流式細(xì)胞儀操作規(guī)程-SOP

1、流式細(xì)胞儀操作規(guī)程目錄1：淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定及絕對(duì)計(jì)數(shù)2:活化淋巴細(xì)胞亞群、記憶T及純真T的檢測(cè)3： HLA-B27 測(cè)定4: CD55CD59 測(cè)定5:干細(xì)胞檢測(cè)和絕對(duì)計(jì)數(shù)6:白血病免疫分型測(cè)定7:淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子 IFN-丫 /IL-4測(cè)定8:細(xì)胞周期分析9:活化血小板檢測(cè)10:血小板抗體測(cè)定11:紅細(xì)胞抗體測(cè)定12:粒細(xì)胞抗體測(cè)定淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定（流式細(xì)胞儀）醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號(hào)：200年月日起實(shí)施第1版（共 3 頁(yè)）本規(guī)程每2年復(fù)審一次復(fù)審日期：年月日復(fù)審人：規(guī)程編寫(xiě)者： 審批者：批準(zhǔn)日期：年月日文件分發(fā)部門(mén)和/或個(gè)人院檔案室保管者：檢驗(yàn)科 主任：檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室：淋巴細(xì)胞亞

2、群測(cè)定方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫(kù)爾特）原理：雙/三色/四色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中， 與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式 細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count即可得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。淋巴細(xì)胞表面抗原分布如下：T淋巴細(xì)胞：CD3+ B淋巴細(xì)胞：CD3-, CDI9+輔助性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+抑制性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD8+ NK細(xì)胞：CD3-CDI6+56等。根據(jù)淋巴細(xì)胞膜上CD分子表達(dá)的不同，流式細(xì)胞 儀可以分辨出淋巴細(xì)胞及其各種不同的亞群， 利用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算出

3、淋巴細(xì)胞 亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count組會(huì)自動(dòng)得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求1 .樣本量1ml。2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。3.樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在之間。若X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X 109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。試劑品牌劑型 規(guī)格 貯存貝克曼庫(kù)爾特成分1:單克隆抗體液體28C(CD45/4/8/3CD45/56/19/3CD4/8/3同型對(duì)照 lgG1/lgG1/lgG1CD3/19CD3/16+56 CD19-PC5Flow-Cou nt熒光微球2：

4、全血溶血試劑（Q-Prep）液體A:甲酸液體70ML室溫B:碳酸鈉等液體32ML室溫C:多聚甲醛液體14ML室溫(Optilyse C 液體室溫3 :鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML28C (Flow-Check)儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對(duì)照2）分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C按說(shuō)明書(shū)步驟溶血）b.使用COULTER PREP制備系統(tǒng)開(kāi)機(jī)-顯示REA

5、DY丁亮-選擇35SEC丁亮-開(kāi)門(mén)-放入試管關(guān)門(mén)-自動(dòng)進(jìn)行溶 血-顯示READY丁亮-開(kāi)門(mén)-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5）上機(jī)測(cè)樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）6）需要做絕對(duì)計(jì)數(shù)的指標(biāo)，在相應(yīng)管中加入與血樣等量的 Flow-Count（務(wù)必做到 三同：同槍，同人，同種方法加 Flow-Count，而且加完即上機(jī)）報(bào)告結(jié)果報(bào)告百分?jǐn)?shù)（和絕對(duì)值）操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%參考值（百分?jǐn)?shù)（絕對(duì)值）CD3+CD4+CD8+NK （175-567）Th/Ts臨床意義、B淋巴細(xì)胞亞群是重要的免疫狀態(tài)檢測(cè)指標(biāo) ，在腫瘤、免疫缺陷、病毒感

6、染， 自身免疫性疾病、創(chuàng)傷、急性感染、多臟器功能衰竭、器官移植等具有臨床診 斷、病情判斷、治療等價(jià)值。臨床常用Th/Ts比值來(lái)判斷病人的免疫狀況。Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢進(jìn)：見(jiàn)于自身免疫性疾病，如SLE類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無(wú)力以及 HBsAg+乙肝等。Th/Ts比值減低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、腫瘤病人、慢活肝和 活動(dòng)性肝硬化、再生障礙性貧血、粒細(xì)胞減少患者。2： NK細(xì)胞主要破壞各種腫瘤細(xì)胞和感染某些病毒、細(xì)菌的細(xì)胞，所以在抗腫瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性減低主要見(jiàn)于各種惡性腫瘤、自身免疫性疾病、 病毒感染、應(yīng)用免疫抑制劑，疲勞綜合征病人

