紙層析法分離氨基酸

1、紙層析法分離氨基酸紙層析法分離氨基酸 實(shí)驗?zāi)康膶?shí)驗?zāi)康?1、掌握分配層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析、掌握分配層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)法的操作技術(shù) (包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量鑒定及定量)。2、學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分、學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分(水解、層析及水解、層析及鑒定鑒定)分析的方法。分析的方法。實(shí)驗原理實(shí)驗原理 層析法又叫色層分離法、色譜分析法或色譜法。層析法又叫色層分離法、色譜分析法或色譜法。 1944年應(yīng)用濾紙作為固定支持物的年應(yīng)用濾紙作為固定支持物的“紙層析紙層析”誕生以來，層析技誕生以來，層析技術(shù)的發(fā)展越來越快，五十年代開始，

2、相繼出現(xiàn)了氣相色譜和術(shù)的發(fā)展越來越快，五十年代開始，相繼出現(xiàn)了氣相色譜和高壓液相層析，其它如薄層層析、親合層析、凝膠層析等也高壓液相層析，其它如薄層層析、親合層析、凝膠層析等也迅猛發(fā)展。層析分離技術(shù)操作簡便，樣品用量可大可小，既迅猛發(fā)展。層析分離技術(shù)操作簡便，樣品用量可大可小，既可用于實(shí)驗室分離分析，又適用于工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)品的分析制可用于實(shí)驗室分離分析，又適用于工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)品的分析制備?，F(xiàn)已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程等學(xué)科廣泛備?，F(xiàn)已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程等學(xué)科廣泛應(yīng)用而又必不可少的分析工具之一。應(yīng)用而又必不可少的分析工具之一。分配層析分配層析 分配層析法是利用不同的物質(zhì)在兩

3、個互不相溶的溶劑中分配層析法是利用不同的物質(zhì)在兩個互不相溶的溶劑中的分配情況不同而使之得到分離的方法。的分配情況不同而使之得到分離的方法。 分配層析法中不同溶質(zhì)的分離取決于其在兩相分配層析法中不同溶質(zhì)的分離取決于其在兩相 (固定相固定相和流動相和流動相)間分配系數(shù)的不同。間分配系數(shù)的不同。 分配系數(shù)分配系數(shù)(K)的定義是：的定義是： K=溶質(zhì)在固定相的濃度溶質(zhì)在固定相的濃度(CS)/溶質(zhì)在流動相的濃度溶質(zhì)在流動相的濃度(CL)二、紙層析 ( (一一) ) 原理原理 紙上層析實(shí)際上是以濾紙纖維的紙上層析實(shí)際上是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相結(jié)合水為固定相，而以而以有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑( (與水不相混溶或

4、部分混溶與水不相混溶或部分混溶) )作為流動相作為流動相。展開時，有機(jī)溶劑在濾紙上流動，樣品中各物質(zhì)在兩相展開時，有機(jī)溶劑在濾紙上流動，樣品中各物質(zhì)在兩相之間不斷地進(jìn)行分配。由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，之間不斷地進(jìn)行分配。由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速度因此不同，從而達(dá)到分離的目的。移動速度因此不同，從而達(dá)到分離的目的。 溶質(zhì)在濾紙上移動的速率可用溶質(zhì)在濾紙上移動的速率可用R Rf f值值表示：表示： R Rf f= X/ Y= X/ Y式中式中X：溶質(zhì)斑點(diǎn)中心的移動距離溶質(zhì)斑點(diǎn)中心的移動距離 Y Y：溶劑前沿移動的距離溶劑前沿移動的距離 R Rf f值決定于分配系數(shù)。值決定于分配系數(shù)。

5、不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，Rf值也不相同，由值也不相同，由此可以根據(jù)此可以根據(jù)Rf值的大小對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。值的大小對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。 (二二) 影響影響Rf值的主要因素值的主要因素 1.1.物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性 物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性是影響物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性是影響R Rf f值的主要因素。值的主要因素。極性較大極性較大的物質(zhì)，在水中的溶解度較大，的物質(zhì)，在水中的溶解度較大，其其R Rf f值就較小值就較小，反之亦然。，反之亦然。 2.2.濾紙濾紙 不同濾紙的厚薄程度和纖維松緊度各不相同，因此結(jié)合的不同濾紙的厚薄程度和纖維松緊度各不相同，因此結(jié)合的水量水量

