培養(yǎng)基主成分優(yōu)化提高大花金挖耳胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量

1、培養(yǎng)基主成分優(yōu)化提高大花金挖耳胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量摘要：【目的】?jī)?yōu)化組合培養(yǎng)基中大量、微量元素及附加激素等培養(yǎng)條件，篩選出大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)黃酮的生產(chǎn)培養(yǎng)基。【方法】以NT+1.0mg·L-1NAA+0.2mg·L-16-BA為根本培養(yǎng)基，先優(yōu)化組合其大量元素NH+4、NO-3、K+，再優(yōu)化組合微量元素MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+，最后分別附加2，4-D、KT、GA3，測(cè)定大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)、黃酮含量及產(chǎn)量?！窘Y(jié)果】大量元素優(yōu)化、微量元素優(yōu)化及附加激素KT、GA3，大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)物中黃酮產(chǎn)量均得到了顯著提升P關(guān)鍵詞：大量元素;微

2、量元素;植物激素;黃酮;大花金挖耳中圖分類號(hào)：Q813.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384202106-652-08Abstract：【Objective】FormulationofthemediumforCarpesiummacrocephalumculturetoproduceflavonoidswasoptimizedfromtheoneobtainedbyapreviousstudy.【Method】UsingNT+NAA1.0mg·L-1+0.2mg·L-16-BAasthebase，themediumoptimizationswerefirstlyca

3、rriedoutonthemacro-elements，NH+4，NO-3andK+，thenthemicro-elements，MoO2-4，Zn2+，BO3-3，Co2+，Cu2+，I-，andMn2+andfollowedbytheadded2，4-D，KTandGA3.Thecellulargrowthaswellastheflavonoidsyieldintheculturesuspensionweremonitoredforevaluation.【Result】Withtheoptimizedadditionofthemacro-andmicro-elementsplusKTorG

4、A3，theflavonoidsproducedbyC.macrocephalumculturesignificantlyincreasedPKeywords：macroelements;microelements;phytohormone;flavonoids;Carpesiummacrocephalum0引言【研究意義】大花金挖耳CarpesiummacrocephalumFranch.etSav.系菊科天名精屬多年生草本植物，具有抗腫瘤、止血等醫(yī)用價(jià)值1-2和殺菌、殺蟲(chóng)及除草等農(nóng)藥活性3-5。黃酮類化合物是其主要活性成分之一6-7，具有抗菌、抗病毒、抗癌等藥用價(jià)值和病蟲(chóng)害防御、化感等植保

5、作用8-9，具有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物是解決大花金挖耳野生植物資源短缺和黃酮類化合物人工合成困難等問(wèn)題的有效手段10-11。培養(yǎng)基種類、大量元素、微量元素、植物激素、誘導(dǎo)子、細(xì)胞系、光照、pH等因素都會(huì)對(duì)植物細(xì)胞生物合成黃酮類化合物產(chǎn)生影響12。郭佳祺13通過(guò)優(yōu)化接種量、培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)速、pH值、無(wú)機(jī)鹽濃度、光照周期等培養(yǎng)條件，提高了蒺藜細(xì)胞生物合成黃酮的能力;趙德修等14開(kāi)展了溫度、光照、激素、碳源等不同理化因子對(duì)雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞生物合成黃酮的研究;陳紅賢等15研究發(fā)現(xiàn)碳源、氮源、磷源等大量元素的消耗與國(guó)槐槐角種胚細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮的積累密切相關(guān)，黃酮的積累和細(xì)胞生

6、長(zhǎng)屬于局部生長(zhǎng)偶聯(lián)型。李玉平等11，16-17研究了大花金挖耳愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖，建立了細(xì)胞懸浮系，并初步開(kāi)展了培養(yǎng)基、大量元素、微量元素等理化因素對(duì)大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)黃酮類化合物的研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期研究中，采取單因素試驗(yàn)已篩選出了對(duì)大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物有顯著影響的大量元素17和微量元素18中各元素的最適濃度，亟待進(jìn)一步優(yōu)化組合相關(guān)理化因子及培養(yǎng)條件，提高大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞的黃酮產(chǎn)量?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究遴選對(duì)大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮含量增加有奉獻(xiàn)的硝酸鉀KNO3、硝酸銨NH4NO3、鉬酸鈉Na2MoO4·2H2O、硫酸鋅ZnSO4·7H

