果蠅雜交實(shí)驗 山東大學(xué)

1、 山東大學(xué)實(shí)驗報告 2014年 5 月8日科目 遺傳學(xué)實(shí)驗 題目 果蠅雜交實(shí)驗 果蠅雜交實(shí)驗摘要 果蠅（Drosophila）是遺傳學(xué)實(shí)驗中最常用的動物之一。因為果蠅染色體數(shù)目少、生活史短、繁殖率高、飼養(yǎng)簡便，在基因分離、連鎖、交換等方面有著深入的研究。本次實(shí)驗通過設(shè)計雜交實(shí)驗，觀察記錄實(shí)驗過程中的性狀和數(shù)據(jù)，運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)相關(guān)知識分析實(shí)驗數(shù)據(jù)，并驗證分離定律、自由組合定律、連鎖交換定律和伴性遺傳。1. 引言普通果蠅的生活史歷經(jīng)卵，幼蟲，蛹和成蟲四個階段，是一個完全變態(tài)過程。果蠅具有生活史短，突變型多，染色體數(shù)目少（2n=8）,繁殖率高，飼養(yǎng)簡便等特點(diǎn)，是進(jìn)行遺傳學(xué)研究的好材料。普通果蠅突變型中，

2、有常染色體的殘翅及伴性遺傳的白眼等容易觀察到的性狀，便于實(shí)驗分析。實(shí)驗中選用的果蠅突變性狀一般都可用肉眼鑒定，例如紅眼與白眼，正常翅與殘翅等。而另一些性狀可在解剖鏡下鑒定，如焦剛毛與直剛毛等。列表如下： 表一：本次雜交實(shí)驗中使用的果蠅突變品系影響部分突變名稱基因符號染色體上的座位翅殘翅vgIIR 67.0眼色白眼wX 1.5體色黑檀體bIIR 48.5剛毛卷剛毛snX 21.0翅型小翅mX 36.1（卷剛毛的基因符號為sn3，報告中簡寫為sn。）分離定律：在生物的體細(xì)胞中，控制同一性狀的遺傳因子成對存在，不相融合；在形成配子時，成對的

3、遺傳因子發(fā)生分離，分離后的遺傳因子分別進(jìn)入不同的配子中，隨配子遺傳給后代的現(xiàn)象叫做孟德爾分離定律。理論上配子分離比是11，F(xiàn)2代基因型分離比是121，若顯性完全，F(xiàn)2代表型分離比是31 。野生型果蠅為紅眼、灰身、長翅、直剛毛，與這些性狀對應(yīng)的突變性狀很多，其中灰身（+）與黑身（b）是一對相對性狀，且灰身對黑身為完全顯性，控制這對相對性狀的基因位于第二號染色體上。用具有這對相對性狀的兩純合親本雜交，性狀的遺傳行為應(yīng)符合分離定律。自由組合定律：當(dāng)具有兩對（或更多對）相對性狀的親本進(jìn)行雜交，在子一代產(chǎn)生配子時，在等位基因分離的同時，非同源染色體上的基因表現(xiàn)為自由組合。實(shí)質(zhì)上就是不同相對性狀的等位基因

4、在配子形成過程中，等位基因間的分離和組合是互不干擾，各自獨(dú)立分配到配子中去，它們所決定的兩對相對性狀在F2代是自由組合的，在雜種第二代表型分離比就呈9331。黑體果蠅的體色為黑色（b），與之相對應(yīng)的野生型果蠅的體色為灰色（+），灰色對黑色為完全顯性，控制這對相對性狀的基因位于第二號染色體上；果蠅另一突變性狀為焦剛毛（sn），與之對應(yīng)的野生型性狀為直剛毛（+），控制這對相對性狀的基因位于第一號染色體上，直剛毛對焦剛毛為完全顯性。用具有這兩對相對性狀的純合親本雜交，其性狀的遺傳行為應(yīng)符合自由組合定律。伴性遺傳：位于性染色體上的基因，其傳遞方式與位于常染色體上的基因不同，它的傳遞方式與雌雄性別有關(guān)，