6、不一樣，兩相的體積比也就不同。所以同一種物質(zhì)在不同不一樣，兩相的體積比也就不同。所以同一種物質(zhì)在不同型號的濾紙上進(jìn)行層析時，所得到的型號的濾紙上進(jìn)行層析時，所得到的R Rf f值也不相同。值也不相同。 此外，濾紙上所含的此外，濾紙上所含的雜質(zhì)雜質(zhì)也會影響也會影響R Rf f值。值。 3.3.層析所用的溶劑層析所用的溶劑 同一物質(zhì)在不同的溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行層析時，同一物質(zhì)在不同的溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行層析時，R Rf f值不同。所值不同。所以溶劑的配制和使用必須嚴(yán)格，才能使以溶劑的配制和使用必須嚴(yán)格，才能使R Rf f值的重現(xiàn)性好。在好值的重現(xiàn)性好。在好的溶劑系統(tǒng)中被分離物質(zhì)的的溶劑系統(tǒng)中被分離物質(zhì)的R R

7、f f值應(yīng)在值應(yīng)在0.05-0.850.05-0.85之間，樣品中之間，樣品中被分離組分的被分離組分的R Rf f之差最好大于之差最好大于0.050.05。 溶劑系統(tǒng)中的試劑若純度不夠，需經(jīng)過預(yù)處理后才能使溶劑系統(tǒng)中的試劑若純度不夠，需經(jīng)過預(yù)處理后才能使用。處理的方法因溶劑的性質(zhì)而異。常用的處理方法有：酸、用。處理的方法因溶劑的性質(zhì)而異。常用的處理方法有：酸、堿抽提，水洗滌，重蒸餾，脫水干燥等堿抽提，水洗滌，重蒸餾，脫水干燥等4.pH4.pH值值 溶劑和樣品的溶劑和樣品的pHpH值會值會影響物質(zhì)的解離影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使極性和溶解度，使R Rf f值改

8、變。溶劑的酸堿度增大則流動相的值改變。溶劑的酸堿度增大則流動相的含水量增高，使極性物質(zhì)的含水量增高，使極性物質(zhì)的R Rf f值增加；反之則降低。值增加；反之則降低。 為了避免或減少為了避免或減少pHpH值對值對R Rf f值的影響，可將濾紙和溶劑用值的影響，可將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理，使之保持一定的緩沖溶液處理，使之保持一定的pHpH值。值。 5.5.溫度溫度 溫度能溫度能影響物質(zhì)在兩相中的溶解度影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響分配系數(shù)；，即影響分配系數(shù)；也影響濾紙纖維的也影響濾紙纖維的水合作用水合作用，即影響固定相的體積，即影響固定相的體積. .所以溫度所以溫度的改變使的改變使R Rf f

9、值變化很大，為此，層析必須在恒溫條件下進(jìn)行。值變化很大，為此，層析必須在恒溫條件下進(jìn)行。 6.6.展開方式展開方式 同一物質(zhì)在其他層析條件完全相同的情況下，用不同同一物質(zhì)在其他層析條件完全相同的情況下，用不同的展開方式進(jìn)行層析時，所得到的的展開方式進(jìn)行層析時，所得到的R Rf f 值不相同。用值不相同。用下行法下行法展展開時，開時，R Rf f值較大；用值較大；用上行法上行法展開時，展開時，R Rf f值較??；用值較小；用圓形濾紙圓形濾紙層析層析時，由于內(nèi)圈較外圈小，限制了溶劑的流動，時，由于內(nèi)圈較外圈小，限制了溶劑的流動，R Rf f值也較值也較小。小。 7.7.樣品溶液中雜質(zhì)樣品溶液中雜質(zhì)

10、 樣品溶液中存在雜質(zhì)時，有時對樣品溶液中存在雜質(zhì)時，有時對R Rf f值有所影響。例如：值有所影響。例如：氯化鈉的存在會影響氨基酸的氯化鈉的存在會影響氨基酸的R Rf f 值。值。 (三三) 操作方法操作方法 1.1.樣品處理樣品處理 用作紙層析的樣品，應(yīng)盡可能除雜純化。調(diào)節(jié)到一定用作紙層析的樣品，應(yīng)盡可能除雜純化。調(diào)節(jié)到一定的的pHpH值，濃度太低的可用真空濃縮提高濃度，濃度太高則需值，濃度太低的可用真空濃縮提高濃度，濃度太高則需稀釋。稀釋。 2.2.點(diǎn)樣點(diǎn)樣 將濾紙裁成適當(dāng)大小，用將濾紙裁成適當(dāng)大小，用鉛筆鉛筆在距邊線在距邊線2cm2cm左右劃一直左右劃一直線線( (稱為原線稱為原線) )