7、等，NK活性隨年齡增長(zhǎng)而減退。NK細(xì)胞也參與第二型超敏反應(yīng)和移植物抗宿反應(yīng)，白介素-2治療后；外周血NK細(xì)胞增加。(一8040d)«攸QQ&曲MWjWd HAftU五 L 嚴(yán) CW<iM戈“匚1 JHhl k«4pr I匸研尸£ O | " |T|聒|瓦叢盡亦卅工魚(yú)図|41 k 1 x |Lil>屮*!和9 II 伽 r皿4 Qlgj |I DwpmMhgn |Ai'ilirt-iT totfa 0 ch hlCkKlRTdAIDSpreOFFPEerrForr嚀CFFmLkIMm Brai rite(luxeomihp! m

8、sirjAcMQh fate*Lkb Ejp|Uhh*_I r廠 CLigiwP'9 b：«b-FQh«nDbU£=-ldprrkkrrtUhIxq P*.RLE7rE17廠fll|pTCrIPHJrpruIttD廠R廠Pl£F(fl2 21 彈 fr rWv0M50mIiPi：5L rri*nF$UiSS LnFITCLcaHw*5UrtmdrHi Eabinmia jftr SelypljEi r EidkEDUPi："S«!*>irK<fe U*T fiflflt |uw» 呂g 3w | ibc!

9、e I lEk'#" |rat3 p II |H<c- MlTis fuiiHcfrfvyjE fvlmctv 皿* 慮肝'Izj 宀-g氣#r缶憐旳耳口FS RI Hi"佔(zhàn) zS:R： PE：- ：wjx.3d * S OS-WkKldMBe* 3匚屯習(xí) RjphTitbfi*®LkiT 亙i*.DcAomhaKPWBR 勻 P時(shí)xcolidIQtrttKtMl： 119KDLeTn*«wq n |HMfXJSlJdj4.k-J'ati hlfaFILh 旳LnF1I3PE (Lag TOLcfiPR EmT £

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11、對(duì)計(jì)數(shù)，則N Q Q曲5 C.*| 口戸1 JI盟匚r n10 - 直弐I；t r 1律叱1 11 ft- II *J h酉<5 * | 丫f"3皀-rliri LJ minHr-心FRO 16斤門(mén) ZokirPSxhP Zvrno 3 a=iarr5-3B-=hP-n- “ n4aiF5dSU”：M«rFai* 祁 aMPaPLtcnri wcrarizcFti * 心 MCF2rVBrfK.Fi A£X F MEM 苗tttn WFXEJHLl.fi atcfnpu. 擴(kuò)卄AQ II :上山則Holl甲GiJbaa:.叩叫填寫(xiě)Flow-Count的濃宦耳

12、ma)。>理活化淋巴細(xì)胞亞群、記憶T及純真T的測(cè)定方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫(kù)爾特）原理：雙/三色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白 細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞 儀上進(jìn)行分析，從而得到相應(yīng)各亞群的百分?jǐn)?shù)?；罨馨图?xì)胞表面抗原為CD3+/CD25和 CD3+/HLA-DR+CD3+/CD45RO是記憶型 T細(xì)胞。CD3+/CD45RA+ 是純真型T細(xì)胞。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求1 .樣本量1ml。2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)

13、內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。 3.樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在之間。若X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X 109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。試劑品牌貝克曼庫(kù)爾特劑型規(guī)格貯存成分1:單克隆抗體液體28C(CD3/HLA-DRCD25-PC5CD3-FITCCD45RA-PECD45RO-PECD4-PC5 )2：全血溶血試劑（Q-Prep）液體A:甲酸液體70ML室溫B:碳酸鈉等液體32ML室溫C:多聚甲醛液體14ML室溫(Optilyse C液體室溫3:鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML28C (Flow-Check)儀器Beckma nCoulter EPIC

