土壤樣品的運(yùn)輸和貯存

1、土壤微生物研究規(guī)范II.土壤樣品的運(yùn)輸和貯存1. 土壤微生物樣品的運(yùn)輸土樣從采集點(diǎn)到實(shí)驗(yàn)室往往需要經(jīng)歷一定時(shí)間的運(yùn)輸，土樣運(yùn)輸過程中難免影響土壤的溫度、水分、氧氣等環(huán)境條件，所以要盡快置于黑暗、低溫（ 4）的密閉環(huán)境，盡量維持土壤含水量穩(wěn)定不變， 黑暗環(huán)境是為了避免光照下藻類在土壤表明的生長， 低溫是為了減少細(xì)菌繁殖， 維持微生物區(qū)系穩(wěn)定。 一般裝于聚乙烯袋子，并松扎。另外，儲存時(shí)盡可能避免物理壓實(shí)，樣品袋不要堆疊過多，以免破壞土壤原有的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致底層樣品處于厭氧環(huán)境。微生物取樣的土壤樣品需要在 0-4的條件下保存，所以土壤樣品應(yīng)及時(shí)保存在保溫箱或冰箱中（設(shè)置 0-4），并最好在一周內(nèi)完

2、成前期處理。如果采集地有冰箱、 熏蒸所需的真空干燥器和通風(fēng)櫥等設(shè)施， 建議將微生物土壤樣品熏蒸浸提后，以冷凍的浸提液保存在塑料小瓶中，以方便運(yùn)送。如果采集地沒有通風(fēng)櫥等設(shè)施， 建議將所取的土壤樣品過篩后冷藏在保溫箱中，以方便運(yùn)送。具體的流程如下：（1）提前準(zhǔn)備好保溫箱及冷凍好的冰板。 冰板需要提前 1-2 d 冷凍，可以再用自封袋裝一定量水分放平冷凍為規(guī)則的冰塊備用。（2）按照微生物取樣規(guī)范進(jìn)行取樣， 及時(shí)過篩去除根系、 土壤動(dòng)物等雜質(zhì)，放置在 0-4保鮮冰箱中保存。 用于 DNA 或 RNA 分析的土壤樣品應(yīng)用干冰速凍。用于 RNA 分析的土壤樣品在運(yùn)輸過程中應(yīng)用干冰保持低溫。用于 DNA

3、分析的土壤樣品應(yīng)用冰盒運(yùn)輸，也可用干冰。（3）運(yùn)輸當(dāng)天將土壤樣品密封好，放入保溫箱中，保溫箱底部、四周及頂部均放置冰板和用自封袋密封的冰塊， 保證樣品四周均可接觸冰板或冰塊。 注意保證土壤樣品和冰塊分別密封，以防路途中融化的水分進(jìn)入土壤樣品造成污染。（4）到達(dá)目的地后，迅速將樣品放入保鮮冰箱（0-4）保存待測。如果采樣地條件允許， 可以根據(jù)規(guī)范上的實(shí)驗(yàn)方法， 將樣品熏蒸、 浸提后保存在塑料小方瓶中， -20冷凍，然后再按照上述流程放置保溫箱中運(yùn)送到目的地，迅速放置在冷凍冰箱中（ -20）保存待測。如果購買不到保溫箱， 可以選用運(yùn)輸水果、 蔬菜等的白色泡沫箱， 密封嚴(yán)實(shí)后亦可。由于泡沫箱保溫效果

4、可能不及保溫箱， 路途較遠(yuǎn)時(shí)應(yīng)多放置冰板及冰塊，途中盡量不要打開， 放入及取出都要及時(shí)， 且需要提前確認(rèn)樣品采集地和目的地的冰箱是否留有足夠空間存放土壤樣品或者浸提液樣品。特別要注意微生物樣品的密封，放置融化的水分或者其他污染源污染樣品。2. 土壤微生物樣品的處理采樣后土壤樣品應(yīng)盡快處理手工過篩。 過篩之前，去除樣品中的植物、 可見土壤動(dòng)物和石粒等。推薦過 2 mm 篩，促進(jìn)顆粒間的氣體交換，以利于保持土壤的好氧狀態(tài)， 也能去除小石頭、 動(dòng)物和植物碎片。 一些有機(jī)物質(zhì)如粗腐殖質(zhì)或泥炭不容易通過 2 mm 篩，此時(shí)應(yīng)在潮濕條件下過 5 mm 篩。如果土壤太濕不能過篩，應(yīng)該將其攤開，置于輕微流動(dòng)的