7、2O、硫酸銅CuSO4·5H2O硼酸H3BO3等大量、微量元素化合物進(jìn)行組合優(yōu)化，并分別附加激素2，4-D、KT、GA3，旨在篩選黃酮生產(chǎn)培養(yǎng)基，提高細(xì)胞黃酮產(chǎn)量，為大花金挖耳工廠化細(xì)胞培養(yǎng)黃酮類化合物提供依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1細(xì)胞懸浮系大花金挖耳細(xì)胞懸浮系由西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心篩選獲得16，繼代培養(yǎng)于根本培養(yǎng)基NT0NT+1.0mg·L-1NAA+0.2mg·L-16-BA+40g·L-1蔗糖。繼代培養(yǎng)時(shí)間為710d細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)條件：pH5.8、搖床120r·min-1、25±

8、2，光照強(qiáng)度15002000lx、光照12h·d-1，下同。1.1.2儀器和試劑主要儀器：EBP-190S電子天平Sartorius公司;S-315TomyHigh-pressuresteamsterilizerTomyKOGYOCO.LTD.NerimaTokyo.Japan;UV1102紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)上海天美科學(xué)儀器;PHS-25型酸度計(jì)上海雷磁儀器廠;ZRD-5030全自動(dòng)鼓風(fēng)枯燥箱上海智誠(chéng)分析儀器制造;HZT2雙層振蕩器哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)。主要試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品中國(guó)藥品生物制品檢定所;萘乙酸NAA、6-芐氨基嘌呤6-BA、二氯苯氧乙酸2，4-D、芐氨基腺嘌呤KT、赤

9、霉酸GA3美國(guó)Sigma公司;培養(yǎng)基中添加的蔗糖、肌醇及NT19培養(yǎng)基中添加的各種化合物均為分析純;丙酮為分析純。1.2試驗(yàn)方法1.2.1懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮累積的優(yōu)化試驗(yàn)將根本培養(yǎng)基NT0中培養(yǎng)710d的細(xì)胞接種40g·L-1鮮重于試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中，試驗(yàn)均采用250mL三角瓶，每瓶100mL液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件同上?？疾齑罅俊⑽⒘吭貎?yōu)化及附加激素2，4-D、KT、GA3對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮累積的影響。向培養(yǎng)基NT0中添加KNO3和NH4NO3，對(duì)大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮含量增加有顯著影響的大量元素NH+4、NO-3、K+進(jìn)行優(yōu)化組合表1，其他大量元素為NT培養(yǎng)基

10、固有濃度19，以NT0為對(duì)照CK，考察大量元素優(yōu)化組合對(duì)大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成的影響，并得到生產(chǎn)培養(yǎng)基NT1;在大量元素優(yōu)化組合的根底上，選取前期試驗(yàn)中對(duì)大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮含量增加最為顯著的MoO2-4、Zn2+兩種微量元素進(jìn)行優(yōu)化組合表2，BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+等微量元素離子濃度依次為：0.4mmol·L-1、0.2mol·L-1、0.4mol·L-1、10mol·L-1、0.2mmol·L-1，以NT1為對(duì)照CK，考察微量元素優(yōu)化組合對(duì)大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成的影響，并得到生產(chǎn)

11、培養(yǎng)基NT2;在大量元素和微量元素優(yōu)化組合培養(yǎng)基的根底上，以NT2為對(duì)照CK，再分別添加2，4-D0、0.1、0.2、0.5、1.0mg·L-1、KT0、0.1、0.2、0.5、1.0mg·L-1和GA30、0.1、0.2、0.3、0.5mg·L-1，進(jìn)一步研究激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮產(chǎn)量的影響。1.2.2生物量的測(cè)定將上述不同試驗(yàn)處理培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)20d左右的褐化細(xì)胞進(jìn)行真空抽濾，所得細(xì)胞60烘干，細(xì)胞干重DWg·L-1為培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)指標(biāo)。細(xì)胞凈生長(zhǎng)量=收獲時(shí)細(xì)胞干重-接種時(shí)細(xì)胞干重。1.2.3黃酮含量的測(cè)定和產(chǎn)量的計(jì)算總黃酮含量測(cè)定參考文獻(xiàn)18。以蘆丁

12、為標(biāo)品，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為510nm，以蘆丁質(zhì)量濃度Lmg·mL-1對(duì)吸光值A(chǔ)進(jìn)行線性回歸，得方程L=0.0768A-0.0004r=0.9997。將上述各試驗(yàn)處理中懸浮培養(yǎng)20d的細(xì)胞抽濾、烘干、粉碎，以丙酮為溶劑，取適量過(guò)60目篩的粉碎細(xì)胞干粉，振蕩提取3次，每次24h，合并提取液，濃縮后用30%乙醇定容至0.50g·mL-1，取適量供試液，測(cè)定總黃酮含量X%，X%=V×Y/N×M×10-1，V為提取液體積mL，Y為供試液總黃酮質(zhì)量濃度mg·mL-1，N為細(xì)胞質(zhì)量g，M為稀釋倍數(shù)?？傸S酮產(chǎn)量mg·L-1=黃酮含量%×

