木聚糖酶測(cè)定的有關(guān)問(wèn)題

1、飼料用木聚糖酶活力測(cè)定的研究文章來(lái)源：農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)屮心 作者：陸文清等 更新時(shí)間：2011-03-30飼料用木聚糖酶的分析測(cè)定是長(zhǎng)期以來(lái)困擾木聚糖酶牛產(chǎn)和應(yīng)用的一個(gè)主 要難題，特別是固態(tài)發(fā)酵牛產(chǎn)的木聚糖酶，發(fā)酵成品屮往往含有其它非淀粉多糖 酶(纖維索酶、葡聚糖酶、果膠酶和甘霜聚糖酶等。文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于影響 酶活測(cè)定的因素很多，測(cè)定的重復(fù)性較差4-5, 7,除了溫度和pll值以外，還存 在著莫它很多不確定的因素。本文將從底物的性質(zhì)和濃度、酶樣的稀釋度、離子 強(qiáng)度和反應(yīng)時(shí)間等方面討論對(duì)酶活測(cè)定的影響，提出比較可行的飼料用木聚糖酶 的分析方法。酶活定義為在37 °c和設(shè)定pll值條件下，每

2、分鐘內(nèi)從底物溶液中降解釋放1 umol/1述原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位(u) o測(cè)定木聚糖酶活力的方法主 要有3種：粘度法、底物染色法和還原糖法。粘度法是通過(guò)測(cè)定木聚糖酶對(duì)底物粘度的降解速度來(lái)計(jì)算酶活力，這種測(cè)定 分析方法有較好的實(shí)用價(jià)值，但是測(cè)定過(guò)程比較繁瑣，而且重復(fù)性較差，口前很 少采用。底物染色法是一種比較簡(jiǎn)便快速的測(cè)定方法,其基木原理是以木聚糖為基 質(zhì)，用膠聯(lián)方式連接和包裹特定的染料，制成染料含量均衡，質(zhì)量穩(wěn)定的片劑。這 種片劑容易溶于水溶液中，與木聚糖酶反應(yīng)后，長(zhǎng)鏈的木聚糖被降解，結(jié)合的染料 分子被釋放到溶液屮。通過(guò)測(cè)定溶液屮染料的濃度，就可以就算出酶活力。這種 測(cè)定方法經(jīng)常被一

3、些專(zhuān)業(yè)生產(chǎn)生物酶的人型企業(yè)采用。但是它只能測(cè)定特定的木 聚糖酶活力，不具有代表性。還原糖法是通過(guò)測(cè)定還原糖的產(chǎn)量來(lái)計(jì)算酶活力。這種分析方法也比較簡(jiǎn) 便，而且重復(fù)性也比較好。國(guó)內(nèi)外關(guān)于木聚糖酶的研究報(bào)告多數(shù)采用這種方法。 這種方法的主耍不足是不能很好地分析內(nèi)切酶的活力，而內(nèi)切酶的活力對(duì)于飼料 酶的實(shí)際使用效果來(lái)說(shuō)是很重要的。如杲希望通過(guò)測(cè)定木聚糖酶在某一標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)卜的活力來(lái)判斷木聚糖酶質(zhì)量 的優(yōu)劣或者預(yù)測(cè)英動(dòng)物飼喂效果是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。木聚糖酶的實(shí)際作用底物是不溶 于水的高聚物，它們主要存在于植物種子的表皮層內(nèi)，與葡聚糖、果膠、廿露聚 糖、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合在一起。在天然木聚糖與水組成的多

