時間分辨免疫熒光技術-李超

1、時間分辨免疫熒光技術時間分辨免疫熒光技術演講人：李超2015年2月3日國家精品課程網上資源的可用性研究/*主要內容主要內容n目前有哪些標記免疫學分析方法？目前有哪些標記免疫學分析方法？n什么是免疫熒光技術？什么是免疫熒光技術？n什么是時間分辨免疫熒光技術？什么是時間分辨免疫熒光技術？n時間分辨免疫熒光技術的優(yōu)勢是什么時間分辨免疫熒光技術的優(yōu)勢是什么？n時間分辨免疫熒光技術可應用于哪些方面？時間分辨免疫熒光技術可應用于哪些方面？國家精品課程網上資源的可用性研究/*目前有哪些標記免疫學分析方法？目前有哪些標記免疫學分析方法？n 免疫熒光分析免疫熒光分析( (Coons, 1941Coons, 19

2、41) )n 放射免疫分析放射免疫分析( (BersonBerson和和Yalow, 1960)Yalow, 1960)n 酶聯免疫分析酶聯免疫分析 ( (EngvallEngvall, 1971), 1971)n 膠體金標記免疫分析膠體金標記免疫分析(Faulk(Faulk和和Taylor, 1971)Taylor, 1971)n 化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析(Arakawa(Arakawa， 1977)1977)n 時間分辨熒光免疫分析時間分辨熒光免疫分析( (SoiniSoini和和HemmilaHemmila，1979)1979)n 電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫分析(Lelan

3、d, 1990)(Leland, 1990)n 生物芯片生物芯片( (美國美國LuminexLuminex公司公司, 1997), 1997)國家精品課程網上資源的可用性研究/*什么是免疫熒光技術？什么是免疫熒光技術？ 基本原理：基本原理：u免疫熒光技術是將免疫熒光技術是將免疫學方法免疫學方法(抗原抗體特異結合抗原抗體特異結合)與與熒光標記熒光標記技術技術結合起來研究結合起來研究特異蛋白抗原在細胞內分布特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。的方法。u以以熒光素熒光素作為標記物，與已知的抗體或抗原結合、但不影響其作為標記物，與已知的抗體或抗原結合、但不影響其免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試

4、劑，免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢用于檢測和鑒定未知的抗原測和鑒定未知的抗原。u在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現特異性熒光的抗原抗體復在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現特異性熒光的抗原抗體復合物及其存在的部位。合物及其存在的部位。國家精品課程網上資源的可用性研究/*什么是時間分辨免疫熒光技術？什么是時間分辨免疫熒光技術？概念：概念： 時間分辨免疫熒光技術時間分辨免疫熒光技術指利用具有雙功能基團結構的螯合劑，將鑭系元素標記到抗體（或抗原）上，經免疫反應形成復合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故分離除去未結合的成分后，利用時間分辨熒光儀即可測定熒光強度，從而推測待測物含量。國家精

5、品課程網上資源的可用性研究/*什么是時間分辨免疫熒光技術？什么是時間分辨免疫熒光技術？基本原理：基本原理：u用用三價稀土離子三價稀土離子及其及其螯合物螯合物作為示蹤物，代替熒光物質、同位素、作為示蹤物，代替熒光物質、同位素、酶和化學發(fā)光物質，標記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質；酶和化學發(fā)光物質，標記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質；u當免疫反應發(fā)生后，根據稀土離子螯合物的熒光光譜的特點當免疫反應發(fā)生后，根據稀土離子螯合物的熒光光譜的特點 （特特異性強、熒光光譜的異性強、熒光光譜的Stokes位移、壽命長位移、壽命長），用時間分辨熒光分），用時間分辨熒光分析儀，測定免疫反應最后產物的析儀，測定

