黃曲霉毒素的檢測及防控

1、Analysis and Control of Aflatoxinsl黃曲霉毒素的概述l黃曲霉毒素的國際限量要求l黃曲霉毒素的檢測l黃曲霉毒素污染的預防和控制l山東局技術中心黃曲霉毒素實驗室l輸歐花生黃曲霉毒素實驗室檢測l黃曲霉毒素的研究歷史l黃曲霉毒素的毒理作用l黃曲霉毒素的產(chǎn)生l黃曲霉毒素的分布l黃曲霉毒素的化學性質(zhì)l1960年, 英國10萬只火雞死亡事件揭開了人們對于黃曲霉毒素的認識與研究。l火雞的死亡與飼料中含有較高濃度的黃曲霉毒素有關。l用這種飼料（花生粉）對動物進行急性毒理實驗后，證明具有強毒性。對大白鼠進行長期的慢性中毒實驗后，成功地誘發(fā)了肝癌。l對毒飼料進行提取，得到了黃曲霉毒

2、素。l在隨后的幾十年中，黃曲霉毒素得到了科學界的高度重視。 黃曲霉毒素是潛在的肝臟毒素。當大劑量攝入這些毒素時可能是致命的。亞致死劑量會導致慢性中毒，而低劑量的長期接觸則會致癌，特別是導致肝癌。通常，動物幼仔比成年動物更加容易遭受黃曲霉毒素的毒害。 黃曲霉毒素引起了人們對健康最強烈的關注，是因為其廣泛分布于一些食物諸如花生、堅果、牛奶、玉米中，同時也是人類潛在的致癌原。l黃曲霉毒素主要由黃曲霉和寄生曲霉等在代謝過程中產(chǎn)生。l黃曲霉毒素產(chǎn)生的條件：菌株的產(chǎn)毒能力、適宜的濕度（80%-90%相對濕度和基質(zhì)的含水量）、溫度（24-30度）、氧氣（1%以上）、培養(yǎng)時間、機械損傷、昆蟲損害等。l黃曲霉毒

3、素B1、B2、G1、G2大多分布在農(nóng)產(chǎn)品中，常見的有花生、玉米、棉籽、芝麻、杏仁、辣椒等。l黃曲霉毒素M1分布在牛奶及奶制品中。l在哺乳動物的肝臟與尿中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素P1和Q1。l黃曲霉毒素是結(jié)果相近的一群衍生物。化學結(jié)構(gòu)式為二呋喃環(huán)和香豆素。在紫外線下，黃曲霉毒素B1、B2發(fā)蘭色熒光，黃曲霉毒素G1、G2發(fā)綠色熒光。l黃曲霉毒素的分解溫度為237-299度，一般加熱不能破壞其毒性。l在有氧條件下，紫外線照射可去毒。l難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，在強堿溶液下易分解黃曲霉黃曲霉毒素毒素 B B1 1同肝細胞同肝細胞

4、DNADNA的鳥嘌的鳥嘌呤堿基結(jié)合，使得控制細胞呤堿基結(jié)合，使得控制細胞生長的基因代碼發(fā)生錯誤，從而使生長的基因代碼發(fā)生錯誤，從而使細胞生長失控，成為癌性腫瘤細胞生長失控，成為癌性腫瘤?；ㄉ?未加工): 黃曲霉毒素總量 15ppb牛奶: 黃曲霉毒素M1 0.5ppb黃曲霉毒素B1/總量花生、堅果、干果： 2/4ppb花生（進一步挑選等）：8/15ppb堅果、干果（進一步挑選）：5/10ppb谷物及加工產(chǎn)品：2/4ppb各種調(diào)味品：5/10ppbl黃曲霉毒素總量：花生：15ppbl所有食品： 黃曲霉毒素總量 20ppbl玉米、花生、花生油、堅果等 B1不得超過20ppb。l大米、其他食用油等B1