5、因此稱為伴性遺傳。生物某些性狀的遺傳常與性別聯(lián)系在一起，這種現(xiàn)象稱為伴性遺傳（sex-linked inheritance），這是由于支配某些性狀的基因位于性染色體上。果蠅屬XY型生物，共有四對染色體，第一對為性染色體，其余三對為常染色體。雌果蠅的性染色體構(gòu)型為XX，、雄果蠅為XY?？刂乒壯凵幕蛭挥赬染色體上，在Y染色體則沒有與之相應(yīng)的等位基因。將紅眼（+）果蠅和白眼（w）果蠅雜交，其后代眼色的表現(xiàn)與性別有關(guān)。而且，正反交的結(jié)果不同。連鎖交換定律：連鎖是指在同一同源染色體上的非等位基因連在一起而遺傳的現(xiàn)象；互換是指同源染色體的非姊妹染色單體之間的對應(yīng)片段的交換，從而引起相應(yīng)基因

6、間的交換與重組。同一條染色體上的基因是連鎖的，而同源染色體基因之間可以發(fā)生一定頻度的交換，因此在子代中將發(fā)現(xiàn)一定頻度的重組型，但一般比親組型少得多?；虻倪B鎖交換定律(linkage and cross-over law)是遺傳學(xué)的三大基本規(guī)律之一，描述了位于同一染色體上的基因的遺傳呈現(xiàn)連鎖現(xiàn)象，而同源染色體上的非等位基因之間又存在一定的交換現(xiàn)象。果蠅的翅膀是一種分析器官大小、形狀和發(fā)育格局的良好的分析系統(tǒng)。許多基因參與了翅的發(fā)育調(diào)控，新的遺傳控制機(jī)理還在發(fā)現(xiàn)和不斷研究中，重要基因的突變或相互作用可能導(dǎo)致功能變異及翅型變化。果蠅的白眼、小翅、卷剛毛(w、m、sn)這3對基因都位于x染色體上，它

7、們之間也呈現(xiàn)一定的連鎖互換現(xiàn)象。2. 材料和方法2.1 實(shí)驗材料材料：不同品系的果蠅18號：野生型果蠅：紅眼、灰身、長翅、直剛毛（+ + + +）14號：黑殘果蠅：黑檀體、殘翅（ee vgvg）品系； 6號：三隱果蠅：灰身、白眼、小翅、卷剛毛（+ w m sn/+ w m sn）。（其中，白眼、小翅和卷剛毛性狀均位于X染色體上）培養(yǎng)瓶，麻醉瓶，白色塑料板，小毛筆，油性記號筆； 麻醉劑：乙醚。2.2 實(shí)驗方法2.2.1 第一周（3月21日/28日）設(shè)計實(shí)驗：我們組實(shí)驗?zāi)康氖球炞C自由組合定律與連鎖交換定律，所以我們要選取不同品系的果蠅進(jìn)行雜交實(shí)驗。14號果蠅（黑檀體、殘翅）和18號野生型

8、果蠅（灰身、長翅）雜交用于驗證自由組合定律；6號果蠅（白眼、小翅、卷剛毛）和18號野生型果蠅（紅眼、長翅、直剛毛）雜交用于驗證伴性遺傳和連鎖交換定律。表二：親本果蠅類型項目自由組合定律基因的連鎖與交換親本18號（灰身，長翅）18號（紅眼、長翅、直剛毛）14號（檀黑體、殘翅）6號（白眼、小翅、焦剛毛）收集處女蠅：在做雜交實(shí)驗6-8小時前，選擇生長較好、含蛹較多的培養(yǎng)瓶，將瓶中的所有成蠅都清除。8小時內(nèi)，瓶中生長出的雌蠅均尚未發(fā)生交配，為我們所需的處女蠅。接種：按照設(shè)計實(shí)驗的正交和反交方式，將處理好的雌雄果蠅分出性別并確認(rèn)性狀正確后，每個培養(yǎng)瓶中接種2-3只不同性別的果蠅，貼好標(biāo)簽和記號，寫明雜交

