術(shù) 對(duì)其周期進(jìn)行分析。將細(xì)胞用 PI （碘化丙啶） 染液進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比。由于細(xì)胞的DNA含量在不同時(shí)期有顯著的差異，因此可以將細(xì)胞分成G1/G0期（1倍），S期（1-2倍）和G2/M期（2倍）。流式細(xì)胞儀可以根據(jù) DNA含量在不同時(shí)間 內(nèi)的變化,從而確定細(xì)胞周期的長(zhǎng)短,也可以直接標(biāo)記 DNA復(fù)制（放射性同位素標(biāo)記），統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量與標(biāo)記細(xì)胞的百分比 , 對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行綜合分析 .連續(xù)分裂的

5、細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)過(guò)程為細(xì)胞周期（cell cycle）。細(xì)胞周期包含四個(gè)階段：G1期（first gap）,又稱合成前期，指前一次有絲分裂完成到 DNA復(fù)制前的一段時(shí)期； S期（synthesis phase）,即DNA合成期，為真核細(xì)胞分裂（cell pision） 間期中進(jìn)行DNA合成的階段；G2期（second gap）,為DNA合成 后期，指DNA合成結(jié)束至有絲分裂開始之間的一個(gè)階段； M期（mitosis or pision）, 又稱D期，是染色體真正開始分離時(shí)期。細(xì)胞周期又可分為有絲分裂期（M期）和分裂間期（即GHStG2）兩個(gè)時(shí)期。盡管細(xì)胞

6、周期中各期的持續(xù)時(shí)間因不同細(xì)胞類型而異，但相 對(duì)而言M期最短，S期較長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀（flow cytometer ; FCM的工作原理是在樣品管 中放入待測(cè)細(xì)胞，在氣體的壓力下使待測(cè)細(xì)胞進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。在細(xì)胞流動(dòng)室里單 細(xì)胞懸液被鞘流液包繞通過(guò)流動(dòng)室內(nèi)一定孔徑的孔，形成細(xì)胞柱。然后通過(guò)對(duì)流動(dòng)液體中 單列的細(xì)胞進(jìn)行逐一檢測(cè)，得到單個(gè)細(xì)胞的光散射和熒光指標(biāo)，在功能水平上定量分析出 其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、 DNA RNA蛋白質(zhì)、抗原等的物理、化學(xué)特征等多個(gè)參數(shù)。流式細(xì)胞 儀不僅可以根據(jù)不同時(shí)間內(nèi)DNA含量的變化來(lái)確定細(xì)胞周期的長(zhǎng)短，還可以直接用放射性同位素標(biāo)記DNA復(fù)制，通過(guò)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目與比較各時(shí)

7、相細(xì)胞的百分比來(lái)檢測(cè)是否達(dá)到預(yù)期 目的，從而對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)相進(jìn)行綜合分析。流式細(xì)胞分析法與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比， 具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。Hela細(xì)胞周期時(shí)間為21 h，其中G1期為10 h , S期為7 h , G2期為3 h , M期為1 h 。、S期同步化方法（胸腺嘧啶核苷雙阻斷法，兩次可讓細(xì)胞同步化到G1/S期）胸腺嘧啶核苷（TdR）雙阻斷法：在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的培養(yǎng)基中首次加入過(guò)量的DNA合成抑制劑TdR能可逆地抑制 S期細(xì)胞的DNA生成，而不作用其他細(xì)胞階段的運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致大 多數(shù)細(xì)胞群被同步化于 G1/S期交界處，但仍有部分細(xì)胞處于S

8、期范圍；移去胸腺嘧啶核苷，細(xì)胞再培養(yǎng)一段比 S期較長(zhǎng)而短于 G2、M G1三期總和的時(shí)間，讓它們完全越過(guò)S期，但又不使按周期發(fā)展最快的細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)S期。第二次胸腺嘧啶核苷處理，當(dāng)細(xì)胞繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)至G1/S交界處時(shí)，被過(guò)量的胸腺嘧啶核苷抑制而停止。細(xì)胞則于G1/S期邊界匯集，再次撤掉胸腺嘧啶核苷，加入完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，則細(xì)胞同時(shí)啟動(dòng)于S期。5-氟脫氧尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高濃度AdR和GdR等 DNA合成抑制劑均可抑制DNA合成使細(xì)胞同步化，由于高濃度胸腺嘧啶核苷對(duì)S期細(xì)胞的毒性較小，因此常用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法誘導(dǎo)細(xì)胞同步化。其優(yōu)點(diǎn)是同步化程度高，適用于任何培養(yǎng)體系。幾

