現(xiàn)代分析技術(shù)在霍山石斛研究中的應(yīng)用

1、    現(xiàn)代分析技術(shù)在霍山石斛研究中的應(yīng)用    摘 要：該文綜述了現(xiàn)代色譜技術(shù)、光譜技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)等分析技術(shù)在珍稀藥用植物-霍山石斛的化學(xué)成分、組效研究、物種鑒定和親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用及其最新研究成果。關(guān)鍵詞：霍山石斛；現(xiàn)代分析技術(shù)；應(yīng)用s567 a 1007-7731（2014）12-17-05霍山石斛（dendrobium huoshanense c.z.tang et s.j.cheng），史稱(chēng)霍石斛、又稱(chēng)米心石斛（米斛）屬未進(jìn)化的蘭科石斛屬植物。其含有多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)、菲類(lèi)、氨基酸、倍半萜類(lèi)等1-2，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)血糖濃度

2、、抑制腫瘤、明目、提高人體抗氧化水平、抑制血小板凝集、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老和退熱止痛等藥理作用3。為大別山區(qū)特有種，是安徽省霍山縣出產(chǎn)的道地藥材，是唯一以地名命名的石斛屬物種，2007年被國(guó)家質(zhì)檢總局定為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品?；羯绞涊d最早見(jiàn)于清代趙學(xué)敏本草綱目拾遺，距今有130a（張應(yīng)昌編繕初刊）至250a以上（趙學(xué)敏完成初稿）歷史。因現(xiàn)有市場(chǎng)存量過(guò)少，不能作為大宗藥材購(gòu)買(mǎi)，因此在1995版、2000版、2005版、2010版的中華人民共和國(guó)藥典的修訂中均沒(méi)有出現(xiàn)?；羯绞仓臧?，種子細(xì)小無(wú)胚乳，在自然狀態(tài)下發(fā)芽率極低，自然分布區(qū)域狹窄，僅限于大別山區(qū)的安徽霍山、金寨、岳西，湖北英

3、山，河南南召等大別山脈系地區(qū)，是石斛屬唯一分布于長(zhǎng)江以北的種4-6。在我國(guó)蘭科石斛屬12個(gè)極危級(jí)物種中就有霍山石斛6。1987年，國(guó)務(wù)院將其列為野生藥材二級(jí)保護(hù)品種。近幾十年，霍山石斛市場(chǎng)價(jià)格不斷攀升，貴比黃金。為保護(hù)珍稀瀕危藥用植物霍山石斛的種質(zhì)資源，推進(jìn)中藥霍山石斛資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用，霍山石斛的規(guī)?；庇夹g(shù)、仿野生栽培技術(shù)正在得到不斷發(fā)展7-9，有關(guān)霍山石斛的化學(xué)成分提取、分離鑒定和藥理藥效的研究也在深入開(kāi)展10-12。中藥現(xiàn)代化建設(shè)的核心是標(biāo)準(zhǔn)化的建立，標(biāo)準(zhǔn)化包括種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化，其中種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化是前提，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化保障，本文將從種質(zhì)資源和質(zhì)量控制兩個(gè)角度，就現(xiàn)代色

4、譜技術(shù)、光譜技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)等分析技術(shù)在藥用植物-霍山石斛的物種鑒定、親緣關(guān)系、化學(xué)成分和組效關(guān)系研究中的應(yīng)用綜述如下：1 現(xiàn)代分析技術(shù)在霍山石斛的物種鑒定，親緣關(guān)系和遺傳穩(wěn)定性中的應(yīng)用隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，dna分子標(biāo)記技術(shù)已發(fā)展了3個(gè)階段，分別是基于酶切技術(shù)的酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)，基于pcr技術(shù)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)，和基于核苷酸測(cè)序技術(shù)的單核苷酸差異的分子標(biāo)記技術(shù)，這些技術(shù)廣泛地應(yīng)用在物種的鑒定上。由此衍生的分子標(biāo)記類(lèi)型多樣，功能各異，目前應(yīng)用到霍山石斛種質(zhì)資源研究的分子標(biāo)記技術(shù)有rdna its，issr，ssr，rapd，dalp等分子標(biāo)記技術(shù)13，