6、免疫反應最后產物的熒光強度熒光強度；u根據根據熒光強度熒光強度和和相對熒光強度相對熒光強度比值，判斷反應體系中分析物的濃比值，判斷反應體系中分析物的濃度，達到定量分析的目的度，達到定量分析的目的國家精品課程網上資源的可用性研究/*什么是時間分辨免疫熒光技術？什么是時間分辨免疫熒光技術？例如：例如：u三價稀土離子包括有銪三價稀土離子包括有銪(Eu)，釤（，釤（Sm)，鋱，鋱 (Tb) ，鏑，鏑 (Dy)等，它們的熒光等，它們的熒光光譜具有特異性強光譜具有特異性強 Stokes位移大位移大壽命長的特點；壽命長的特點；u采用采用異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸銪異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸銪(DTT

7、A-Eu)為雙功能螯合試劑，其為雙功能螯合試劑，其一端螯合一端螯合Eu3+，另一端可與蛋白質的，另一端可與蛋白質的-NH2 連接；連接；u在中性或接近中性在中性或接近中性pH 條件下，條件下，DTTA 與與Eu3+具有足夠的螯合穩(wěn)定性，而在具有足夠的螯合穩(wěn)定性，而在增強液增強液（呈酸性）作用下，（呈酸性）作用下，DTTA-Eu 又能將螯合的又能將螯合的Eu3+迅速、徹底地釋放迅速、徹底地釋放出來并與增強液中的配體螯合出來并與增強液中的配體螯合進入膠束的疏水內核，使進入膠束的疏水內核，使Eu3+熒光得以成千熒光得以成千萬倍地放大。萬倍地放大。國家精品課程網上資源的可用性研究/*通過時間延遲，將特

8、異性熒光通過時間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來與非特異性熒光分辨開來國家精品課程網上資源的可用性研究/*時間分辨免疫熒光技術的優(yōu)勢是什么？時間分辨免疫熒光技術的優(yōu)勢是什么？精確度上的優(yōu)勢精確度上的優(yōu)勢: 放射免疫 （精度：10-12mol/L） 酶聯免疫（精度：10-9 mol/L） 膠體金標記 （精度：10-15mol/L） 化學發(fā)光（精度：10-15mol/L） 電化學發(fā)光 （精度：10-17mol/L） 時間分辨熒光（精度：10-18mol/L） 生物芯片 （精度：10-18mol/L）國家精品課程網上資源的可用性研究/*技術上的先進性技術上的先進性特點特點特異性熒光與非特異性

9、熒光分離度高時間、光譜分辨時間、光譜分辨發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離度高零背景、高特異性解離、增強解離、增強熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍更寬重復性更好標記位點標記位點標記位點多對標記物結構及活性影響小無衰變受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性，高精確度試劑保存時間長標準曲線保留時間長標記方法標記方法單、雙標記多標記同一試劑盒可同時測多個項目國家精品課程網上資源的可用性研究/*時間分辨免疫熒光分析相較于化學發(fā)光的優(yōu)勢時間分辨免疫熒光分析相較于化學發(fā)光的優(yōu)勢發(fā)光效率重復檢測本底噪聲靈敏級數 標記物標記位點標準曲線多標記科研開發(fā)時間分辨熒光時間分辨熒光化學發(fā)光化學發(fā)光95%可無數次零本底10-18原子可達20個

10、/抗體穩(wěn)定達一年以上最多可達四標記有1%不可重復干擾大10-15大分子化合物1個/抗體穩(wěn)定 2 到 4周無無國家精品課程網上資源的可用性研究/*時間分辨熒光和電化學發(fā)光比較的優(yōu)勢時間分辨熒光和電化學發(fā)光比較的優(yōu)勢 標記物 多標記技術 做科研 試劑種類 試劑價格Eu, Sm, Te, Dy有能58種臨床,24種科研低釕無無 28種臨床, 無科研試劑高時間分辨熒光時間分辨熒光電化學發(fā)光電化學發(fā)光國家精品課程網上資源的可用性研究/*時間分辨免疫熒光技術優(yōu)點總結時間分辨免疫熒光技術優(yōu)點總結u零本底、靈敏度高零本底、靈敏度高u線性范圍寬線性范圍寬u試劑有效期長試劑有效期長u標準曲線穩(wěn)定性好標準曲線穩(wěn)定性