14、S XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對(duì)照2）分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C按說(shuō)明書(shū)步驟溶血）b.使用COULTER PREP制備系統(tǒng)開(kāi)機(jī)-顯示READY丁亮-選擇35SEC丁亮-開(kāi)門(mén)-放入試管關(guān)門(mén)-自動(dòng)進(jìn)行溶 血-顯示READY丁亮-開(kāi)門(mén)-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5）上機(jī)測(cè)樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）報(bào)告結(jié)果報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%參考值(百分?jǐn)?shù)

15、)CD3+/HLA-DR+ ± %CD3+/CD25+ ± %CD3+/CD45RO+ ± % CD3+/CD45RA+/CD4+ ± %臨床意義、CD25 CD69是T細(xì)胞活化各個(gè)時(shí)期表達(dá)的標(biāo)志性抗原，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)可以 判斷出疾病的進(jìn)程，有助于臨床疾病的輔助診斷、預(yù)后和治療。如活化狀態(tài)的 監(jiān)測(cè)是對(duì)機(jī)體移植免疫狀況判斷的最主要依據(jù)，有助于臨床選擇治療方案， CD25+/CD3+ >5-10提示排斥、持續(xù)增加提示應(yīng)作病理活檢；CD3+/HLA-DR增 加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2. 正常機(jī)體內(nèi)各種T細(xì)胞之間以及與其他免疫細(xì)胞之間在

16、數(shù)量上保持一定比 例，如果它們之間比例失調(diào)就會(huì)引起免疫功能紊亂，將導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、腫瘤等疾病的發(fā)生，檢測(cè)淋巴細(xì)胞各種亞群有助于 疾病的診斷、預(yù)后和治療。CD45RA CD45RO均為T(mén)細(xì)胞的輔助分子，CD45RA+， 純真型T細(xì)胞當(dāng)免疫力下降時(shí)減少；CD45RO記憶型T細(xì)胞對(duì)第二次抗原刺激 極其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感染疾病中減少。方案（Protocol）同淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（Resul）HLA -B27 測(cè)定方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫(kù)爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。將 HLA-B27-FITC/ HLA-B7-P單克隆

17、抗體加入到全血中, 與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗體結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式 細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，測(cè)定HLA-B7陰性而HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和 所占的百分比。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求1 .樣本量1ml。2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。3. 樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在之間。若X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若vX109/l，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。4. 溶血樣本不能用。試劑品牌劑型規(guī)格貯存貝克曼庫(kù)爾特1:單克隆抗體液體1ML28C(HLA-B27/HLA-B7同型對(duì)照l(shuí)gG1/l

18、gG2a )2:全血溶血試劑液體A:甲酸液體70ML室溫B:碳酸鈉等液體32ML室溫C:多聚甲醛液體14ML室溫3:鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML2-8 C成分質(zhì)控品 BEKAMANCOULTE產(chǎn)品，未開(kāi)瓶的試劑于2-8C保存，可在有效期內(nèi) 保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8°C可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí) 進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入 20 ul單克隆抗體和同型對(duì)照（IgG2a-FITC7 lgG1-PE）2）分別向試管中加入混勻的10

19、0u1抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C按說(shuō)明書(shū)步驟溶血）b.使用COULTER PREP制備系統(tǒng)開(kāi)機(jī)-顯示READY丁亮-選擇35SEC丁亮-開(kāi)門(mén)-放入試管關(guān)門(mén)-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY丁亮-開(kāi)門(mén)-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5）洗、離心、上機(jī)測(cè)樣（備注：測(cè)B27 一定要至少洗一遍方可上機(jī)檢測(cè)）報(bào)告結(jié)果報(bào)告陰陽(yáng)性操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%參考值陽(yáng)性：HLA-B27陽(yáng)性而HLA-B7陰性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度在以上，陽(yáng)性 率 >90%。臨床意義HLA復(fù)合體位于第6號(hào)染色體的短