4、相體 系中，酶總是處于底物不飽和狀態(tài)，因此難以用測(cè)定酶反應(yīng)初速度的方法測(cè)定酶 活力。酶與底物的反應(yīng)是在固相界面上進(jìn)行的，其酶解反應(yīng)速率受到底物對(duì)酶蛋 白吸附速率和產(chǎn)物擴(kuò)散速率的限制4。目前通常采用的底物是溶于水的木聚糖, 如燕麥木聚糖和樺木木聚糖，其測(cè)定值要比實(shí)際發(fā)揮作用的酶活力高出很多倍 5-6 o從口前的研究進(jìn)展分析，制定一個(gè)絕對(duì)公平的標(biāo)準(zhǔn)是很困難的，幾乎是 不可能的。2005年6月，我們接受全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會(huì)下達(dá)的木聚糖酶活力 測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)，聯(lián)合了眾多酶制劑企業(yè)共同起草了木聚糖酶活力測(cè)定的標(biāo) 準(zhǔn)。在標(biāo)準(zhǔn)起草過(guò)程屮，我們分析了近300個(gè)含有木聚糖酶的樣測(cè)定數(shù)據(jù) 約1 200個(gè)

5、。通過(guò)綜合各種因素，采用還原糖法，分析了影響?yīng)q活力測(cè)定值的因 索，同時(shí)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，制定了相對(duì)比較公正科學(xué)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。1重要操作分析參數(shù)的確定1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍確定酶解產(chǎn)物濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍是酶活力測(cè)定的前提，試 驗(yàn)采用dns法測(cè)定木糖濃度，其線性范圍為：木糖濃度在0. 20. 7 mg/ml之間, 吸光度在0. 150.70之間1.2底物的性質(zhì)從酶的組成分析可以發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶存在著底物作用的特異性。目前工業(yè)生產(chǎn)中使用的木聚糖酶主要有兩大類(lèi)，一類(lèi)是用于飼料，另外一類(lèi) 是用于造紙。用于飼料的木聚糖酶應(yīng)該以降解燕麥木聚糖的能力為主要檢測(cè)指 標(biāo)，而用于造紙工業(yè)的木聚糖酶應(yīng)該以降解

6、樺木木聚糖為主要分析指標(biāo)。在實(shí)際使用過(guò)程小，單純比較某一種酶活力指標(biāo)是不夠的，但是要想全而衡 量飼用木聚糖酶的活性和使用效果也是很困難的。目前國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道通常以 降解燕麥木聚糖(sigma x0627)的活力作為主要比較指標(biāo)8-10,這是因?yàn)闇y(cè)定 降解燕麥木聚糖相對(duì)比較容易，重復(fù)性也比較好。因此筆者建議測(cè)定飼料用木聚 糖酶活力的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也以測(cè)定降解燕麥木聚糖的活力為主要指標(biāo)。從理論上分析，只耍滿足3個(gè)條件，即能被酶作用、很好的代表性、很好的 穩(wěn)定性和重復(fù)性，都可以作為測(cè)定飼料酶適力的底物。但是，從目前的研究分析 發(fā)現(xiàn)，能符合這個(gè)條件的底物只有sigma x0627,雖然sigma x062

7、7這個(gè)產(chǎn)品的 木意并不是想用于木聚糖酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)底物。無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外，也不論 是生產(chǎn)實(shí)際還是sci論文，涉及木聚糖酶活力測(cè)定的底物基本上都是用sigma x0627o1.3底物濃度對(duì)測(cè)定活力的彩響底物濃度對(duì)測(cè)定值有重要影響，這主要與酶反應(yīng)的米氏常數(shù)km值有關(guān)。圖 2是關(guān)于3種菌種產(chǎn)生的木聚糖酶，它們耍求的飽和底物作用濃度(使酶活發(fā)揮 達(dá)到99%的飽和活力時(shí)的底物濃度)有一定差異。從理論上分析，底物濃度越高分析的偏差越小。但是，實(shí)際上并非如此，過(guò) 高的底物濃度也會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生不利的彩響。燕麥木聚糖比較難溶丁水，需要 先在堿性條件下加熱，然后才能溶解。如果配制濃度過(guò)高，底物溶液中的還原糖