13、;細(xì)胞生長(zhǎng)量g·L-1×1000。1.3數(shù)據(jù)處理以上試驗(yàn)重復(fù)3次，采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan分析P=0.05。2結(jié)果與分析2.1大量元素優(yōu)化組合對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮累積的影響如圖1所示，大量元素優(yōu)化組合后的培養(yǎng)基對(duì)大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮化合物的累積均有顯著的影響。從細(xì)胞生長(zhǎng)量上看，處理和顯著高于對(duì)照，處理、顯著低于對(duì)照P2.2微量元素優(yōu)化組合對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮累積的影響如圖3所示，在優(yōu)化大量元素培養(yǎng)基的根底上，研究發(fā)現(xiàn)微量元素優(yōu)化組合后的培養(yǎng)基對(duì)大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞黃酮化合物的累積有顯著的影響。從細(xì)胞生長(zhǎng)量上看，4個(gè)處理均較對(duì)照有一

14、定的增高，但差異不顯著;從黃酮含量上看，處理A、B、C顯著高于對(duì)照P2.32，4-D對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮類化合物累積的影響如圖4所示，2，4-D在0.01.0mg·L-1時(shí)，對(duì)大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞黃酮生物合成有顯著影響。培養(yǎng)基中添加2，4-D降低了培養(yǎng)細(xì)胞的干重收獲量和黃酮產(chǎn)量;低濃度2，4-D0.1mg·L-1有助于黃酮生物合成，含量為2.08%，是對(duì)照的1.10倍P2.4KT對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮類化合物累積的影響如圖5所示，KT在0.01.0mg·L-1時(shí)，對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)影響顯著，黃酮含量顯著升高，黃酮產(chǎn)量差異不顯著。細(xì)胞生長(zhǎng)量先增后降，K

15、T質(zhì)量濃度為0.1mg·L-1時(shí)，細(xì)胞干重收獲量最大，為25.56g·L-1。隨培養(yǎng)基中KT濃度的增加，細(xì)胞黃酮含量隨之增加，黃酮含量達(dá)2.00%2.07%，是對(duì)照的1.061.10P2.5GA3對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮類化合物累積的影響如圖6所示，GA3在0.00.5mg·L-1時(shí)，對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮生物合成產(chǎn)生了顯著的影響。細(xì)胞生長(zhǎng)量先增后降，GA3質(zhì)量濃度為0.2mg·L-1時(shí)，細(xì)胞干重收獲量最大，為25.29g·L-1，比對(duì)照高了0.12g·L-1，差異不顯著;低質(zhì)量濃度GA30.1mg·L-1有助于黃酮生

16、物合成，含量高達(dá)2.05%，是對(duì)照的1.08倍P3討論與結(jié)論植物細(xì)胞培養(yǎng)黃酮化合物受培養(yǎng)基組分、激素、物理?xiàng)l件等多方面因素的影響，目前沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)條件適于所有的植物細(xì)胞培養(yǎng)，這就需要研究者對(duì)不同植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮的最正確條件進(jìn)行研究12。培養(yǎng)基組分是植物培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝物積累中最直接、最重要的影響因素19。本文主要圍繞提高大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞黃酮產(chǎn)量的大量、微量元素及激素優(yōu)化組合進(jìn)行討論分析。相對(duì)于高鹽培養(yǎng)基MS和低鹽培養(yǎng)基White，NT屬于中等無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，其中的N、P、Ca、Mg、K等大量元素對(duì)大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成均產(chǎn)生了影響。本研究選取前期試驗(yàn)17中對(duì)大花金挖耳

17、細(xì)胞培養(yǎng)有顯著奉獻(xiàn)的NH+4、NO-3、K等大量元素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化組合，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NT培養(yǎng)基中NH+4、NO-3、K+濃度依次為15.46、14.10、19.10mmol·L-1時(shí)，顯著提高了黃酮含量和產(chǎn)量，分別為1.48%和363.95mg·L-1，分別是對(duì)照的1.21和1.26倍?？梢?jiàn)，調(diào)節(jié)NT中總氮濃度或銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的比例可顯著促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮生物的合成，這與水母雪蓮、銀杏、草莓等植物細(xì)胞培養(yǎng)黃酮的研究相似12。分析國(guó)槐槐角15、茶條槭20、玫瑰茄21細(xì)胞培養(yǎng)次生代謝物中氮源消耗的規(guī)律，不難推斷，氮源消耗的前期主要用于細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)性組分的合成，后期主要用