9、乎可將所有的細(xì)胞同步化，缺點(diǎn)是造成非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體積增大。M期同步化方法（振蕩收集法）該法利用M期細(xì)胞變圓易脫落的特點(diǎn)。在處于對(duì)數(shù)增殖期的單層貼壁細(xì)胞（分裂活躍，M期多）中加入 Nocodazole。一段時(shí)間后，多數(shù)細(xì)胞被阻滯與M期，輕輕振蕩或拍擊培養(yǎng)瓶，M期細(xì)胞則與瓶壁脫離，懸浮在培養(yǎng)液中，收集培養(yǎng)液，之后再加入新鮮培養(yǎng)液，按照此 法繼續(xù)收集，可得到一定數(shù)目的M期細(xì)胞。振蕩收集法操作簡(jiǎn)單，同步化程度高并且細(xì)胞不受藥物傷害，能夠真實(shí)反映細(xì)胞周期狀況，缺點(diǎn)是由于M期較短，被分離出的細(xì)胞很少，只能應(yīng)用于貼壁細(xì)胞。收集到的有絲分裂期的細(xì)胞可以貯存在冰上，然后處理其余的培養(yǎng) 瓶。三 . 實(shí)驗(yàn)用品

10、1. 材料： Hela 細(xì)胞。2. 試劑：0.25%胰蛋白酶液、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液、DAPI試劑、Hank' s液、2mmol/L TdR、70%乙醇（保存于 4C）、RNase-A （10mg/ml,-20 C保存）、PI （650 g/ml，避光保存于- 20C）、PBS （pH 7.4保存于4C ）、秋水仙胺、秋水仙素。3. 器材：培養(yǎng)瓶、移液器、槍頭、 5ml 注射器、試管、離心管、封口膜、微量移液器、Tips、燒杯、廢液缸、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備、倒置顯微鏡、臺(tái)式離心機(jī)、水浴、4 C冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、N2罐、流式細(xì)胞儀、超凈工作臺(tái)。四. 實(shí)驗(yàn)步驟（一）S期同步化方法（TdR雙阻斷法）

11、（1）取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。（2）第一次阻斷：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的培養(yǎng)基換成含2mmol/L的新鮮TdR培養(yǎng)液。（3）37 C、5%CO二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12h（4）第一次釋放：棄去含有胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基，用Hanks液對(duì)貼壁細(xì)胞漂洗 23次，并更換不含 TdR的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 16h。（5）第二次阻斷：棄去培養(yǎng)液，再加入濃度為2mmol/LTdR的新鮮培養(yǎng)基，37C、5%CO培養(yǎng) 12h。（6）第二次釋放：重復(fù)第（4）步驟，此時(shí)的細(xì)胞大部分出去G1/S期邊界，同步化細(xì)胞隨時(shí)間推移逐漸進(jìn)入 S期。（二）M期同步化方法（振蕩收集法）（1）取生長(zhǎng)于占瓶底面積 60%80%的細(xì)胞一瓶，輕輕搖晃

12、或拍擊培養(yǎng)瓶，使松動(dòng)細(xì)胞 脫落而懸浮在培養(yǎng)液中，并用離心管收集。(2) 用Hank洗滌2次，漂洗液收集到離心管。2.5 X 105個(gè)/ml接種于培養(yǎng)(3) 600rpm離心5分鐘，并用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為 瓶。(三) 利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期時(shí)相(1) 將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，用Hanks液洗滌細(xì)胞一次，胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止，收集細(xì)胞。1200rmp 5min離心，棄去上清。(2) 4 C預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞沉淀2次，1500rmp離心5分鐘，收集細(xì)胞。(3) 快速將細(xì)胞懸液注入預(yù)冷的70%乙醇中，封口膜封口。4 C固定過(guò)夜(可長(zhǎng)至 2周)。1500rmp 離