8、 和低聚糖含量都增大，使測(cè)定木底值升高，所以過(guò)高的木聚糖濃度是不必要的。由圖2可知，三種木聚糖酶(xylanase 1> xylanase 2、xylanase 3分別來(lái)源于 硫色曲霉a. sulphureus>米曲霉a. orzyae和黑曲霉a. niger),它們的飽和 底物濃度都不超過(guò)3.0 mg/mlo目前市場(chǎng)上流行的由畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶，其結(jié)構(gòu)基因也是來(lái)自曲 霉菌或者細(xì)菌，而細(xì)菌產(chǎn)生的木聚糖酶(包括其它酶種)其飽和底物濃度遠(yuǎn)低于曲 霉菌產(chǎn)生的酶。燕麥木聚糖(sigma x0627)在屮性條件下很難溶解，在堿性條件下容易溶解。 在溶解燕麥木聚糖底物時(shí)可以先在氫氧化鈉

9、堿性溶液中溶解，然后再用醋酸溶液 調(diào)節(jié)到所需的酸堿度。事實(shí)證明，這種方式是比較好的，所產(chǎn)生的木底還原糖濃 度也是很低的，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響很小。1.4反應(yīng)液離了強(qiáng)度對(duì)測(cè)定的影響反應(yīng)液的離子強(qiáng)度對(duì)酶活力測(cè)定結(jié)果也有影響。如圖3所示：在不同離子強(qiáng) 度條件下測(cè)定纖維素酶的活力，結(jié)果有較大wo溶液的離了強(qiáng)度影響酶分了的 空間構(gòu)像，從而影響了酶分子活力的發(fā)揮。所以，在測(cè)定過(guò)程中應(yīng)該統(tǒng)一反應(yīng)液 的離子強(qiáng)度，這一點(diǎn)往往被人們忽視。那么究竟應(yīng)該選擇何種離子強(qiáng)度比較合適, 口前述沒(méi)有統(tǒng)一。不同的酶系要求的最佳離子強(qiáng)度各不相同，需要經(jīng)過(guò)探索才能 確定。根據(jù)畜禽消化道的生理狀況，筆者建議反應(yīng)液的離子強(qiáng)度采用0. lmo

10、l/lo1.5反應(yīng)時(shí)間的選擇為了使獲得的測(cè)定值盡可能準(zhǔn)確，不僅需要選擇在線性的反應(yīng)范圍內(nèi)，而且 應(yīng)該冇足夠的線性反應(yīng)時(shí)間。在線性反應(yīng)條件下，延續(xù)的作用時(shí)間越長(zhǎng)，測(cè)定的 相對(duì)誤弟也越小。大量研究發(fā)現(xiàn)，不同的酶系其線性作用時(shí)間各不相同。一般情況下，酶系較全 的組分線性作用時(shí)間較長(zhǎng)。而酶系比較簡(jiǎn)單的組分,線性作用時(shí)間較短。圖4是 2種比較典型的木聚糖酶系及比利時(shí)生產(chǎn)酶c的線性范圍。硫色曲霉(a. sulphureus mafic-001)產(chǎn)生的木聚糖酶a的線性作用時(shí)間接近100 min,黑曲 霉(a. niger mafic-005)產(chǎn)生的木聚糖酶b的線性作用吋間不到60 min。從文 獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)

11、和筆者的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，比利時(shí)生產(chǎn)的一種由細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的木聚 糖酶c的線性作用時(shí)間最長(zhǎng)，可達(dá)8 h左右。線性反應(yīng)時(shí)nextpage間最短的商業(yè)木聚糖酶是出一種木霉發(fā)酵產(chǎn)生的，線性反應(yīng)時(shí)間不到20 min5 o酶反應(yīng)的線性作用時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)分析產(chǎn)物本底值含量高的酶產(chǎn)品是很有利用價(jià) 值的。在實(shí)際測(cè)定過(guò)程中，為了消除產(chǎn)品的產(chǎn)物本底誤差，必須適當(dāng)加大稀釋度。 此時(shí)就要盡量延長(zhǎng)酶反應(yīng)時(shí)間，使形成的產(chǎn)物量盡可能與木底值拉開(kāi)距離。這種 情況特別適用于測(cè)定活力比較低的酶產(chǎn)品。1.6酶反應(yīng)液ph值的選擇反應(yīng)液ph值的選擇是重要參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，目前木聚糖酶的同功酶至少有 200種,有商業(yè)生產(chǎn)價(jià)值的不少于10利4它們的垠