11、好u易于自動化易于自動化u對環(huán)境及人體沒有任何影響對環(huán)境及人體沒有任何影響國家精品課程網上資源的可用性研究/*時間分辨免疫熒光技術的應用時間分辨免疫熒光技術的應用內分泌檢測內分泌檢測甲狀腺功能檢測甲狀腺功能檢測糖尿病指標檢測糖尿病指標檢測生長激素檢測生長激素檢測T3、T4、FT3、FT4 、TSH-U、TBG 、Ab 、TPO Ab胰島素、胰島素、C肽肽hGH（生長激素）（生長激素）意義：意義： 甲狀腺疾病也是目前最常見最多發(fā)一種內分泌疾病，以上各項目的聯合檢測，為臨床醫(yī)生對病患者甲狀腺功能的評價提供更基礎、全面的依據 用于區(qū)分胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)

12、和用于胰島素瘤的診斷 對診斷肢端肥大癥是一項特異的方法國家精品課程網上資源的可用性研究/*時間分辨免疫熒光技術的應用時間分辨免疫熒光技術的應用 婦產科檢查： hCG 絨毛膜促性腺激素絨毛膜促性腺激素 LH-Spec 黃體生成素黃體生成素(特異性特異性) FSH 促卵泡激素促卵泡激素 PRL 催乳素催乳素 E2 雌二醇雌二醇 Testo 睪酮睪酮 Prog 孕酮孕酮 SHBG 性激素結合球蛋白性激素結合球蛋白意義：意義： 檢測這些激素的含量對于生殖生檢測這些激素的含量對于生殖生理的研究、疾病的診斷、治療、隨理的研究、疾病的診斷、治療、隨訪及計劃生育工作的開展具有重要訪及計劃生育工作的開展具有重要

13、的意義。的意義。國家精品課程網上資源的可用性研究/* 腫瘤科檢查：腫瘤科檢查： AFP AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 PSA PSA 前列腺特異抗原前列腺特異抗原 B2-M Beta 2B2-M Beta 2微球蛋白微球蛋白 NSE NSE 神經元烯醇化酶神經元烯醇化酶 PAP PAP 前列腺酸性磷酸酶前列腺酸性磷酸酶 CEA CEA 癌胚抗原癌胚抗原 PSA Free/total PSA Free/total 前列腺特異抗原前列腺特異抗原/ /總量總量時間分辨免疫熒光技術的應用時間分辨免疫熒光技術的應用 腫瘤標志物是指示體內腫瘤存在腫瘤標志物是指示體內腫瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物并反映

14、其一定的生物特性的生化物質。通過測定其存在或含量，對于質。通過測定其存在或含量，對于腫瘤可輔助診斷，分析病情，指導腫瘤可輔助診斷，分析病情，指導治療，監(jiān)測復發(fā)或轉移及判斷預后治療，監(jiān)測復發(fā)或轉移及判斷預后等。等。意義：意義：國家精品課程網上資源的可用性研究/*時間分辨免疫熒光技術的應用時間分辨免疫熒光技術的應用遺傳疾病檢查產前篩查產前篩查新生兒篩查新生兒篩查血液疾病檢查貧血檢查貧血檢查白血病分型白血病分型免疫細胞分型免疫細胞分型細胞毒試驗細胞毒試驗傳染病檢查乙肝系列乙肝系列表面抗原表面抗原表面抗體表面抗體e抗原抗原e抗體抗體核心抗體核心抗體意義：意義： 預防患有嚴重遺傳性疾病和先天畸形預防患有嚴重遺傳