9、組合和姓名。置于室溫培養(yǎng)。2.2.2 第二周（3月28日/4月4日）培養(yǎng)瓶中的親本蠅已培養(yǎng)7天，為避免混淆，在F1孵出前將親本蠅倒出。2.2.3 第三周（4月4日/4月11日）雜交親本之后的第11-12天，F(xiàn)1開始出現(xiàn)。觀察并記錄F1代的性狀，如果沒有出現(xiàn)預(yù)期外的性狀，則可以選取3-4對F1子蠅接入新的培養(yǎng)瓶中，置于室溫下培養(yǎng)。2.2.4 第四周（4月11日/4月18日） 在F2代成蟲出來之前，為避免親子蠅混淆，要倒出培養(yǎng)瓶中所有的F1果蠅。2.2.5 第五周及第六周（4月14日23日/4月21日30日）接種F110天之后，F(xiàn)2代子蠅出現(xiàn)，在出現(xiàn)后的10天之內(nèi)，每間隔2-3天統(tǒng)計并記錄瓶中F2

10、代果蠅的性狀和數(shù)目，以及相應(yīng)雌雄比例。2.2.6 數(shù)據(jù)分析對自己組統(tǒng)計的實(shí)驗數(shù)據(jù)分析并且對雜交實(shí)驗的結(jié)果進(jìn)行2測驗，對比實(shí)驗值和期望值。3. 結(jié)果3.1實(shí)驗數(shù)據(jù)及分析3.1.1自由組合定律表三：果蠅18號與14號的雜交結(jié)果正交（雌18號×雄14號）反交（雌14號×雄18號）F1表型灰身長翅 表型灰身長翅雌雄雌雄數(shù)目1623數(shù)目93F2表型灰身長翅灰身殘翅黑身長翅黑身殘翅表型灰身長翅灰身殘翅黑身長翅黑身殘翅數(shù)目198585312數(shù)目627164比例49.514.513.253比例15.51.75413.1.1.1圖譜18號 灰身長翅（AABB） 14號 黑檀體殘翅（aabb）

11、【正反交相同】P: AABB（灰身長翅）×aabb（黑檀體殘翅） F1: AaBb(灰身長翅)自交F2：AABB AaBB AABb AaBb aaBB aaBb AAbb Aabb aabb灰身長翅 黑檀體長翅 灰身殘翅 黑檀體殘翅理論 比值： 9 ： 3 ： 3 ： 1實(shí)際 正交 數(shù)量： 198 5 4 1 比值： 49.5 ： 14.5 ： 13.25 ： 4 反交 數(shù)量： 62 7 16 4 比值： 15.5 ： 1.75 ： 4 ： 13.1.1.2 適合度檢驗我們通過卡方檢驗來判斷實(shí)際結(jié)果與預(yù)期結(jié)果是否符合。體色基因和翅型基因是在不同的染色體上的，他們在遵循自由組合定律的

12、同時，各自又遵循分離定律。于是我們通過對單對性狀的結(jié)果進(jìn)行適合度檢驗來驗證分離定律，對兩對性狀的結(jié)果進(jìn)行適合度檢驗來驗證自由組合定律。檢驗結(jié)果如下：表四：18號果蠅與14號果蠅雜交的單因子適合度檢驗正交基因體色基因（A/a）翅型基因（B/b）表型灰身檀黑合計長翅殘翅合計觀察值（O）2566532125170321預(yù)期值（E）240.7580.25321240.7580.25321（O-E）2/E0.9662.8983.8640.4361.3091.74523.8641.745P（n=1）0.02-0.05(<0.05)0.1-0.25(>0.05)反交基因體色基因（A/a）翅型基因