11、，線上每隔，線上每隔2-3cm2-3cm劃一圓點(diǎn)劃一圓點(diǎn)( (稱為原點(diǎn)稱為原點(diǎn)) )。然后。然后用點(diǎn)樣器用點(diǎn)樣器( (定性分析可用普通毛細(xì)管，定量分析需用微量注定性分析可用普通毛細(xì)管，定量分析需用微量注射器射器) )輕輕點(diǎn)在原點(diǎn)上。樣品點(diǎn)的直徑約輕輕點(diǎn)在原點(diǎn)上。樣品點(diǎn)的直徑約0.3-0.5cm0.3-0.5cm。點(diǎn)樣的。點(diǎn)樣的量應(yīng)根據(jù)紙的長短以及樣品的性質(zhì)來決定，一般每一樣品的量應(yīng)根據(jù)紙的長短以及樣品的性質(zhì)來決定，一般每一樣品的量為量為5-30g5-30g。點(diǎn)樣一般采用少量多次，每點(diǎn)一次必須用冷。點(diǎn)樣一般采用少量多次，每點(diǎn)一次必須用冷風(fēng)吹干，然后再點(diǎn)第二次。每次點(diǎn)樣的位置應(yīng)完全重合，否風(fēng)吹干，

12、然后再點(diǎn)第二次。每次點(diǎn)樣的位置應(yīng)完全重合，否則會出現(xiàn)斑點(diǎn)畸形現(xiàn)象。則會出現(xiàn)斑點(diǎn)畸形現(xiàn)象。 3.3.平衡平衡 點(diǎn)樣以后展開以前先將濾紙與層析缸用配好的溶液點(diǎn)樣以后展開以前先將濾紙與層析缸用配好的溶液系統(tǒng)的蒸汽來飽和，這個過程稱之為系統(tǒng)的蒸汽來飽和，這個過程稱之為“平衡平衡”。若不經(jīng)。若不經(jīng)平衡，濾紙和層析缸未被溶劑蒸汽飽和，在層析過程中，平衡，濾紙和層析缸未被溶劑蒸汽飽和，在層析過程中，濾紙會從溶劑中吸收水分，溶劑也會從濾紙表面揮發(fā)，濾紙會從溶劑中吸收水分，溶劑也會從濾紙表面揮發(fā)，從而改變?nèi)軇┫到y(tǒng)的組成從而改變?nèi)軇┫到y(tǒng)的組成, ,嚴(yán)重影響層析效果。平衡一嚴(yán)重影響層析效果。平衡一般在密閉的層析缸內(nèi)

13、進(jìn)行。般在密閉的層析缸內(nèi)進(jìn)行。 4.4.展開展開 平衡結(jié)束后，將濾紙靠樣品點(diǎn)的一端浸入溶劑中，溶劑液平衡結(jié)束后，將濾紙靠樣品點(diǎn)的一端浸入溶劑中，溶劑液面距原線距離約面距原線距離約1cm1cm，此時即開始展開。當(dāng)溶劑前沿到達(dá)濾紙另，此時即開始展開。當(dāng)溶劑前沿到達(dá)濾紙另一端一端0.5-1cm0.5-1cm處時，展開結(jié)束，取出濾紙，在溶劑前沿處做一標(biāo)處時，展開結(jié)束，取出濾紙，在溶劑前沿處做一標(biāo)記，晾干或用冷風(fēng)吹干。記，晾干或用冷風(fēng)吹干。 按溶劑在濾紙上流動的方向不同，展開有上行、下行和環(huán)按溶劑在濾紙上流動的方向不同，展開有上行、下行和環(huán)行三種方式。行三種方式。 (1) (1) 上行法：將濾紙點(diǎn)樣的一