5、14。代表成果如下：1.1 霍山石斛鑒別 如何有效的區(qū)分霍山石斛及其近緣種，是規(guī)范霍山石斛市場(chǎng)的必須要解決的問(wèn)題。分子標(biāo)記技術(shù)能在分子層面，在植株發(fā)育的各個(gè)階段，實(shí)施有效的檢測(cè)。鄧輝等15對(duì)霍山石斛及其同屬相似種進(jìn)行issr分子標(biāo)記比較研究，結(jié)果表明，霍山石斛及其相似種在issr分子標(biāo)記指紋圖譜上存在著顯著而穩(wěn)定的差異。根據(jù)issr分子標(biāo)記指紋圖譜所顯示的多態(tài)性位點(diǎn)差異，能準(zhǔn)確鑒別霍山石斛及其相似種和霍山石斛與其它石斛的雜交種。其方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，在霍山石斛的分子鑒定研究中有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。劉石泉等16利用石斛屬植物基因庫(kù)中rdnaits序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較，在與霍山石斛差異較大的

6、區(qū)段設(shè)計(jì)出霍山石斛的1對(duì)位點(diǎn)特異性鑒別引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在退火溫度為60時(shí)，該引物能把霍山石斛的模板從19份石斛屬植物中擴(kuò)增出來(lái)，而其他的石斛屬植物均為陰性，證明是一種能對(duì)霍山石斛的真?zhèn)芜M(jìn)行準(zhǔn)確鑒別的有效方法。1.2 霍山石斛分類(lèi) 霍山石斛分類(lèi)學(xué)地位的認(rèn)定一直存在爭(zhēng)議，不同的分子標(biāo)記技術(shù)可以從不同的角度對(duì)霍山石斛和其他種屬的遺傳關(guān)系進(jìn)行更加合理的判定。丁小余等17探討霍山石斛與同屬近似種：細(xì)莖石斛、曲莖石斛、鐵皮石斛藥材鑒別的形態(tài)及dna分子證據(jù)，對(duì)霍山石斛及其近似種的藥材進(jìn)行了外部形態(tài)和rdna its序列比較。結(jié)果霍山石斛及其近似種在rdna its序列上卻存在著顯著而穩(wěn)定的差異?；羯绞c細(xì)

7、莖石斛的rdna its序列差異最小絕對(duì)遺傳距離為15，而與曲莖石斛的差異較大，絕對(duì)遺傳距離為42。金國(guó)虔等18利用ap-pcr方法對(duì)4種霍山來(lái)源的石斛屬植物基因組dna進(jìn)行了多態(tài)性分析，從75種隨機(jī)引物中篩選出10種擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的隨機(jī)引物，通過(guò)pcr擴(kuò)增共獲得250條dna片段；利用nt-syspc分析軟件對(duì)不同石斛品種間的平均遺傳距離進(jìn)行了分析，并利用upgma聚類(lèi)分析方法構(gòu)建它們的親緣關(guān)系聚類(lèi)圖，結(jié)果表明4種霍山來(lái)源的石斛品種具有較近的親緣關(guān)系，它們之間的平均遺傳相似系數(shù)為0.63，其中鐵皮石斛和銅皮石斛的親緣關(guān)系最近，兩者間的遺傳相似系數(shù)為0.78，它們與串珠石斛的遺傳相似系數(shù)分

8、別為0.6和0.61，與霍山石斛的遺傳相似系數(shù)分別為0.63和0.58；但是，相對(duì)于形態(tài)接近的銅皮石斛，鐵皮石斛與霍山石斛的親緣關(guān)系更近，這為霍山石斛物種的分類(lèi)定位和道地性成因提供了參考依據(jù)1.3 霍山石斛遺傳穩(wěn)定性大規(guī)模的組培快繁技術(shù)是拯救和利用霍山石斛資源的有效途徑，但不同材料間的遺傳變異程度如何，同一材料間的遺傳穩(wěn)定性差異如何，是組培工作必須首先考慮的問(wèn)題。邱婧等19分別以霍山石斛成熟種子、莖段和愈傷組織為試管苗的初始材料進(jìn)行繼代培養(yǎng)，利用rapd、issr以及dalp 3種分子標(biāo)記方法對(duì)不同繼代次數(shù)（14代）的霍山石斛試管苗進(jìn)行分析，結(jié)果表明：以成熟種子和莖段為材料的繼代培養(yǎng)，其試管苗

