細胞培養(yǎng)與病毒培養(yǎng)實驗步驟

1、實驗二傳代細胞培養(yǎng)及病毒在傳代細胞中的培養(yǎng)一、實驗?zāi)康牧私獾怪蔑@微鏡的構(gòu)造及使用，了解不同傳代細胞的形態(tài)及接毒后的 病變特征，掌握細胞的傳代培養(yǎng)方法、病毒接種方法及收毒方法。二、常用細胞的種類BHK-21：倉鼠腎傳代細胞PK-15：豬腎傳代細胞IBRS-2：豬腎傳代細胞Hela：人的子宮瘤細胞Vero：非洲綠猴腎細胞Marc-145：來源于Vero細胞TK-143：人的胸背激酶陰性細胞Sf9：昆蟲細胞三、材料1、100ml細胞瓶、吸管、吸球、96孔細胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭2、BHK-21 (baby hamster kidney)細胞3、0.25%胰酶 4、生長液：含10與犢牛血清、200U/

2、ml青、鏈霉素的DMEM維持液：含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM5、偽狂犬病病毒液（PRV）四、傳代細胞培養(yǎng)的條件要求1）細胞密度：2-3X105個/ml2） pH 范圍 最適 PH7. 0-7. 4,耐受 PH6. 6-7. 83）培養(yǎng)溫度哺乳動物細胞一般為37昆蟲細胞28-30五、常用細胞分散劑及作用原理1、胰酶 使精氨酸或賴氨酸的廢基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā) 生水解，導致細胞間質(zhì)水解而使細胞或組織塊消化為分散的單個細胞。2、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）：及二價鈣、鎂離子結(jié)合，從而使細胞分 散。3、灰色鏈絲菌酶：由灰色鏈絲菌提取的一種酶制劑，是蛋白酶、氨肽酶

3、和峻肽酶的混合物。六、營養(yǎng)液1、人工綜合營養(yǎng)液氨基酸、糖類、無機鹽類、維生素、輔酶、喋吟、喀咤、輔助生長因子。2、血清1）血清的種類胎牛血清、新生犢牛血清、成年牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、 羊血清、人血清，其中以新生犢牛血清使用最為廣泛。2）血清的處理無菌采集，過濾除菌。用前56c滅活30min。3）血清的作用A、能提供細胞生存、生長和增生所必須的生長調(diào)節(jié)因子。B、能補充基礎(chǔ)培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。C、含有一些可供貼壁依賴型細胞在培養(yǎng)器皿表面貼附和鋪展的生長基質(zhì) 成分。D、有中和毒性物質(zhì)保護細胞不受傷害的作用。E、給培養(yǎng)液提供良好的緩沖系統(tǒng)。F、提供蛋白酶抑制劑，保護細胞免受細胞釋

4、放的蛋白酶的損害。4）應(yīng)用血清存在的問題A、血清中存在不少有害于細胞生長和繁殖的物質(zhì)：補體、免疫球蛋白、 生長抑制因子。B、血清的成分不明確，影響對結(jié)果的分析。C、不同動物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn) 定。七、傳代細胞系培養(yǎng)1、優(yōu)點：1）可以無限的傳代。2）不少細胞系對病毒很敏感。3）某些傳代細胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的 大量生產(chǎn)。4）生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。2、缺點：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。3、培養(yǎng)方法1）取長滿單層的細胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。2）加入2ml胰酶消化液，于37c培養(yǎng)箱放置兒分鐘，至細胞間出現(xiàn)空隙 或細胞變圓后，倒去

5、消化液。3）加入生長液，反復吹打兒次，使細胞分散成單個細胞，然后分裝于3個 小瓶中。再在每個小瓶中補充生長液至10ml,然后置37c培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 培養(yǎng)1-2天即可長成單層。八、病毒（PRV）在傳代細胞中的培養(yǎng)1、選長滿單層的細胞，倒掉培養(yǎng)液。2、加入適量的病毒懸液3、置溫箱中感作（吸附）45min-lho4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培養(yǎng)液，補足維持液，置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)， 直至80%以上的細胞病變。5、收毒：將病變的細胞置于-20冰箱中，凍結(jié)后取出自然解凍，在解凍 過程中振搖兒次，以使細胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水 瓶或其它容器中。低溫貯藏備用。實驗三、原代細胞培養(yǎng)（以雞胚成纖維細胞