5、空氣中，促其均勻風(fēng)干。應(yīng)不停地用手指捏碎并翻動(dòng)土壤以免表面過度干燥， 通常在室溫下進(jìn)行上述操作。 如果土壤需要風(fēng)干，不要過度風(fēng)干，風(fēng)干程度達(dá)到過篩要求即可。3、土壤微生物樣品的儲存土壤微生物樣品管理和制備過程相對特殊， 因此對土壤微生物樣品在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析階段的儲存需要特別注意對儲存條件和儲存時(shí)間的控制， 以保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確。2.1 微生物樣品儲存條件根據(jù)土壤微生物的觀測指標(biāo)、 樣品狀態(tài)等的不同， 對樣品儲存條件的要求如下：1）微生物生物量分析一般要求土壤鮮樣置于 4左右冷藏保存，可放在冰箱冷藏室或者事先放置冰板或冰塊的保溫箱中， 不能處于冰點(diǎn)以下， 以免冰凍影響微生物。一般的菌種保存也大多是在

6、 4，這個(gè)溫度可以減小細(xì)胞繁殖，維持微生物區(qū)系的穩(wěn)定性。2）土壤微生物樣品經(jīng)過熏蒸浸提等前處理后的浸提液樣品置于 -20左右的環(huán)境中冷凍保存。3）微生物多樣性分析中 Biolog 板法、PLFA 法或者 DNA 測序時(shí)大多都是采用冷凍法保存土樣， 且為了避免由于冷凍速度過慢導(dǎo)致菌體會(huì)表達(dá)大量的抗逆性基因和蛋白，樣品可以速凍后（液氮罐） ，保存在超低溫冰箱中（ -70）。4）盡量減少開關(guān)冰箱或保溫箱，以保證恒定低溫效果。如遇停電等突發(fā)事件，做好相應(yīng)應(yīng)急處理措施。5）特別要注意微生物樣品在實(shí)驗(yàn)室保存和分析過程中的密封，以免凝結(jié)的水汽或其他污染源對樣品造成污染。6）每份樣品保存量不能過多，不同樣品之

7、間避免堆疊，以免下部樣品由于擠壓形成厭氧環(huán)境。2.2 微生物樣品的儲存時(shí)間1）待測樣品的短期保存對于不同微生物種類的最適宜保存溫度并不相同， 低溫也可以造成某些微生物的死亡，到目前為止尚不能確定低溫確實(shí)可以保持原有微生物區(qū)系不變， 因此土壤微生物樣品要求在最短的時(shí)間內(nèi)分析。一般認(rèn)為土壤鮮樣 4下可保存一周，土壤浸提液 -20下可保存一個(gè)月。 ISO 10381 認(rèn)為一般土壤微生物樣品在進(jìn)行分析前最長可以保存 3 個(gè)月，如果用于 DNA 分析應(yīng)保存在 -20條件下， 用于 RNA 分析則保存在 -80條件下。2）土壤微生物樣品的長期保存（大于3 個(gè)月）根據(jù)保存年限和針對的指標(biāo)的不同，樣品應(yīng)保存在

8、-20、 -80或 -180條件下（表 IV-1）。已證實(shí)溫帶土壤樣品在 -20保存 12 月不會(huì)抑制微生物活性 （如氨氧化活性）。而且用于磷酸脂肪酸（ PLFA）和 DNA 分析的樣品可以在 -20保存 1 到 2 年。用于 RNA 分析土壤樣品也可在 -80保存 1 到 2 年。用于 DNA 、RNA 和 PLFA 分析用的土壤樣品推薦使用液氮速凍法。表 IV-1好氣條件下土壤樣品的儲存條件和年限指標(biāo)引用標(biāo)準(zhǔn)鮮樣（ 4）鮮樣（ -20 ） a鮮樣（ -80 ） 或液氮（ -180 ） a月年年P(guān)LFA，PLEL b210DNA210RNA10生物量基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸法ISO 14240-1311

9、0氯仿熏蒸浸提法ISO 14240-2硝化勢ISO 156853110氮礦化ISO 142383110土壤呼吸ISO 160723110呼吸曲線ISO 171553110脫氫酶活性ISO 23753-131ISO 23753-2a 土壤樣品在長期保存以前應(yīng)分成數(shù)份樣品保存，以便后續(xù)取樣分析；PLFA 分析應(yīng)該在采樣后立即浸提新鮮土壤樣品（ <2 mm），浸提液可以在 -20 下保存數(shù)月后用于進(jìn)一步分離和GC/MS分析；建議樣品先在液氮中速凍，然后在 -20 或 -80 下保存。b 表示在該條件下無法長期保存。4、其他土壤樣品的處理和貯存4.1 新鮮樣品的處理和貯存某些土壤成分如亞鐵、易還