13、心5分鐘去固定液，收集固定細(xì)胞，用0.4mL PBS使細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)至試管中吹打均勻(防止細(xì)胞破碎)。PBS漂洗2次。(5) 細(xì)胞染色液配制：40 X加碘化丙啶(PI)母液(2 mg/ml )： 100 X RNA酶A母液 (10 mg/ml )： 1X PBS =25: 10： 1000。(6) 細(xì)胞染色：根據(jù)細(xì)胞量，加入一定體積的細(xì)胞染色液(11.5ml )重懸，使上機(jī)時(shí)細(xì)胞通過(guò)率為 200350 Cell/s 。(7) 用300目(孔徑4050 m)的篩網(wǎng)過(guò)濾于流式上機(jī)管中，上機(jī)檢測(cè)。(8) 樣品分析測(cè)定及打印。(四) 秋水仙素阻抑法(1) 將細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。(2) 加入秋水仙素，使

14、培養(yǎng)基最終濃度為0.250.5卩g/mL，作用67小時(shí)。(3) 收集細(xì)胞，800rpm離心510分鐘，棄去上清，沉于管底的細(xì)胞即為M期細(xì)胞。(五) N2阻斷法(1) 將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。(2) 將培養(yǎng)瓶置于 N2罐中并通入適量 CO2(約相當(dāng)于罐中體積的 5%)。(3) 關(guān)閉N2罐，連接N2管子和壓力表，慢慢向罐中充入氮?dú)庵钡綁毫?090磅/英寸為止。 將N2裝置放在37C培養(yǎng)箱中1016小時(shí)。次日取出，然后緩緩放出N2(最好放出窗外)。(5) 取出細(xì)胞觀察同步化效果，并用振蕩法收集細(xì)胞于離心管中。(6) 800rpm 離心10分鐘，收集細(xì)胞。(六) G1期和G2期細(xì)胞的獲得1. G

15、2期細(xì)胞的獲得根據(jù)細(xì)胞周期測(cè)定的數(shù)值，使用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法使細(xì)胞同步化于G1/S期交界處后，使細(xì)胞釋放胸腺嘧啶核苷后繼續(xù)培養(yǎng)。其培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)大于S期時(shí)間并小于S期與G2期總和的時(shí)間。然后先用振蕩收集法使已進(jìn)入M期的細(xì)胞脫落瓶壁，棄去上清培養(yǎng)基；再用胰酶消化，加入新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，即為G2期細(xì)胞。2. G1期細(xì)胞的獲得(1)向用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法獲得的細(xì)胞中加入一定量的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)大于 S+G2+M期小于一個(gè)周期的時(shí)間即可獲得G1期細(xì)胞。向細(xì)胞中加入缺乏異亮氨酸的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)一個(gè)細(xì)胞周期，即可 獲得G1期細(xì)胞。Common methods for ma

16、mmalia n cell cycle syn chr oni zati on.MethodSynchrony in duci ng age nt or treatme ntmecha nism of actionCell cycle stage blockedChemical/pharmacol ogical in hibiti on of DNA replicati on/syn theLovastati nIn hibiti on ofHMG-CoAreductase (cholesterol s yn thesis) and the proteasomeEarly G1sis or m

17、itoticMimosi neIn hibiti onLate G1;spin dle formati onof thymidine, nu cleotide bios yn thesis, in hibiti on of Ctf4/chromat in bindingG1/SThymidi ne TdRExcess thymidinein duced feedback inhibition of DNA replicati onG1/SAphidicolinInhibition of DNA polymerase- a and DNA polymerase- 3G1/SHydroxyureaIn hibiti on of ribonu cleotide reductaseG1/SColchici ne ColcemideIn hibiti on of microtubule polymerizati onG2/MNocodazoleIn hibiti on ofG2/Mmicrotubule polymerizati onMitoge n or growth factor withdra