9、后代在所檢測(cè)的范圍內(nèi)未探查到變異，具有較高的遺傳穩(wěn)定性.以愈傷組織為材料的繼代培養(yǎng)，其試管苗后代從第4代開(kāi)始，部分引物帶型的強(qiáng)弱發(fā)生改變。表明以愈傷組織為出發(fā)材料的繼代培養(yǎng)種內(nèi)存在一定的變異，但在4代以?xún)?nèi)仍可穩(wěn)定遺傳。3種繼代方式比較之下，以成熟種子和莖段為材料的繼代培養(yǎng)是更能穩(wěn)定遺傳的組培快繁方式。劉石泉20等研究霍山石斛同一蒴果組培不同生長(zhǎng)階段遺傳穩(wěn)定性方法：利用從20個(gè)隨機(jī)引物篩選的3個(gè)穩(wěn)定性較好的10堿基引物對(duì)已繼代78次的h23種群進(jìn)行rapd檢測(cè)結(jié)果：發(fā)現(xiàn)不同階段內(nèi)遺傳相似系數(shù)較大，在85.409 3%98.360 6%，其中在原球莖、萌芽期和一葉期存在的變異比兩葉期、開(kāi)花期要顯著

10、，但程度都極其微弱.結(jié)論：來(lái)自同一蒴果的變異非常小，建立霍山石斛穩(wěn)定的無(wú)性快繁系是切實(shí)可行的。這為利用組培技術(shù)快繁霍山石斛的遺傳穩(wěn)定性提供了重要理論依據(jù)。 2 現(xiàn)代分析技術(shù)在霍山石斛的化學(xué)成分和組效關(guān)系中的應(yīng)用現(xiàn)代色譜技術(shù)色譜分離技術(shù)主要包括氣相色譜分離模式、液相色譜分離模式到毛細(xì)管電泳分離模式，可以有效解決中藥復(fù)雜體系分離問(wèn)題21。光譜分析方法是現(xiàn)代儀器分析中一類(lèi)極其重要的技術(shù)手段，光譜分析方法主要包括：紫外光譜（uv）、紅外光譜（ir）、核磁共振光譜（nmr）、質(zhì)譜光譜（ms）。光譜分析信號(hào)不僅包含物質(zhì)量的信息，同樣還包含物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)和性能的信息，光譜技術(shù)是藥物的結(jié)構(gòu)分析和性質(zhì)鑒定的最常

11、用手段22?；钚源x產(chǎn)物是中藥霍山石斛發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化的指示性物質(zhì)。雖然從石斛屬植物中已經(jīng)分離鑒定出生物堿類(lèi)、倍半萜類(lèi)、菲醌類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)、芴酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、甾體類(lèi)、三萜苷類(lèi)以及揮發(fā)油等多種小分子化合物，但霍山石斛的藥用成分及其組效關(guān)系的研究仍十分有限，主要原因是材料珍稀，難以提供足量的供試樣本。多數(shù)學(xué)者的研究側(cè)重于總生物堿、總多糖含量的測(cè)定23-25。目前各種先進(jìn)的色譜技術(shù)和光譜技術(shù)已應(yīng)用到霍山石斛的化學(xué)成分和組效關(guān)系研究中。2.1 多糖類(lèi) 霍山石斛是珍稀中藥材26，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有滋陰消渴、生津潤(rùn)肺、清音明目等功效?，F(xiàn)代藥理研究證明，多糖是霍山石斛的主要活性成分之一，

12、具有預(yù)防心血管疾病、提高免疫力以及顯著的抗白內(nèi)障和抗癌功效1，27-34。其代表研究成果如下：簡(jiǎn)政35霍山石斛經(jīng)由冷水萃取得到o-acetylglucomannan多醣。此黏液多醣是經(jīng)由deae離子交換樹(shù)酯及sec管柱層析純化分離而得。這由霍山石斛中分離出的黏液多醣經(jīng)由核磁共振儀、質(zhì)譜儀及高效陰離子交換色譜-脈沖安培儀分析其主干為1，4連結(jié)的-d-甘露糖和1，4連結(jié)的-d-葡萄糖比例為101。經(jīng)由核磁共振儀分析，在部分甘露糖的2號(hào)及3號(hào)位置上含有乙酰取代基比例為34%不規(guī)則的散布在o-acetylglucomannan上。利用高效液相色譜及核磁共振儀并用已知分子量的普魯蘭多醣為標(biāo)準(zhǔn)品分析其分子