6、為例）一、實驗?zāi)康牧私獠煌毎男螒B(tài)，掌握雞胚成纖維細胞的制備及培養(yǎng)方法。二、材料1、9-11日齡雞胚2、照蛋燈及蛋座3、碘酊棉球及酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小鑲子5、平皿、細菌瓶、吸管、吸球、細胞瓶、6、胰酶、生長液、維持液三、細胞培養(yǎng)的條件要求1）細胞密度原代細胞：4-6X105個/ml傳代細胞：2-3義1。5個/ml2） pH 范圍 最適 PH7. 0-7. 4,耐受 pH6. 6-7. 83）培養(yǎng)溫度哺乳動物細胞一般為37昆蟲細胞28-30 四、操作步驟1、取9T2 口齡孵育良好的雞胚，依次用碘酊和酒精消毒氣室部。2、無菌操作下用剪子去除氣室部卵殼，去除殼膜，穿破絨毛尿囊膜，夾

7、住雞胚頸部，取出雞胚放于滅菌平皿中。3、用眼科剪、鑲?cè)コu胚頭、四肢及內(nèi)臟，用DMEM沖冼2次。4、將沖洗后的雞胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜狀。5、將剪碎的組織塊倒入錐形瓶或燒杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分沖洗, 并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加DMEM。如此反復 沖洗2-3遍。6、于沉淀組織塊內(nèi)加入約4倍量的0.25%胰酶，并調(diào)pH至7. 6-7. 8,振 蕩混勻后置37水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動一次，使細 胞消化完全（組織塊變散松，沉降漸變緩慢時即表示消化足夠）。7、取出，靜置兒分鐘，小心吸棄上層胰酶溶液，用DMEM輕洗2次后，加 入生長液5ml,用大口徑吸管

8、反復吹打，使細胞游離。8、靜置兒分鐘，使未消化好的組織塊下沉。9、細胞計數(shù)取細胞懸液0.5ml+2ml0. 1%結(jié)晶紫一枸椽酸（0. Imol/L）溶液,室溫 或37c溫箱中5Tomin,充分振蕩后進行計數(shù)。按白細胞計數(shù)法計算4角4個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)（N）。每ml懸液中的細胞數(shù)（n） =N/4X 10000XK （稀釋倍數(shù)）。活細胞數(shù)應(yīng)在90%以上。10、將計數(shù)好的細胞稀釋到合適的濃度，使細胞量約為4-6X10$個/ml, 分層于細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶1ml,再補加DMEM生長液至10ml,蓋上 蓋子，置于37c恒溫箱中培養(yǎng)。表示可計數(shù)表示不計數(shù)15 / 18五、結(jié)果的觀察于培養(yǎng)后每天觀察結(jié)果，

9、至長層單層。細胞量較大時，一天即可長成 單層，細胞呈纖維狀。實驗四病毒感染力的滴定(TCIDw的測定)一、實驗?zāi)康牧私獠《靖腥玖y定的幾種常用方法，掌握半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量TCID5。的操作步驟、計算方法及含義。二、測定病毒感染力的方法半數(shù)致死量LD5o( 50% lethal dose)：用動物或雞胚來檢測半數(shù)雞胚感染量EIDso(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量 TCIDso (50% tissue culture infective dose)： 用細胞來檢測蝕斑形成單位(plaque forming unit, PFU)：用細胞來檢測 三

10、、材料1、長滿單層的細胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液(PRV)四、TCID”的操作步驟1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔,每孔接種100小3、在每孔加入細胞懸液100同，使細胞量達到23X IO,個/ml。4、設(shè)正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。(100M生長液+100M細胞懸液)5、逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。6、結(jié)果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法五、TCID5。的計算方法CPE：細胞病變效應(yīng)1、Reed-Muen

11、ch 兩氏法病毒液稀釋 度出現(xiàn)CPE 孔數(shù)無CPE孔 數(shù)累計出現(xiàn)CPE孔 所占的外CPE孔數(shù)無CPE孔 數(shù)10-180270100 (27/27)10-28 -0190100 (19/19)10-37111191.6 (11/12)ICT354640 (4/10)ICT171130.7 (1/14)1040S0210 (0/21)CPE： Cytopathic effect距離比例=(高于50%病變率的百分數(shù)-50%) / (高于50%病變率的百分數(shù)-低于50%病變率的百分數(shù))=(91. 6-50) / (91.6-40)= 0.8IgTCIDs產(chǎn)距離比例X稀釋度對數(shù)之間的差+高于50與病變率

12、的稀釋度的對 數(shù)=0. 8X (-1) + (-3)=-3.8TCID5o=1O-3 70. 1ml含義：將該病毒稀釋1()3 8接種100M可使50%的細胞發(fā)生病變。2、 Karber 法病毒液稀釋出現(xiàn)CPE的孔出現(xiàn)CPE孔的比度數(shù)率10"88/8=110-288/8=110-377/8=0. 87510"33/8=0. 37510-511/8=0. 12510-600/8=0lgTCID5o=L-d(s-0. 5)L：最高稀釋度的對數(shù)D：稀釋度對數(shù)之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID5o=-l-lX (3. 375-0. 5)=-3. 875TCID50=10-3 8