18、于各種與次級(jí)代謝相關(guān)酶的合成22;銨態(tài)氮與細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)，硝態(tài)氮與黃酮、紫杉醇、沒(méi)食子酸等次生代謝物的合成相關(guān)15，20-23;鉀離子在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮著“離子泵的作用，對(duì)細(xì)胞滲透壓及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收具有調(diào)節(jié)作用24。微量元素是植物細(xì)胞酶的組成分子或活化劑，具有重要的生理生化作用18，25-26。筆者前期系統(tǒng)研究了NT培養(yǎng)基中MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+、Fe2+等8種微量元素單一因素對(duì)大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成的影響，本研究選取前期試驗(yàn)中對(duì)大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)有顯著奉獻(xiàn)的MoO2-4、Zn2+等微量元素進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化組合，發(fā)現(xiàn)大量元素優(yōu)化

19、后的NT培養(yǎng)基中MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+等微量元素濃度依次為3.0mol·L-1、0.06mmol·L-1、0.4mmol·L-1、0.2mol·L-1、0.4mol·L-1、10mol·L-1、0.2mmol·L-1時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞的黃酮含量和產(chǎn)量可分別到達(dá)1.89%和476.97mg·L-1，較優(yōu)化大量元素的NT1培養(yǎng)基再次提高了黃酮的含量和產(chǎn)量?？梢?jiàn)，微量元素含量雖少，但調(diào)節(jié)NT中微量元素濃度及其配比仍可顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮生物的合成，說(shuō)明微量元素在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，

20、既獨(dú)立發(fā)揮各自生理生化作用，同時(shí)又與大量元素及其他微量元素相互作用協(xié)同促進(jìn)了大花金挖耳懸浮細(xì)胞的光合、呼吸、氮代謝等初生代謝，并提升了培養(yǎng)細(xì)胞黃酮類等化合物的生物合成能力。不同種類、不同濃度的植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素及其配比對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的積累有著顯著的影響27。本研究以NT+1.0mg·L-1NAA+0.2mg·L-16-BA為根本培養(yǎng)基，在大量元素和微量元素優(yōu)化組合的根底上，再分別添加2，4-D、KT和GA3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度2，4-D0.1mg·L-1有助于黃酮生物合成，2，4-D抑制黃酮的生物合成，添加2，4-D抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，總體降低了

21、黃酮的產(chǎn)量，這與2，4-D在許多植物細(xì)胞培養(yǎng)中抑制次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生的研究結(jié)論相一致27。另外，低質(zhì)量濃度KT0.1mg·L-1有助于細(xì)胞的生長(zhǎng)，高質(zhì)量濃度>0.1mg·L-1抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，附加KT0.11.0mg·L-1黃酮含量增加顯著，0.2mg·L-1KT時(shí)，黃酮產(chǎn)量最高達(dá)517.87mg·L-1，是對(duì)照1.09倍，可見(jiàn)附加不同濃度KT對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成效果不同，這與KT在紅花細(xì)胞生長(zhǎng)及紅花色素合成中發(fā)揮的作用相似28。低濃度GA3促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮的生物合成，高濃度GA3抑制了細(xì)胞黃酮的合成，這可能與GA3抑制查爾酮合成酶

22、有關(guān)29-30。總之，在前期研究的根底上，通過(guò)NT培養(yǎng)基中大量元素、微量元素逐步優(yōu)化及添加激素等試驗(yàn)手段，大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞黃酮含量和產(chǎn)量顯著高于對(duì)照，影響順序?yàn)椋捍罅俊⑽⒘吭貎?yōu)化，并附加KT的NT培養(yǎng)基>大量、微量元素優(yōu)化的NT培養(yǎng)基>大量元素優(yōu)化的NT培養(yǎng)基，黃酮含量大小依次是：2.05%、1.89%、1.48%，黃酮產(chǎn)量大小依次為：517.87、476.97、363.95mg·L-1。本研究系統(tǒng)優(yōu)化了NT培養(yǎng)基中對(duì)大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)有促進(jìn)作用的相關(guān)因子，初步篩選得到了黃酮生產(chǎn)培養(yǎng)基，為實(shí)現(xiàn)大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)黃酮提供了試驗(yàn)依據(jù)。參考文獻(xiàn)：【1】中國(guó)科學(xué)

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