20、臂上，該區(qū) DNA片段長(zhǎng)度約3000-4000KB 占人體整個(gè)基因的1/3000，HLA-B27是 HLA-I類基因中B位點(diǎn)上的一個(gè)等位基 因，與多種疾病具有相關(guān)性，尤其是強(qiáng)直性脊柱炎。HLA-B27基因?qū)儆冢啃蚆HC基因，所有有核細(xì)胞上均有表達(dá)，尤其是淋巴細(xì)胞表面含量豐富，人們 發(fā)現(xiàn)HLA-B27抗原表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎有高度的相關(guān)性， 超過(guò)90%的強(qiáng)直性脊 柱炎患者HLA-B27抗原表達(dá)陽(yáng)性，而正常人群中僅 5-10%的認(rèn)為陽(yáng)性。由于強(qiáng) 直性脊柱炎癥狀與許多疾病相類似，臨床上難以確診，因此HLA-B27檢測(cè)在疾病的診斷中具有重要意義，HLA-B27的檢測(cè)是該疾病診斷和鑒別診斷中的一個(gè) 重要指

21、標(biāo)。方案（Protocol）1選參數(shù)dIK； ffciomn sn； ffciomn sn：Pbn 比日護(hù)- ah聲 ucmiH兩耳ij«s=* = |BllniHd|1君EiJ£ 3g點(diǎn)擊-ZyrBlS-山4«：啊 鳴 dClUR” r nirlId t v H ll-Zlb轉(zhuǎn)< *! gKBLRijJ tl4r f's-jlr ?J< t'2 uirFfici h如磚弓護(hù)曲P"占林百丄直“XF世占時(shí)甘 m 怙 ruiHk rt£ F jt FU IftKCF.3c,*erfvn'i 氐F p聯(lián)E <

22、C F NEM Hi 円 «FTbfCf m.t: UM81 0 gw33* dvS9U 匕.已L.LU厶日嶺Jfab ET2Q n? n5SX* 二 簽 d 丄 L &CLo:t(2:5 =S 5 V-5-JLhxp£z,s:B-h*t0*w-F =艮-H一Lb" >-!心&Fl*n:刁vu idijAKe ED1CV-tr 一 / dsoo* §Qi L£25$e61w4一 -a5-st3 - sMpa-2"爰 tl=KJ1JC9S41XFuu»j2'可”V*1(Aral?Hd±?

23、_=:寫(xiě)五已E-二Ld&JL斗；.JJ L-E *<J-Bhr£_f-r-lms- 口孑審丄F二5Frfgr1L SI-ss5#a 一讀 FEZi 參衣 S.lt.亠 iiALLlL_-s-s-MHg -f vd FF71-0 一£t 0 _3-i si-±-so 臥Hr忠.訊¥ppo Itw>:.*£-& 電撫州Ft:5*n3M i£ FkFU 勺 Tuclpt- 凹衣F k亡宗Gdn©懇alLM堺-np5 IM*®>H豐加InraSave2畫(huà)H%U3-結(jié)果1. positive

24、 (+)2. n egative(-)I利 KA】 WIJMU FL I LgJFU LGlaJI aiftFt?0.5tt%二 2!-! l_ ,1:t' 1? h'r. I I I 'illC |I I 伸<D!勺1/B2TX-Mea n=X-Mea n=X-Mea n=CD55/CD59 測(cè)定方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫(kù)爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。近年的研究表明，紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上CD55和CD59分子的表達(dá)量和缺乏表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量對(duì) PNH診斷和鑒別有重要意義。血細(xì)胞 （紅細(xì)胞和白細(xì)胞）通過(guò)膜上的抗原分子與熒光素標(biāo)記的 CD55

25、或 CD59的多克隆 抗體結(jié)合。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD55或CD59表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1 .樣本量1ml。2 樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用3. 溶血樣本不能用。試劑品牌劑型規(guī)格貯存貝克曼庫(kù)爾特1:單克隆抗體液體1ML28C(CD59-FITC CD55-PE2:全血溶血試劑液體A:甲酸液體70ML室溫B:碳酸鈉等液體32ML室溫C:多聚甲醛液體14ML室溫3:鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML2-8 C成分質(zhì)控品 BEKAMANCOULTE產(chǎn)