10、原態(tài)錳、還原性硫、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮等，在風(fēng)干過程中會(huì)發(fā)生顯著變化， 必須用新鮮樣品進(jìn)行分析。 為了能真實(shí)地反映土壤在田間自然狀態(tài)下的某些理化性狀， 新鮮樣品要及時(shí)送回室內(nèi)進(jìn)行處理和分析。 先用粗玻璃棒或?qū)悠放榛靹蚝笱杆俜Q樣測定。新鮮樣品一般不宜貯存， 如需要暫時(shí)貯存， 可將新鮮樣品裝入塑料袋， 扎緊袋口，放在冰箱冷藏室或進(jìn)行速凍固定。4.2 風(fēng)干樣品的處理和貯存從野外采回的土壤樣品要及時(shí)放在樣品盤上， 攤成薄薄的一層， 置于干凈整潔的室內(nèi)通風(fēng)處自然風(fēng)干，嚴(yán)禁曝曬，并注意防止酸、堿等氣體及灰塵的污染。風(fēng)干樣品過程中要經(jīng)常翻動(dòng)土樣并將大土塊捏碎以加速干燥， 同時(shí)剔除土壤以外的侵入體。風(fēng)干后的土樣

11、按照不同的分析要求研磨過篩， 充分混勻后，放入樣品瓶中備用。瓶內(nèi)外各具標(biāo)簽一張，寫明編號、采樣地點(diǎn)、土壤名稱、采樣深度、樣品粒徑、采樣日期、采樣人及制樣時(shí)間、制樣人等項(xiàng)目。制備好的樣品要妥為貯存，避免日曬、高溫、潮濕，并避免酸堿氣體的污染。全部分析工作結(jié)束，分析數(shù)據(jù)核實(shí)無誤后，試樣一般還要保存三個(gè)月至半年， 以備查詢。需要長期保存的樣品，須保存于廣口瓶中，用蠟封好瓶口。一般化學(xué)分析試樣的處理與貯存將風(fēng)干后的樣品平鋪在制樣板上， 用木棍或塑料棍碾壓， 并將植物殘?bào)w、 石塊等侵入體和新生體剔除干凈， 細(xì)小已斷的植物須根， 可用靜電吸附清除。 壓碎的土樣要全部通過 2 mm 篩，未過篩的土粒必須重新

12、碾壓過篩，直至全部樣品通過 2 mm 篩為止。過 2 mm 篩的土樣可供 pH、鹽分、交換性能以及有效養(yǎng)分等項(xiàng)目的測定。將通過 2 mm 篩的土樣用四分法取出一部分繼續(xù)碾磨，使之全部通過0.25mm 篩，供有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)組成、全氮、碳酸鈣等項(xiàng)目的測定。將通過 0.25 mm 篩的土樣用四分法取出一部分繼續(xù)用瑪瑙研缽磨細(xì)， 使之全部通過 0.149 mm 篩，供礦質(zhì)全量分析等項(xiàng)目的測定。微量元素分析試樣的處理與貯存用于微量元素分析土樣的處理方法同一般化學(xué)分析樣品，但在采樣、風(fēng)干、研磨、過篩、運(yùn)輸、貯存等諸環(huán)節(jié)都要特別注意，不要接觸可能導(dǎo)致污染的金屬器具。例如采樣、制樣時(shí)使用木、竹或塑料工具，過篩

13、使用尼龍網(wǎng)篩等。通過 2 mm 尼龍篩的樣品可用于測定土壤中有效態(tài)微量元素；從通過 2 mm 篩的試樣中四分法分取一部分樣品， 用瑪瑙研缽進(jìn)一步磨細(xì)， 使之全部通過 0.149mm 尼龍篩，用于測定土壤全量微量元素。處理好的樣品應(yīng)放在塑料瓶中保存?zhèn)溆谩ｎw粒分析試樣的處理與貯存將風(fēng)干土樣反復(fù)碾碎， 使之全部通過 2 mm 篩。留在篩上的碎石稱量后保存，同時(shí)將過篩的土樣稱量， 以計(jì)算石礫質(zhì)量百分?jǐn)?shù)， 然后將土樣混勻后盛于廣口瓶內(nèi)，作為顆粒分析及其他物理性質(zhì)測定之用。 若在土壤中有鐵錳結(jié)核、 石灰結(jié)核、鐵或半風(fēng)化體，不能用木棍碾碎，應(yīng)細(xì)心揀出稱量保存。參考文獻(xiàn)ISO 10381-6: 2009 Soil quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of microbiologica