14、端向下浸入溶劑中，溶劑因上行法：將濾紙點(diǎn)樣的一端向下浸入溶劑中，溶劑因毛細(xì)管引力的作用從下向上流動。毛細(xì)管引力的作用從下向上流動。 上行法操作簡單，重現(xiàn)性好，上行法操作簡單，重現(xiàn)性好，是最常用的展開方法，但展開時間較長。是最常用的展開方法，但展開時間較長。 (2) (2) 下行法：在層析缸上部有一盛展開劑的液槽，將濾紙下行法：在層析缸上部有一盛展開劑的液槽，將濾紙點(diǎn)樣的一端朝上浸入槽中，溶劑主要靠重力作用自上而下流動。點(diǎn)樣的一端朝上浸入槽中，溶劑主要靠重力作用自上而下流動。下行法展開速度快，但下行法展開速度快，但R Rf f值的重現(xiàn)性較差，斑點(diǎn)易擴(kuò)散。值的重現(xiàn)性較差，斑點(diǎn)易擴(kuò)散。 (3) (3

15、) 環(huán)行法：又稱水平法，樣品點(diǎn)于圓形濾紙環(huán)行法：又稱水平法，樣品點(diǎn)于圓形濾紙距圓心距圓心1cm1cm左右的環(huán)形線左右的環(huán)形線( (原線原線) )上。濾紙水平放置，上。濾紙水平放置，溶劑由濾紙條引向圓心，然后不斷向四周水平方向溶劑由濾紙條引向圓心，然后不斷向四周水平方向流動。由于溶劑向圓周方向擴(kuò)散，所以展開的圖譜流動。由于溶劑向圓周方向擴(kuò)散，所以展開的圖譜呈弧形。用環(huán)行法展開時，最好使用無方向性的特呈弧形。用環(huán)行法展開時，最好使用無方向性的特制濾紙。制濾紙。 （4 4）雙向展開法：如果樣品組分較多，用一種）雙向展開法：如果樣品組分較多，用一種溶劑系統(tǒng)（常為酸性）不能將各組分全部分開時，溶劑系統(tǒng)（

16、常為酸性）不能將各組分全部分開時，可將樣品點(diǎn)在方形濾紙的一角，用一種溶劑系統(tǒng)展可將樣品點(diǎn)在方形濾紙的一角，用一種溶劑系統(tǒng)展開后吹干溶劑，將濾紙轉(zhuǎn)動開后吹干溶劑，將濾紙轉(zhuǎn)動9090o o后再用另一種溶劑系后再用另一種溶劑系統(tǒng)（常為堿性）展開，這稱為統(tǒng)（常為堿性）展開，這稱為“雙向展開法雙向展開法”。 5.5.顯色顯色 為了顯示層析斑點(diǎn)位置，可根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)不同，采為了顯示層析斑點(diǎn)位置，可根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)不同，采用顯色劑顯示或紫外光顯示。用顯色劑顯示或紫外光顯示。 (1) (1) 顯色劑顯示：顯色劑顯示： 被分離物質(zhì)與顯色劑生成有顏色的被分離物質(zhì)與顯色劑生成有顏色的化合物，顯示斑點(diǎn)位置。常用噴霧法化

17、合物，顯示斑點(diǎn)位置。常用噴霧法 、浸漬法或涂刷法。、浸漬法或涂刷法。 (2) (2) 紫外光顯示：有些物質(zhì)有紫外光吸收性質(zhì)，如核紫外光顯示：有些物質(zhì)有紫外光吸收性質(zhì)，如核苷酸類物質(zhì)。有些物質(zhì)受紫外光照射會發(fā)出熒光，如維生苷酸類物質(zhì)。有些物質(zhì)受紫外光照射會發(fā)出熒光，如維生素素B B1 1、B B2 2等，所以可在紫外光照射下觀察到被分離物質(zhì)的斑等，所以可在紫外光照射下觀察到被分離物質(zhì)的斑點(diǎn)。點(diǎn)。 6.6.定性分析定性分析 層析后的斑點(diǎn)顯示出來后，計算出各斑點(diǎn)的層析后的斑點(diǎn)顯示出來后，計算出各斑點(diǎn)的R Rf f值，就值，就可以對物質(zhì)進(jìn)行定性?？梢詫ξ镔|(zhì)進(jìn)行定性。 7.7.定量分析定量分析 對被分離