26、品，未開(kāi)瓶的試劑于2-8C保存，可在有效期內(nèi) 保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8°C可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí) 進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：（一）白細(xì)胞CD55/CD59檢測(cè)1 準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記。分別向二管中加入樣品100ul。2. 溶血：a. OptiLyse C按說(shuō)明書(shū)步驟溶血）b.使用COULTER PREP制備系統(tǒng)開(kāi)機(jī)-顯示READY丁亮-選擇35SEC丁亮-開(kāi)門(mén)-放入試管關(guān)門(mén)-自動(dòng)進(jìn)行溶 血-顯示READY丁亮-開(kāi)門(mén)-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿

27、并能打出液體）3. 離心后分別加入CD55/CD59 10u和相應(yīng)的同型對(duì)照10ul。避光20-30分鐘。4. 洗滌離心5. 上機(jī)測(cè)樣匚）紅細(xì)胞CD55/CD59檢測(cè)1. 準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記2. 分別加入 CD55/CD59 10ul和相應(yīng)的同型對(duì)照10ul。3. 向二管中加入1: 200稀釋的樣品100ul （可根據(jù)紅細(xì)胞的數(shù)量調(diào)整），避 光20-30分鐘。4. 洗滌離心。5. 混勻、上機(jī)測(cè)樣。報(bào)告結(jié)果報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%參考值CD55>97%CD59>97%PNH的臨界值：RBC CD59>95%WBC CD59>90

28、%PNH的診斷值：RBC CD59>91%大部分>80%中性粒細(xì)胞CD59>84%臨床意義用于AA和PNH的診斷和分型診斷。PNH時(shí)CD55和CD59明顯減低和缺如方案(Protocol )(同 HLA-B27)4#刪 if UfFlllnEl隨 FLI 3Id1CM-FTC>|FU L他pq|FL"1叫j*1M結(jié)果:no rmallMOiRKH LEI Lin:abnormalIe血IS1I ip4Qart T干細(xì)胞檢測(cè)和絕對(duì)計(jì)數(shù)方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫(kù)爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與干

29、細(xì)胞 膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上 進(jìn)行分析，從而得到百分?jǐn)?shù)，加入 Flow-Cou nt即可得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求1 .樣本量1ml。2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。 3.樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在之間。若X1O9/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X 109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。試劑品牌貝克曼庫(kù)爾特劑型規(guī)格貯存成分1:單克隆抗體液體28C(CD34NO. IM1871CD45-PC5M2652Flow-Cou nt熒光微球2：全血溶血試劑（

30、Q-Prep）液體A:甲酸液體70ML室溫B:碳酸鈉等液體32ML室溫C:多聚甲醛液體14ML室溫(Optilyse C 液體室溫3 :鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML28C (Flow-Check)儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入10 ul單克隆抗體和同型對(duì)照2）分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C按說(shuō)明書(shū)步驟溶血）b.使用COULTER PREP制備系統(tǒng)開(kāi)機(jī)-顯示READY丁亮-選擇35S

31、EC丁亮-開(kāi)門(mén)-放入試管關(guān)門(mén)-自動(dòng)進(jìn)行溶 血-顯示READY丁亮-開(kāi)門(mén)-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5）需要做絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)，在相應(yīng)管中加入與血樣等量的Flow-Cou nt（務(wù)必做到三同：同槍，同人，同種方法加 Flow-Count，而且加完即上機(jī)）6）上機(jī)測(cè)樣報(bào)告結(jié)果報(bào)告百分?jǐn)?shù)（和絕對(duì)值）操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%參考值（百分?jǐn)?shù)（絕對(duì)值）CD34+/CD45+ ± %臨床意義目前把CD34作為造血干細(xì)胞的主要標(biāo)志，CD34陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)作為造血干細(xì)胞 水平定量的檢測(cè)方法。方案（Protocol）同淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（R