13、75/0. 1ml含義：將該病毒稀釋1()3 *5接種100同可使50%的細胞發(fā)生病變。實驗五血清中和試驗一、實驗?zāi)康牧私庵泻驮囼灥幕驹砗蛢悍N不同的測定方法，掌握固定病毒一稀 釋血清法的操作步驟和計算方法及含義。二、原理抗體及相應(yīng)的病毒粒子特異性地結(jié)合，使病毒的感染力喪失。三、用途1、疾病診斷2、病毒分離株的鑒定3、不同病毒株的抗原關(guān)系研究4、疫苗免疫原性的評價5、免疫血清的質(zhì)量評價6、測定實驗動物血清中是否存在抗體四、分類 （一）蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗將病毒一正常血清混合物以及病毒一待檢血清混合物分別接種到單 層細胞上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲基纖維素，進行蝕斑測定，比較病毒一 正常血清組和病

14、毒一待檢血清組產(chǎn)生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清 的中和能力。以試驗組的蝕斑數(shù)比對照組減少50%作為判定依據(jù)，血清稀釋度就是 其蝕斑減數(shù)試驗效價。（二）交叉保護試驗先將實驗動物進行主動免疫或被動免疫，然后以待檢病毒進行攻擊， 根據(jù)實驗動物被保護的情況，判定待檢V的種類或型別。這一方法的缺點 是試驗周期太長，并且需要大量的實驗動物。可用于以下幾方面：應(yīng)用已 知V鑒定未知V ；應(yīng)用已知免疫血清鑒定未知V：應(yīng)用已知V鑒定未知血 清。（三）終點法中和試驗1、固定病毒一稀釋血清法將不同稀釋度的血清及固定量的病毒液（一般為100或200個TCID50. EID”或LDG混合，置適當?shù)臈l件下感作一定時間，

15、再將血清-病毒混合物接種于敏感細胞、雞胚或?qū)嶒瀯游?，測定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細胞、雞 胚或?qū)嶒瀯游锇l(fā)生病毒感染的能力及其效價。以能保護50%組織培養(yǎng)細胞、雞胚或?qū)嶒瀯游锊话l(fā)生病變、感染或死 亡的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的50%中和效價（PDG。2、固定血清稀釋病毒法在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對照非免疫血清 （對照組）和待檢血清同時進行測定，計算每一組的TCIDw、EID必或LDm, 然后計算中和指數(shù)。五、材料1、長滿單層的細胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）6、待檢血清、PRV陽性對照血清、PRV陰性對照血清六、操

16、作步驟 1、固定病毒一稀釋血清法1）測定病毒液的TCID% 2）將測好TCID5。的病毒液稀釋成200個TCID5。的病毒懸液。3）在96孔微量培養(yǎng)板中將血清（預先56滅活30min）作連續(xù)倍比稀釋 （具體方法是在96孔板中先加入50Al生長液，再加5014待檢血清，混勻后，吸50耳至下一孔，如此下去。一直到1： 256）,每個稀釋度 作4孔。4）在上述各孔內(nèi)加入50目稀釋好的病毒液，混勻后放入37 5就0二培養(yǎng) 箱中作用45min-60mino5）同時設(shè)待檢血清毒性對照，陰、陽性血清對照，病毒對照和正常細胞 對照，其中病毒對照要作200個TCIDso、20個TCID50、2個TCID”、0.

17、2 個TCID50 4個不同濃度的對照。6）感作完成后每孔加入100閔細胞懸液，放37c 5%C0二培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐 口觀察并記錄結(jié)果，一般要觀察5-7天。7）結(jié)果計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進行。累計血清稀釋度CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)保護率%1 ： 2 (1O-0 3)04015100 (15/15)1 ： 4 (10一° 6)04011100 (11/11)1 ： 8 (W0 9 )131787.5 (7/8)1 ： 16 (1()72)132466. 7 (4/6)1 ： 32 (10-15)315116. 7 (1/6 )1 : 64

18、 (10-l s)40900 (0/9)1 ： 128 (10-21)401300 (0/13)1 ： 256 (IO"')401700 (0/17)lgPD50=高于50%的保護率的血清稀釋度的對數(shù)+距離比例X稀釋度對數(shù)的差=-1.2+033X(-03)=-1.299距離比例=（高于50%的保護率-50% ） /（高于50%的保護率一低于50%的保護率） =（66.7-50） / （66.7-16.7） 一八 QQDncn-_i odd 口片涮了一八 nc-1 /on即1 ： 20稀釋的待檢血清可保護50生的組織培養(yǎng)細胞免于出現(xiàn)CPE。2、固定血清一一稀釋病毒法1）將病毒作連續(xù)10倍稀釋2）將稀釋好的病毒接種96孔板，每個稀釋度接種一縱排