12、適ph值都不一樣，而且有些變 動(dòng)幅度還很大（見(jiàn)圖5）。如何確定合理的分析用ph值對(duì)酶活力測(cè)定的影響。目前國(guó)內(nèi)的很多飼料生 產(chǎn)企業(yè)對(duì)于飼料酶的綜合評(píng)價(jià)能力很低，很多用戶只看標(biāo)示酶活力，沒(méi)有考慮實(shí) 際作用效果。由于飼料酶產(chǎn)品標(biāo)簽上不能標(biāo)示很寬泛的ph值范圍內(nèi)的表現(xiàn)酶活, 另外，也由于生產(chǎn)菌種不同，即使是同樣的測(cè)定酶活力，實(shí)際使用效果也是不同 的。所以必須要定一個(gè)比較合理的ph值，在這個(gè)ph值條件下測(cè)定酶活力。酶活 力只是一個(gè)酶活效果的參考值，但是對(duì)于產(chǎn)品本身來(lái)說(shuō)確是判定產(chǎn)品質(zhì)量是否合 格的重要指標(biāo)?？紤]到目前流行的測(cè)定木聚糖酶ph值和實(shí)際可操作性，木標(biāo)準(zhǔn)采用5. 50 作為測(cè)定用ph值。1.7樣品

13、酶活力檢測(cè)限量的確定如果從純粹的分析儀器和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍考慮，樣品酶活力的檢測(cè)限量 可以達(dá)到l.o u/g, m至更低。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些在預(yù)混料屮的飼料酶，冇些木 聚糖酶活力在5.0 u/g以上，也很難測(cè)定出來(lái)，往往只顯示0.205 u/go使 用螯合物以消除金屬離子的干擾，結(jié)果也不理想。這種現(xiàn)象不僅存在于木聚糖酶, 其它一些飼料酶，如常用的植酸酶、纖維索酶和葡聚糖酶等都冇類(lèi)似現(xiàn)象?？紤]到飼料用木聚糖酶的實(shí)際情況，我們選定10.0 u/g作為其檢測(cè)限量。 事實(shí)上，目前流通的絕大多數(shù)飼料用木聚糖酶（包括含木聚糖酶的復(fù)合酶）的活力 很少低于20.0 u/g,選用10.0 u/g作為檢測(cè)限量已經(jīng)

14、覆蓋了 99%以上的流通產(chǎn) 品。1.8酶樣的稀釋度對(duì)酶活力測(cè)定的影響（見(jiàn)表2）酶分了的濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果也有重要影響，表2是關(guān)于硫色曲霉固態(tài)發(fā)酵制品 屮的木聚糖酶活力測(cè)定值（sigma x0627為底物）與稀釋倍數(shù)的關(guān)系。確定酶樣的稀釋度實(shí)質(zhì)上是選擇酶分了的數(shù)量與底物分了的數(shù)量z間的比 例，二者的比例只有在一定的范圍內(nèi)，酶分子的活力才能得到充分發(fā)揮。超出了 這個(gè)比例范圍，酶的活力發(fā)揮受到影響。所以在測(cè)定酶活力時(shí)需要做酶樣的稀釋 梯度，梯度的間隔不能太大，最好是加倍稀釋?zhuān)源_定合適的線性測(cè)量范圍。1. 9底物存放時(shí)間對(duì)酶活力測(cè)定值的影響木聚糖酶的反應(yīng)底物（燕麥木聚糖sigma x0627）是多聚物，

15、長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)使 底物分解，產(chǎn)生較多的小分子寡聚物和單體，使測(cè)定值偏高，同時(shí)還會(huì)造成較高 的本底值，影響測(cè)定精度。我們通過(guò)試驗(yàn)分析了 10.0 mg/ml的木聚糖底物溶液 在4 °c條件下的存放吋間對(duì)木底還原糖濃度的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。木聚糖是比較容易降解的多糖。在4 °c冰箱存放2d,降解產(chǎn)生的還原糖達(dá) 到0. 142 mg/ml,這個(gè)本底值對(duì)酶活力測(cè)定結(jié)果有很大影響。建議底物配制后的 存放時(shí)間不超過(guò)12 h,最好現(xiàn)配現(xiàn)用。1.10關(guān)于樣品處理的一些細(xì)節(jié)問(wèn)題目前在測(cè)定分析中主要存在的操作細(xì)節(jié)問(wèn)題有：樣品在緩沖液中合適的存放 吋間和酶液如果采用過(guò)濾獲得清液是否可行。根據(jù)我們的研