32、esul）If hlH LIE" in白血病免疫分型測(cè)定方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫(kù)爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與細(xì)胞膜 上或膜內(nèi)相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞 儀上進(jìn)行分析，從而得到百分?jǐn)?shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位骨髓采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝要求1 .樣本量1ml。2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。3. 樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在之間。若X1O9/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X 109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。試劑品牌貝克

33、曼庫(kù)爾特劑型規(guī)格貯存成分1:單克隆抗體液體28C(CD34NO. IM1871CD45-PC5M2652Flow-Cou nt熒光微球2：全血溶血試劑（Q-Prep）液體A:甲酸液體70ML室溫B:碳酸鈉等液體32ML室溫C:多聚甲醛液體14ML室溫(Optilyse C 液體室溫3 :鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML28C (Flow-Check)儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作-樣本制備：細(xì)胞膜表面抗原1 首先準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體。2 首先每管中加入5ul CD45-PC5抗體。3 然后，按

34、管上的標(biāo)記，加入相應(yīng)抗體各 10ul（注意：必須是FITC和PE標(biāo)記 的抗體搭配）4. 各管中加入標(biāo)本（骨髓或外周血）30100u1（根據(jù)細(xì)胞的多少?zèng)Q定），振蕩混 勻，室溫避光2030分鐘。5. 溶血：a. OptiLyse C按說(shuō)明書(shū)步驟溶血）b.使用COULTER PREP制備系統(tǒng)開(kāi)機(jī)-顯示READY丁亮-選擇35SEC丁亮-開(kāi)門(mén)-放入試管關(guān)門(mén)-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY丁亮-開(kāi)門(mén)-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）細(xì)胞漿和核抗原I. 準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體，其中一管是同型對(duì)照。2 .首先每管中加入標(biāo)本（骨髓或外周血）100u

35、l（根據(jù)細(xì)胞的多少?zèng)Q定）， 5ulCD45-PC5抗體。室溫避光20分鐘。3. 每管中加入固定液100ul，劇烈振蕩混勻，室溫避光15分鐘。4. 各管中加入PBS4m。5. 300g離心5分鐘后，棄去上清液，振蕩混勻。（1500r/min*5min）6. 各管中加入透膜劑100ul，輕輕混勻，室溫避光5分鐘。7 .加抗體，陰性對(duì)照管中加入10ul，其余各管加入相應(yīng)抗體各10ul，室溫避 光15分鐘。8. 各管中加入4mlPBS振蕩混勻。9. 300g離心5分鐘后，棄去上清液。10. 各管中加入PBS500u（振蕩混勻。II. 上機(jī)測(cè)樣報(bào)告結(jié)果報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%

36、參考值CD34+5%MPO+V5%粒系20% 淋系30%臨床意義用于血液病的診斷和分型診斷方案（Protocol）方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫(kù)爾特）原理：直接免疫熒光法。肝素鈉抗凝全血在 PMA，Ionomycin和Monensin存在下短 期培養(yǎng)（輔助性T細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子IFN-丫、IL-4的產(chǎn)生分為T(mén)hl、Th2兩個(gè)亞 群。淋巴細(xì)胞活化以后才分泌細(xì)胞因子，且迅速分泌到細(xì)胞外。因此，利用刺 激劑PMA+Ionomycin體外激活淋巴細(xì)胞，然后用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑 Monensin阻 止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，使細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)滯留到一定的量），然后進(jìn)行細(xì)胞膜表面抗原和細(xì)胞

37、內(nèi)細(xì)胞因子染色，使用流式細(xì)胞儀對(duì)CD4+H胞內(nèi)的IFN- 丫和IL-4進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑肝素抗凝血要求1 .樣本量至少1ml。2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。3. 樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在之間。若X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X109/l，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。4. 溶血樣本不能用。試劑淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系伯配）成分：刺激素PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 選白美國(guó)SIGMA公司。單克隆抗體（BeckmanCoulter公司）CD4-PC5 IL-4-PE IFN-丫 -FITC質(zhì)控品 BE