13、（B/b）表型灰身檀黑合計長翅殘翅合計觀察值（O）692089781189預(yù)期值（E）66.7522.258966.7522.2589（O-E）2/E0.0760.2280.2951.8965.6887.58420.2957.584P（n=1）0.10-0.50（>0.05）<0.01表五：18號果蠅與14號果蠅雜交的雙因子適合度測驗表型合計正交灰身長翅檀黑長翅灰身殘翅檀黑殘翅觀察值（O）198585312321預(yù)期值（E）180.5660.1960.1920.06321（O-E）2/E1.680.080.860.403.0223.02P（n=3）0.25-0.50(>0.0

14、5)反交觀察值（O）62716489預(yù)期值（E）50.0616.6916.695.5689（O-E）2/E2.855.630.030.448.9528.95P(n=3)0.02-0.05（<0.05）3.1.1.3數(shù)據(jù)分析適合度檢驗的結(jié)果表明：單對性狀檢驗中，體色基因的正交結(jié)果不在分離定律的隨機(jī)誤差范圍內(nèi)，反交結(jié)果符合；翅型基因的正交結(jié)果在分離定律隨機(jī)誤差范圍內(nèi)，反交結(jié)果不符合。兩對性狀檢驗中，正交結(jié)果在自由組合定律隨機(jī)誤差范圍內(nèi)，反交結(jié)果不符合。對于這種正反交始終一種符合一種不符合的驗證結(jié)果，結(jié)合產(chǎn)生的后代數(shù)量來看，我們提出了這樣的猜想：是否是不同基因在雌雄配子中的存活率不同，使其在正

15、交與反交時產(chǎn)生了差異，導(dǎo)致后代的數(shù)量有明顯不同，從而使檢測結(jié)果出現(xiàn)異常。我們查閱了相關(guān)的文獻(xiàn)1，發(fā)現(xiàn)有人做過對中國春與粗山羊草的正反交授粉后不同時間固定的子房的胚胎學(xué)研究，結(jié)果出現(xiàn)了正交所形成的正常胚的質(zhì)量比反交形成的胚質(zhì)量要好；而在反交組合中,受精發(fā)育過程較正常,而在正交組合中受精過程延遲,多數(shù)受精卵敗育的情況。另外在之前別人做的果蠅雜交實(shí)驗中他們有提出：殘翅突變比黑檀體突變對果蠅生存的影響更大。那么就可能是殘翅降低了果蠅的生存能力，使殘翅果蠅存活率低。這些也只是對于我們猜想的一個例證，目前沒有具體證明相關(guān)結(jié)論。 另外，我們認(rèn)為反交實(shí)驗做的組數(shù)比正交要少也存在關(guān)系。由于在反交組的F1代果蠅在

16、接入新的培養(yǎng)瓶的過程中出現(xiàn)了死亡，導(dǎo)致其后代的數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于正交組。F1代數(shù)量上的差異可能是導(dǎo)致F2代出現(xiàn)結(jié)果一邊倒的原因。3.1.2連鎖交換定律表六：果蠅18號與6號雜交結(jié)果F1（1）正交（雌18號×雄6號）反交（雌6號×雄18號）F1表型紅長直 白小卷 表型紅長直白小卷雌雄雌雄雌雄雌雄數(shù)目131700數(shù)目160113比例3.254.25/比例4/0.253.25如表中藍(lán)色數(shù)字所示，F(xiàn)1代中不應(yīng)該出現(xiàn)性狀為白眼小翅卷剛毛的雌性果蠅。通過小組人員和老師討論，一致認(rèn)為三種性狀都發(fā)生了改變，因此基本不存在變異的可能性。最可能的原因是在接入親本時沒有仔細(xì)看清楚性狀，將性狀為白眼小