18、的物質(zhì)進(jìn)行定量的方法很多，常用的有：對被分離的物質(zhì)進(jìn)行定量的方法很多，常用的有： (1) (1) 剪洗比色法：將斑點(diǎn)剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摵?，剪洗比色法：將斑點(diǎn)剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摵?，通過分光光度計進(jìn)行比色定量。通過分光光度計進(jìn)行比色定量。 (2) (2) 直接比色法：用特制的分光光度計直接測量濾紙直接比色法：用特制的分光光度計直接測量濾紙上斑點(diǎn)顏色的濃度，畫出曲線，由曲線所包含的面積可求上斑點(diǎn)顏色的濃度，畫出曲線，由曲線所包含的面積可求出待測物的含量。出待測物的含量。 (3) (3) 面積測量法：實(shí)驗證明，圓形或橢圓形斑點(diǎn)的面面積測量法：實(shí)驗證明，圓形或橢圓形斑點(diǎn)的面積與物質(zhì)含量的對數(shù)成正

19、比。所以，可用測量斑點(diǎn)面積的積與物質(zhì)含量的對數(shù)成正比。所以，可用測量斑點(diǎn)面積的方法求得物質(zhì)的含量。方法求得物質(zhì)的含量。 實(shí)驗材料與試劑實(shí)驗材料與試劑 實(shí)驗試劑實(shí)驗試劑1、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL) 五種氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸五種氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸,脯氨酸分別配脯氨酸分別配制成一定濃度的溶液。制成一定濃度的溶液。2、展開劑是：正丁醇：甲酸：水、展開劑是：正丁醇：甲酸：水=15:3:2 (正丁醇：水：乙酸=4：1：1)3、0.2%茚三酮丙酮溶液。茚三酮丙酮溶液。4、氨基酸混合液、氨基酸混合液(每種氨基酸每種氨基酸500mg/mL)。實(shí)驗器材實(shí)驗器材:1、濾紙。、

20、濾紙。 2、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)皿(直徑直徑115mm)。3、電熱鼓風(fēng)干燥箱。、電熱鼓風(fēng)干燥箱。 4、噴霧器及吹風(fēng)機(jī)。、噴霧器及吹風(fēng)機(jī)。5、點(diǎn)樣管及點(diǎn)樣架。、點(diǎn)樣管及點(diǎn)樣架。 6、針、線、尺。、針、線、尺。7、燒杯、燒杯(50mL)。實(shí)驗操作實(shí)驗操作 （一）、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析（一）、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析1、單向上行層析、單向上行層析(1)、氨基酸、氨基酸Rf值的測定值的測定A、濾紙濾紙：選用國產(chǎn)濾紙，：選用國產(chǎn)濾紙，10cm20cm，在距紙邊，在距紙邊2cm處，用鉛筆輕輕劃一條線，于線上每隔處，用鉛筆輕輕劃一條線，于線上每隔2cm處處畫一小圓圈作為點(diǎn)樣處，圈直徑不超過畫一小圓圈作為點(diǎn)樣處，圈直徑不超過

21、0.3cm。B、點(diǎn)樣點(diǎn)樣：點(diǎn)樣要合適，樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長，以致分離不清，：點(diǎn)樣要合適，樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長，以致分離不清，氨基酸的點(diǎn)樣量以每種氨基酸含氨基酸的點(diǎn)樣量以每種氨基酸含 520g為宜，用點(diǎn)樣管為宜，用點(diǎn)樣管(也可用血色也可用血色素管代替素管代替)吸取氨基酸樣品吸取氨基酸樣品10g(1g/L)，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)樣處的中心，這時樣品就自動流出。點(diǎn)樣的擴(kuò)散直徑控制在樣處的中心，這時樣品就自動流出。點(diǎn)樣的擴(kuò)散直徑控制在0.3cm之內(nèi)，之內(nèi)，點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴，為使樣品加速干燥，可點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第

22、二滴，為使樣品加速干燥，可用一加熱裝置用一加熱裝置(如吹風(fēng)機(jī)如吹風(fēng)機(jī))，但要注意溫度不可過高，以免氨基酸破壞，但要注意溫度不可過高，以免氨基酸破壞，特別是谷氨酰胺破壞，影響定量結(jié)果。特別是谷氨酰胺破壞，影響定量結(jié)果。 將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處紙將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處紙的兩邊不要接觸。避免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動特別快而造成的兩邊不要接觸。避免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動特別快而造成溶劑前沿不齊，影響溶劑前沿不齊，影響Rf值。值。C、展層展層：將揉成圓筒狀的濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi)：將揉成圓筒狀的濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi) (注意濾紙不要注意濾紙不要碰皿壁碰皿壁)，當(dāng)溶劑展層至距離紙的上沿約，當(dāng)溶劑展層至距離紙的上