5、不得超過10ppb。l其它糧食（麥類、面粉、薯干）、發(fā)酵食品（醬油、醋等）、淀粉類制品（糕點、餅干、面包等） B1不得超過5ppb。l牛奶及其制品中M1不得超過0.5ppb。 黃曲霉毒素的檢測，從廣義上，包括：采樣、制樣和檢測三個過程。l黃曲霉毒素的檢測一直是困擾世界各國的難題。原因：不均勻分布；ppb水平采采 樣樣樣品制備樣品制備/ /分樣分樣分析檢測分析檢測目的：得到一個有代表性的樣品困難：1）分布不均勻 2）ppb水平辦法：盡量加大采樣點和采樣量，使貨物的每個部位都有同等的機會被抽到。均勻分布（如蛋白質(zhì)） 不均勻分布（黃曲霉毒素） 所謂“ppb” 1，000，000，000中的1分子 3

6、2年中的1秒 地球至月球總距離中的40cm 22公斤沙子中的1粒 3.5車廂中的1粒玉米 集裝箱樣品小樣檢測100%總誤差88%采樣誤差10%制樣誤差2%檢測誤差Whitaker Dicken，1974針對卡車或拖車裝載玉米的取樣方式針對卡車或拖車裝載玉米的取樣方式:第一次取樣的位點標記為第一次取樣的位點標記為 “O”. 如果需要更多的樣品，應在標記為如果需要更多的樣品，應在標記為 “X”的位點再次取樣的位點再次取樣從卡車中的取樣量從卡車中的取樣量由于分布不均勻由于分布不均勻可能檢測到的結(jié)果范圍可能檢測到的結(jié)果范圍4.50 kg2.25 kg1.00 kg0.45 kg11.6 - 28.4

7、ppb 8.1 - 31.9 ppb 3.2 - 38.8 ppb 0 - 46.9 ppb* 95% confidence range一卡車玉米中有一卡車玉米中有20ppb黃曲霉毒素的污染黃曲霉毒素的污染目的：將樣品充分粉碎、均質(zhì)化，為下一步檢測做準備辦法：使用高效粉碎機，粉碎最終直徑小于2mm制樣誤差約占總誤差的10%提取extraction凈化purification分析analysis分析程序 - 提取 使用甲醇使用甲醇/ /水或乙腈水或乙腈/ /水混合液萃取研磨樣品水混合液萃取研磨樣品使用攪拌機使用攪拌機(2-5 Minutes)(2-5 Minutes)或震蕩儀或震蕩儀(30-18

8、0 Minutes)(30-180 Minutes)震蕩萃取液震蕩萃取液. .樣品液數(shù)量與溶劑數(shù)量存在最樣品液數(shù)量與溶劑數(shù)量存在最 佳比例。佳比例。注意所使用的有毒溶劑對健康注意所使用的有毒溶劑對健康的損害及污染的損害及污染l凈化是指去除提取液中的雜質(zhì)（如脂肪、蛋白質(zhì)、色素等），以避免對黃曲霉毒素的檢測造成干擾。免疫親和柱 (IAC)凈化固相萃取柱（SPE）凈化液-液萃取其他快速篩選法： 熒光光度計法 ELISA法確證方法： HPLC-FLD法l原理：紫外線照射后，黃曲霉毒素能發(fā)射特征熒光l優(yōu)點：l1、操作簡便、安全l2、檢測限小于2ppbl缺點：有假陽性的存在l原理：利用抗原抗體反應并由酶催

9、化底物產(chǎn)生顏色進行定量的分析方法l優(yōu)點：l1、操作簡便、成本較低 2、有些商品化的試劑盒檢測限能達到1ppb 缺點：有假陽性的存在l經(jīng)過篩選方法檢測的樣品，可以繼續(xù)通過基準方法進一步確證黃曲霉毒素的存在，并進行更加準確的定量檢測。min01234567LU 323436384042444648 FLD1 A, Ex=365, Em=440 (ROME3.12SAMPLE11.D) AFTG2 AFTG1 AFTB2 AFTB1l預防 preventionl采樣 sampling l樣品制備 sample preparationl樣品提取 extractionl測試需求評價 evaluation

10、 of testing requirementsl檢測 testingl結(jié)果確證 result validationl文本化 documentationl供貨方介入 supplier involvementl去毒 removal 1. A professional Mycotoxin laboratory. 一個專業(yè)化的官方實驗室一個專業(yè)化的官方實驗室 2. A long history to detect Aflatoxin. 檢測黃曲霉毒素歷史悠久檢測黃曲霉毒素歷史悠久& Introduction1.Use biology method since 1970s.2.Use TLC