13、量為1.0×104。小鼠脾臟細(xì)胞及人類(lèi)周邊單核血球細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街?，從霍山石斛中萃取得到的o-acetylglucomannans可以誘發(fā)幾種細(xì)胞激素的產(chǎn)生，包含有il-6、il-10、ifn-、g-csf、m-csf和gm-csf。其中，g-csf在此黏液多醣誘發(fā)幾種細(xì)胞激素的產(chǎn)生最顯著的生物性指標(biāo)。相對(duì)的再黏液多醣去除乙酰取代基后，多醣誘導(dǎo)小鼠脾臟細(xì)胞激素產(chǎn)生的活性消失。黃靜等36研究霍山石斛多糖dhp對(duì)四氯化碳致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用.通過(guò)建立小鼠急性肝損傷模型，連續(xù)給藥2d，每天1次測(cè)定小鼠血清alt和ast及肝勻漿中sod，mda含量，免疫組化法觀察肝細(xì)胞中tnf-表達(dá)水

14、平，he染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化.結(jié)果表明霍山石斛多糖dhp各劑量組均能降低ccl4致小鼠急性肝損傷血清alt，ast的升高，降低肝勻漿中mda含量，增強(qiáng)sod的活性，抑制肝細(xì)胞中tnf-表達(dá)，減輕ccl4對(duì)肝組織的病理?yè)p傷.說(shuō)明霍山石斛多糖dhp對(duì)ccl4致小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制tnf-表達(dá)有關(guān)。該霍山石斛dhp單糖組成分析顯示主要由木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖4種單糖按照1.78516.51314.216的比例組成，不同于已報(bào)道的具有腸道免疫調(diào)節(jié)活性多糖的單糖組成，表明dhp可能具有一種新的調(diào)節(jié)腸道免疫的活性結(jié)構(gòu)。黃森等11優(yōu)化

15、了霍山石斛多糖的提取工藝，純化分離了多種多糖組分，重點(diǎn)研究了霍山石斛多糖對(duì)人胃腺癌細(xì)胞sgc-7901的抑制作用，探討了多糖抗腫瘤作用與腫瘤相關(guān)基因之間的相關(guān)性。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合box-behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析，建立了提取溫度、提取ph和提取時(shí)間與霍山石斛多糖提取率間的數(shù)學(xué)模型。水提獲得的霍山石斛粗多糖hdp通過(guò)deae-纖維素離子交換色譜分離得到多糖hdp-1，hdp-2，hdp-3，hdp-4，hdp-5，hdp-6。其中抗胃癌活性最強(qiáng)的多糖hdp-2經(jīng)se：phacryl-200hr色譜后，又獲得hdp-2-a和hdp-2-b兩種多糖組分，經(jīng)uv掃描不含蛋白。多糖組份hdf-2

16、對(duì)胃腺癌細(xì)胞sgc-7901的作用在熒光定量rt-pcr下檢測(cè)得到，多糖組份hdp-2明顯下調(diào)胃腺癌細(xì)胞sgc-7901中原癌基因c-myc的表達(dá)，僅為對(duì)照組表達(dá)率的42.34%。同時(shí)大幅提高腫瘤抑制基因野生型p53的表達(dá)，為對(duì)照組表達(dá)率的2.042倍。2.2 生物堿、黃酮類(lèi) 生物堿是霍山石斛的主要活性成分之一，與霍山石斛多糖等其他成分一起共同作用起效，其成分和結(jié)構(gòu)也在不斷的發(fā)現(xiàn)和研究中37。主要代表成果如下：溫云飛等19對(duì)霍山石斛進(jìn)行了生物堿的提取分離和初步結(jié)構(gòu)測(cè)定與體外癌細(xì)胞藥理篩選和在霍山石斛浸液誘導(dǎo)下的人癌細(xì)胞進(jìn)入apotosis過(guò)程的鑒定.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，霍山石斛

17、全草浸提液可誘導(dǎo)相應(yīng)的人癌細(xì)胞進(jìn)入apoptosis，該過(guò)程具有細(xì)胞膜發(fā)泡現(xiàn)象和（作用一定時(shí)間內(nèi)）dna ladder特征電泳帶，并且在給藥24h后，不同的全草液對(duì)相應(yīng)的癌細(xì)胞株在facs檢測(cè)細(xì)胞的dna content時(shí)有較高凋亡峰出現(xiàn).并且此種抑制作用對(duì)人癌細(xì)胞的毒性很小，下一步signal pathway transduction的研究正在進(jìn)行中。陳乃東38-39等研究了組織培養(yǎng)條件和野生環(huán)境條件下，霍山石斛生物堿提取物在成分?jǐn)?shù)量和含量上的差異，指出試管苗野外移栽馴化植株與野生植株總生物堿、總多糖、總黃酮含量明顯不同，三者中總生物堿含量從多到少依次為：野生植株>試管苗移栽馴化植株&