16、究，一般情況下，樣品中的酶蛋門(mén)在磁力攪拌30 min的條件 下已經(jīng)充分溶解到緩沖液小了，沒(méi)必要再進(jìn)一步存放浸泡。但是如果遇到-些包 裹很致密的顆粒，需要一定時(shí)間的浸泡才能使酶蛋白充分釋放?？紤]到生產(chǎn)金業(yè) 的實(shí)際可操作性和分析結(jié)果的可靠性，我們建議在冰箱中再存放12 ho從目 前我們獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，浸泡2 h已經(jīng)足夠，目前還沒(méi)有遇到例外。樣品酶液都采用低速離心（3 000 g以下）獲得清液，如果采用過(guò)濾，酶蛋白 容易被過(guò)濾介質(zhì)吸附，從而造成酶活力損失。酶蛋口的分了量越大，截流損失越 多。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，纖維素酶的截留損失在10%、15%,木聚糖酶的活力損失小一些， 不超過(guò)10%,考慮到離心比較方便

17、，不會(huì)對(duì)主產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)多大設(shè)備投資，所以， 建議采用低速離心獲得上清酶液。1. 11驗(yàn)證對(duì)比對(duì)于飼料用木聚糖酶活力的分析測(cè)定，筆者建議以sigma x0627為標(biāo)準(zhǔn)底物, 反應(yīng)液屮底物的濃度為5 mg/ml,配制的木聚糖底物溶液的存放時(shí)間不超過(guò)12 h（4 °c存放），反應(yīng)體系的ph值為5.5,反應(yīng)溫度為37 °c,反應(yīng)體系的緩沖液 （hac-naac體系）鹽濃度為0. 1 mol/1,反應(yīng)時(shí)間為30 min。以上述方法為基準(zhǔn)，試驗(yàn)測(cè)定分析了近300個(gè)含有木聚糖酶的樣品，現(xiàn)列 舉12個(gè)比較有代表性分析結(jié)果（見(jiàn)表4,保留4位有效數(shù)字），相對(duì)課弟均不超 過(guò) 6. 0%o2結(jié)論綜合

18、上述分析結(jié)果，除了 ph值和溫度以外，底物的性質(zhì)和濃度、酶分子濃 度、反應(yīng)時(shí)間、溶液的離子強(qiáng)度和體系的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)都能影響酶的測(cè)定活力。由于 這些影響因素的存在，使得酶活力的測(cè)定分析變得紛繁復(fù)雜，同一種酶在不同的 條件下分析獲得的結(jié)果存在很大偏差。為了測(cè)定的統(tǒng)一，同時(shí)使結(jié)果有較好的可比性，建議固定反應(yīng)體系（即固定 反應(yīng)溫度、ph值、反應(yīng)吋間、底物濃度和要求的產(chǎn)物濃度范圍）。樣品嗨做不同 的稀釋度，只冇在規(guī)定條件下產(chǎn)生所耍求的產(chǎn)物濃度范圍的稀釋酶液才是冇效的 作用酶液，然后，以此為依據(jù)計(jì)算酶活力。這種方法雖然比較繁瑣，但是它排除 了許多干擾，有較好的可比性。參考文獻(xiàn)1 陸文清，劉偉，劉興海，等幾種常見(jiàn)飼用酶制劑的活測(cè)定與分析j飼 料工業(yè)，2000(2) : 17-20.2 陸文清，李徳發(fā)，武玉波液態(tài)發(fā)酵飼用酶制劑的研究與生產(chǎn)j飼料研 究，2000(1) : 24-26.3 張