11、method since 1980s.3.Use HPLC method since 1990sHPLC-MS/MSCerealsMulti-mycotoxinBio-method / ELISASea foodsDSP/PSPHPLC-FLD/ELISACerealsT-2 toxinHPLC-FLDCorn, cerealsZearalenoneHPLC-UVCereals DeoxynivalenolHPLC-UVApple juicePatulinHPLC-FLDMilk, milk powderAflatoxin M1IAC/PCD/HPLC-FLDPeanut, corn, cer

12、ealsAflatoxinMethodCommodity Parameter & 生物毒素檢測業(yè)務生物毒素檢測業(yè)務STCIQ is accredited by China national accreditation service for Conformity Assessment (CNAS) and operated in accordance with ISO/IEC 17025:2005 (E) General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.時間Date輪次號FA

13、PAS Series and RoundAFB1 z-scoreTotal AF z-score2001.11Series 4 Round 39-0.5-0.22002.10Series 4 Round 470.70.72003.7Series 4 Round 56-0.7-0.52004.9Series 4 Round 67-0.4-0.42005.8FAPAS 04790.80.92006.4FAPAS 04880.80.8l時間時間 : 2002年年lAnalyse: 花生醬中的黃花生醬中的黃曲霉毒素曲霉毒素l組織者組織者: CCIBLAC l輪次輪次 : 國認實函國認實函200117號

14、號l參加實驗室數(shù)參加實驗室數(shù) : 63 l時間時間 : 2005lAnalyse: 花生醬中的黃花生醬中的黃曲霉毒素曲霉毒素l組織者組織者: 國家食品安全國家食品安全局局lRound: 質(zhì)檢食函質(zhì)檢食函2005082號號l參加實驗室數(shù)參加實驗室數(shù) : 15 l日期日期: 2005lAnalyse: Aflatoxin Analysis in Peanut pastel組織者組織者: 山東局山東局lRound: 魯檢便食字第魯檢便食字第077號號lAttended Laboratory Number : 52lDate: 2006(on going)lAnalyse: Aflatoxin Ana

15、lysis in Peanut pastelSponsor: CNASlRound: CANS T0339lAttended Laboratory Number : 74lDate: 2006lAnalyse: Aflatoxin Analysis in Peanut pastelSponsor: 山東局山東局lRound:lAttended Laboratory Number : 89l 接樣接樣 Sample receive l 樣品登記樣品登記 Sample registerl 樣品制備樣品制備 Sample preparationl 凈化凈化 Sample clean upl 測定測定

16、 Sample HPLC determinationl 報告報告 Reportl 留樣、記錄留樣、記錄 Reserve samples and recordsIs it sealed ?Is it clearly labelled ?Is it weigh about 30kg ?Sample receive (2)樣品登記樣品登記Samples must be Thoroughly mixed before divided into three Sub-samples1、樣品制備過程： 定期進行樣品均勻性核查2、實驗室檢測過程： 日常檢測采用加標回收和質(zhì)控樣品 加標回收 質(zhì)控樣品3、每年參加

17、國際間實驗室能力驗證活動1、 方法的檢出限（方法的檢出限（LOD）2、方法的檢測限（、方法的檢測限（LOQ）3、 回收率（回收率（Recovery）4、 不確定度（不確定度（ Uncertainty）l針對GB/T 18979-2003方法l檢出限是0.3ppb，檢測限是1.0ppb 報告的三種情況： 未檢出： 低于檢出限 1.0 ppb ：檢出了，但不能準確定量 實際值： 能準確定量 l檢測結(jié)果與真實值Recovery（100%）= 檢測結(jié)果 / 真實值如何得到真實值？1）購買有證樣品（質(zhì)控樣品）2）空白添加已知濃度的標樣 （質(zhì)控樣品）將待測樣品與質(zhì)控樣品同批檢測，計算回收率。l樣品1與質(zhì)控樣品（樣品A）同批檢測，樣品A的實際值為2.0ppb。l結(jié)果：樣品1的檢