17、翅卷剛毛的雄性果蠅誤認(rèn)為是白眼小翅卷剛毛的雌性果蠅接入了培養(yǎng)瓶中，產(chǎn)出的F1代中便存在白眼小翅卷剛毛的雌性果蠅。至于該性狀的果蠅數(shù)量如此少，我認(rèn)為可能是因為F1代果蠅獲得的數(shù)量過少。因此，該組果蠅應(yīng)當(dāng)被舍棄，無法進(jìn)行后續(xù)自交來驗證實(shí)驗。我們采用了另一小組的性狀正常的果蠅的反交F1代，進(jìn)行后續(xù)的自交實(shí)驗。表七：果蠅18號與6號雜交結(jié)果F2（2）F2表現(xiàn)型正交（雌18號×雄6號）反交（雌14號×雄18號）雌性雄性合計雌性雄性合計紅長直（+ + +）11544159292352白小卷（w m sn）0242420929白小直（w m +）022000紅長卷（+ + sn）0000

18、00紅小直（+ m +）12820257白長卷（w + sn）011314白長直（w + +）044134紅小卷（+ m sn）033000合計12786213554196表八：果蠅18號與6號雜交反交結(jié)果【全班】（3）F2 表型1組2組3組4組5組6組7組合計比例紅長直（+ + +）1425212520232415274.912%白小卷（w m sn）9588891360白小直（w m +）000000001.413%紅長卷（+ + sn）10003004紅小直（+ m +）612088103514.488%白長卷（w + sn）20110116白長直（w + +）1313133159.18

19、7%紅小卷（+ m sn）114010411合計34353737414455283100%3.1.2.1圖譜P: 紅長直（+ + +/Y） × 白小卷（w m sn/ w m sn）F1： 白小卷（w m sn/Y） × 紅長直（+ + +/ w m sn）F2: 紅長直（+ + +） 白小卷（w m sn） 白小直（w m +） 紅長卷（+ + sn）紅小直（+ m +） 白長卷（w + sn） 白長直（w + +） 紅小卷（+ m sn）3.1.2.2結(jié)果分析正交的F1代中雄性果蠅和雌性果蠅均為紅長直，無法進(jìn)行三點(diǎn)測交實(shí)驗計算重組率。而反交的F1代中雄性果蠅均為三隱性，

20、雌性均為顯性，可以用于三點(diǎn)測交重組率的計算。表九：三點(diǎn)測交結(jié)果表現(xiàn)型數(shù)量紅長直（+ + +）52白小卷（w m sn）29白小直（w m +）0紅長卷（+ + sn）0紅小直（+ m +）7白長卷（w + sn）4白長直（w + +）4紅小卷（+ m sn）0合計96通過觀察反交的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)白小直（w m +）和紅長卷（+ + sn）兩種果蠅數(shù)量為0，可以判斷這兩種性狀是雙交換結(jié)果。因此可知，剛毛性狀基因位于三者的中間，三種基因在染色體上的順序為：m sn w。下一步為了確定三種基因在染色體上的圖距，我們進(jìn)行了重組值的計算。結(jié)果如下表：表十：重組值計算結(jié)果（1）本組實(shí)驗理論值 重組值圖距R

21、f（w-m）15.625%+0%*2=15.625%15.62534.6Rf（sn-m）4.167%4.16715.1Rf（w-sn）11.458%11.45819.5并發(fā)率0干擾1由Rf值可得sn-m間的圖距是4.167cM，w-sn間的圖距是11.458cM，因此三種基因在染色體上的排列順序如下：m sn w4.167 11.45815.625理論連鎖圖：m sn w15.1 19.634.6和理論值相比，我們發(fā)現(xiàn)差距相當(dāng)大，我們首先考慮可能是實(shí)驗數(shù)據(jù)過少的原因。因此我們搜集了全班多組數(shù)據(jù)進(jìn)行計算。結(jié)果如下：表十一：重組值計算結(jié)果（2）各組實(shí)驗理論值重組值圖距Rf（w-m）23.675%+