38、KAMANCOULTE產(chǎn)品，未開(kāi)瓶的試劑于2-8C保存，可在有效期內(nèi) 保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8°C可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí) 進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作：細(xì)胞培養(yǎng)與染色取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5單抗，室溫避光孵育30分鐘，RPMII640 洗滌一次，將細(xì)胞加入培養(yǎng)體系中，5% CCb 37C孵育18小時(shí)，取出后以PBS 洗一次。用專用細(xì)胞內(nèi)因子試劑進(jìn)行細(xì)胞固定、透膜。將細(xì)胞分成兩管，其一 為測(cè)定管加入lOul抗人IL-4-PE和 IFN-丫 -FITC另一管加入同型對(duì)照，室溫避 光2

39、0分鐘，PBS洗滌一次，待測(cè)。流式細(xì)胞儀測(cè)定打開(kāi)流式細(xì)胞儀及氬激光光源（488nm）預(yù)熱20min，同時(shí)儀器自動(dòng)初始化； 用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正光路和流路，然后依次檢測(cè)標(biāo)本，每份標(biāo)本檢測(cè) 50000 以上細(xì)胞，在前向散射光（FS和測(cè)向散射光（SSC散點(diǎn)圖中圈定淋巴細(xì)胞群，然 后分析CD4陽(yáng)性細(xì)胞中IL-4-PE和 IFN-丫 -FITC的表達(dá)。淋巴細(xì)胞在FS/SSC散點(diǎn)圖中位置，即A門(mén)內(nèi)細(xì)胞； A門(mén)內(nèi)CD4陽(yáng)性細(xì)胞，即B門(mén)內(nèi)細(xì)胞； B門(mén)內(nèi)TH細(xì)胞亞群分布：1區(qū)數(shù)值-Th 1細(xì)胞 （）4區(qū)數(shù)值-Th 2細(xì)胞 （）2區(qū)數(shù)值-Th 0細(xì)胞 （）報(bào)告結(jié)果報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2

40、%正常參考值ThlQFN-丫 ）:± %Th2（IL-4）: ± %ThO丄土 %臨床意義淋巴細(xì)胞均分泌多種細(xì)胞因子：Thl細(xì)胞主要分泌IL-2, IL-12, IFN-y和TNF-b /a等，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4. IL-5. IL-6, IFN-丫為T(mén)hl最特異分泌的細(xì)胞因 子, IL-4為T(mén)h2最特異分泌的細(xì)胞因子，所以可根據(jù)分泌的細(xì)胞因子來(lái)區(qū)分 Thl 與Th2。Thl為IFN-丫十Th2為IL-4+。靜息狀態(tài)（人的正常生理狀態(tài)、即未受到 任何刺激下Th0分化為T(mén)hl和Th2的能力非常弱，在外周血中僅含有極少量的 Thl和Th2細(xì)胞，這時(shí)我們所能檢測(cè)的胞內(nèi)的I

41、FN-丫和IL-4也微乎其微。當(dāng)Th細(xì)胞受到外界因素，如刺激素、病原體等刺激，其中ThO即會(huì)向Thl或Th2大量分化，此時(shí)我們檢測(cè)到的IFN-y和IL-4也較多。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)實(shí)際上是檢測(cè) Th細(xì)胞對(duì)刺激素刺激的反應(yīng)能力。方案（Protocol）|Ugi因 1> U"l Llf!55 UH聞LUMCD fl-PCSAOmFLl- LoeJFLI gs-IM細(xì)胞周期分析方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫(kù)爾特）原理：利用特殊的熒光染料（P、EB AO等）與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被熒光染料染 色的細(xì)胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與 DNA含量成正比。流式細(xì)胞 儀

42、通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度推算出細(xì)胞的 DNA含量標(biāo)本采集與處理檢測(cè)對(duì)象實(shí)體（腫瘤）組織、灌洗液、石蠟塊、培養(yǎng)細(xì)胞要求 1 實(shí)體（腫瘤）組織、灌洗液和培養(yǎng)細(xì)胞如果不能立即做應(yīng)用 冷乙醇固定，20C可保存2 3個(gè)月，70C可保存半年以上。2.樣本計(jì)數(shù)應(yīng)在x 106/ml貯存28 C試劑()(包括 DNA-Prep LPR和DNA-Prep 染料)2：鞘液液體20L室溫3：清洗液液體5L室溫4：熒光微球液體10ML28C (Flow-Check)品牌劑型 規(guī)格貝克曼庫(kù)爾特成分 1: DNA-Prep試劑系統(tǒng)液體儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：灌洗液