18、gt;試管苗；三者中總黃酮含量從多到少依次為：野生植株（0.5%）>試管苗移栽馴化植株（0.3%）>試管苗（0%）；三者總多糖含量從多到少依次為：試管苗移栽馴化植株（4.6%）>野生植株（3.5%）>試管苗（2.3%）；在對(duì)基于生物堿、黃酮的指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)，霍山石斛試管苗移栽馴化植株hplc檢測(cè)到的共有指紋峰數(shù)量、峰面積與野生植株明顯不同，栽培植株在活性成分的組成上比野生植株明顯趨于簡(jiǎn)單，相同組分的含量也存在顯著不同；采用hplc-dad-cl聯(lián)用技術(shù)對(duì)霍山石斛總黃酮體外抗氧化譜效關(guān)系研究顯示，試管苗移栽馴化植株缺失的或峰面積減少部分指紋峰具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，這

19、些活性成分的缺失或下降必然導(dǎo)致藥材的整體藥效下降。上述研究結(jié)果提示，比起野生植株，試管苗移栽馴化植株中主要活性物質(zhì)種類(lèi)及含量的明顯減少、藥效下降，從藥效物質(zhì)基礎(chǔ)角度出發(fā)，來(lái)源于試管苗移栽馴化植株，其品質(zhì)明顯下降。 2.3 其它類(lèi) 霍山石斛不同的提取物，雖然成分不能完全闡明，但也會(huì)產(chǎn)生各種生理、藥理結(jié)果40，其代表實(shí)驗(yàn)如下：張靜等12探討霍山石斛提取物（water extracts from dendrobium huoshanense，wedh）對(duì)人喉癌細(xì)胞株hep-2增殖和凋亡的影響及其機(jī)制。分別用3.75、7.50、15.00、30.00和60.00mg/ml的wedh處理hep-2細(xì)胞，

20、采用mtt法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖水平；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；annexin v-fitc/pi雙染色激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡；fluo-3am標(biāo)記激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)游離ca2+濃度；分光光度法檢測(cè)細(xì)胞的caspase-3活性。結(jié)果顯示wedh可明顯抑制hep-2細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性，作用24、48和72h的ic50值分別為48.54、26.67和14.93mg/ml；經(jīng)wedh作用48h的細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生顯著改變，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡特征，且呈濃度依賴(lài)性，細(xì)胞內(nèi)ca2+濃度和caspase-3活性均顯著高于陰性對(duì)照組（p<0.05）。wedh對(duì)hep

21、-2細(xì)胞具有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，其機(jī)制可能與升高細(xì)胞內(nèi)ca2+濃度，激活caspase-3有關(guān)。吳榮燦41本發(fā)明提供了具有生理活性的霍山石斛植物萃取物及其制備方法。該萃取物是通過(guò)將該植物體以水溶性有機(jī)溶劑萃取或以包含水溶性有機(jī)溶劑與水的組合物萃取而獲得；所使用的水溶性有機(jī)溶劑主要選自含碳數(shù)介于18的醇類(lèi)、烷類(lèi)及酯類(lèi)，其中該萃取物具有調(diào)控視網(wǎng)膜黑色素上皮細(xì)胞作用的功效。3 結(jié)論綜上所述，采用現(xiàn)代分析技術(shù)可以得到霍山石斛不同個(gè)體的dna分子和化學(xué)成分信息，在進(jìn)行對(duì)比和分析后，可以獲得霍山石斛各個(gè)體分子遺傳特征和未知物質(zhì)整體的質(zhì)量水平情況。同時(shí)，采用現(xiàn)代分析技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)多種成分整體相關(guān)質(zhì)量

22、評(píng)價(jià)的關(guān)鍵技術(shù)。也是霍山石斛物種鑒別、質(zhì)量鑒定、開(kāi)發(fā)研究的必要技術(shù)手段。隨著各種現(xiàn)代分析技術(shù)的創(chuàng)新與提高以及世界各國(guó)對(duì)天然藥物的了解和研究的不斷深入?；羯绞姆N質(zhì)資源和質(zhì)量控制的研究工作將會(huì)從方法層面逐漸向規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的方向發(fā)展，從而推動(dòng)藥用霍山石斛研究和開(kāi)發(fā)更加成熟和完善，其研究成果將大大提升霍山石斛品質(zhì)的水平，以造福社會(huì)。參考文獻(xiàn)1hsieh y，chien c，liao s，et al.structure and bioactivity of the polysaccharides in medicinal plant dendrobium huoshanense.bioorganic a

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