22、1.413%*2=%26.50134.6Rf（sn-m）10.601%10.60115.1Rf（w-sn）15.901%15.90119.5并發(fā)率0.838干擾0.162根據(jù)計算出的重組值繪制出連鎖圖：m sn w15.901 10.60126.501對比全班數(shù)據(jù)和我們一個組的數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)：隨著果蠅數(shù)據(jù)樣本的增多，最后的結(jié)果也越來越接近理論圖距值，但是仍舊和理論值有一定的差距。綜合分析，我認(rèn)為存在差距的原因可能有：1、實(shí)驗室中果蠅數(shù)目有限，這使引起的誤差的影響力加大，也是導(dǎo)致結(jié)果與理論值有偏差的一大原因。2、性狀判斷時存在誤判，在進(jìn)行F2計數(shù)時經(jīng)常不小心把果蠅給麻醉死了，在鏡下觀察翅型的時候

23、，看到的果蠅都是翻翅的，會存在長翅與小翅在觀察過程中有誤判的情況。而且有時候有的果蠅沒有完全羽化，特征不是非常明顯，也會導(dǎo)致誤判。從而導(dǎo)致統(tǒng)計的數(shù)據(jù)存在一些問題而影響結(jié)果。3、在統(tǒng)計果蠅數(shù)據(jù)時，由于操作不當(dāng)存在丟失或者是混淆果蠅的情況。4、三隱果蠅的個體生存能力較弱，在密度交高的幼蟲群體中，容易死亡而被淘汰。因此可能會對實(shí)驗誤差有影響。5、果蠅的生活史與溫度密切相關(guān)，但是由于本次實(shí)驗是全班人一起做的。由于每組的實(shí)驗設(shè)計時間不同，導(dǎo)致很多人做的時候把全班的果蠅取出來就沒有再放回溫箱中。做實(shí)驗的時間持續(xù)了近一個月，溫度不可能一直保持在25不變。所以溫度對果蠅的生長可能有一定的影響。6、通過查閱文獻(xiàn)

24、2，我們得知，在三隱性性狀分析的三點(diǎn)測交實(shí)驗中，F(xiàn)2代會變異產(chǎn)生一種新性狀叫做小皺翅（如圖2）。在我們組統(tǒng)計F2代果蠅的時候，確實(shí)有出現(xiàn)過這樣的果蠅。但是由于我們不知道這種性狀和小翅不一樣，因此都把它當(dāng)做了小翅來計算。在那篇文獻(xiàn)中，研究者通過計算發(fā)現(xiàn)，如果將小皺翅忽略，則對最后的結(jié)果無顯著性影響，但如果把小皺翅算作殘翅或小翅，都會使結(jié)果產(chǎn)生顯著性差異。4. 討論4.1注意事項及改進(jìn)之處：（1）由于是第一次養(yǎng)果蠅，我們在實(shí)驗過程中導(dǎo)致許多果蠅死亡，甚至有的全管霉變或無子代產(chǎn)出。（2）觀察果蠅的性狀時，盡量用肉眼直接觀察，不要長時間放到解剖鏡下，會導(dǎo)致果蠅由于溫度過高而被烤死。解剖鏡可以作為輔助觀察一些難以確定的性狀。（3）果蠅的生活史與溫度密切相關(guān)，每次計數(shù)操作完都應(yīng)當(dāng)把果蠅放回到恒溫箱中培育。（4）果蠅要適度麻醉，挑蠅用毛筆，忌用鑷子和其他工具，以免影響果蠅生長繁育。 （5）挑處女蠅時，每次只挑12小時內(nèi)羽化成蟲，超過12小時的成蟲已逐漸有交配能力,必須一只不留地倒出處死,才能進(jìn)行第二次挑選。 （6）剛羽化的果蠅色淡白，體軟綿，難辨，務(wù)必小心區(qū)別。 （7）使用毛筆和塑料板，要用酒精棉球消毒，同時必須晾干才能使用。 （8