43、或培養(yǎng)細(xì)胞PBS洗,稀釋為x 106/ml,取 100ul,加入 DNA-Prep LPR 1秒后加入 DNA-Prep 染料1ml,室溫避光15分鐘。過(guò)300目濾網(wǎng)，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)體（腫瘤）組織單細(xì)胞懸液制備：將固定或新鮮的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗， 直至將組織搓完為止。（如果是淋巴瘤只需用生理鹽水沖即可）。將平皿中的 混懸液用300目銅網(wǎng)過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液，以 500- 800轉(zhuǎn)離心 沉淀2分鐘。染色：同上 上機(jī)檢測(cè) 石蠟塊 脫蠟水化：石蠟塊切成50um厚，3-5片，放入二甲苯中室溫放置24小時(shí)，

44、更換二甲苯室溫再置24小時(shí)。取出加無(wú)水乙醇10分鐘，依次加95%乙醇、 70%乙醇、50%乙醇及雙蒸水各10分鐘。單細(xì)胞懸液制備及染色：同上上機(jī)檢測(cè)報(bào)告結(jié)果報(bào)告各期的百分?jǐn)?shù)操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%參考值臨床意義DNA倍體分析用于腫瘤早期診斷、良惡性腫瘤判斷、腫瘤預(yù)后、治療方案的選 擇，正常組織和良性腫瘤DNA均為二倍體，惡性腫瘤時(shí)則出現(xiàn)異倍體。nrrarr41W;樸辻亦W1<D3 1 ES 上I扣 *jMWN5出|FLU |J -1 S3d占_rusJlmLUJ B 空j a田事陽(yáng) Ml mT|iMriniXW*|鷗申呵g |豳ESQ |加號(hào) 5細(xì)*和”阿rjLELL

45、liMl 3=1護(hù)j屮心斫j(luò)INCDT J jf»R*T畔 j |Z許皿n護(hù)住 加lt|二：|彗E號(hào)翟1巨_阿1 k *H u '.丄 “-；"_| | ， IS I JH j.1: | *1 F * J -71 J t：* | krtg砒斗 J rtlW!5專F巴日尊IfFIHHJ蘭_nJru_| -1_ZzlzidLlid0時(shí)55J fl鈕rd S?T »iMN.FLE叫H叫a7Sg爭(zhēng)冊(cè)Q申Z J 如 5 J3 J LEUn injpti 口 M 4 IPI Qij u.百a|_| Hapuy, M|awsfl'j|* 楓嚀 存七 coj, p

46、 mu >nm =-氣t包E1P ii 4 j h >i-i IE ; 1 .dl" ti * r - w：-；：wQB sr;"呂HjSjaiuejed 爭(zhēng)目ouoo JOgiuoMo 算聯(lián)嫌誓聯(lián)L(|OOOlOJd)尊RNErH二底ER-qn.ko.pt B EEftK-? E-Fr-IT片 n*-yls Qm-匕miikrTHIrbilhEH B口亍 sf42±ih»-Jsri 肚 fjpcjwifpikbg 甬-L-w塔審Kz>l盤(pán)'<I-T聲Lp 機(jī)LiK <£*T"N)1函LLrpr*tLlnwfKtsso-3rl?K i-B-Q替 CUTEST 烷蟲(chóng)a口InertPJ- Tnwi 7115呂UL片 LdMf bFF s5 ？ 克FBIUJfRanb叵.殺:?.辛i-3a叵 4匾亠書(shū)軍申壬-=vcl&屛舄P 一 if 叫 F 才|=1-Fmr? Canp q .LLALr.F 護(hù) FUI* | H L'.l*F V F U 也 I：WE £7-ylAInf r 工Ileses If LlFt- tn(A)f L3 UrvUHFlil LI4結(jié)果（Resul）血小板膜表面抗體測(cè)定方法流式細(xì)胞儀（Bec