第十章真核生物基因的表達(dá)及其調(diào)控

1、第九章 真核生物基因的表達(dá)及其調(diào)控 真核生物基因的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)遠(yuǎn)比原核生物復(fù)雜。原核生物真核生物操縱元調(diào)控。多樣化調(diào)控，更為復(fù)雜。 基因組小，大腸桿菌：總長4.6106bp, 編碼4288個基因, 每個基因約1100bp。 基因組大，人類基因組全長3109 bp，編碼10萬個基因，其余為重復(fù)序列?；蚍植荚谕蝗旧w上，操縱元控制。 DNA與組蛋白結(jié)合成染色質(zhì)，染色質(zhì)的變化調(diào)控基因表達(dá)；基因分布在不同的染色體上，存在不同染色體間基因的調(diào)控問題。 適應(yīng)外界環(huán)境，操縱元調(diào)控表達(dá)。 基因差別表達(dá)是細(xì)胞分化和功能的核心。轉(zhuǎn)錄和翻譯同時進(jìn)行，大部分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。 轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上均不同，從DN

2、A到蛋白質(zhì)的各層次上都有調(diào)控，但多數(shù)為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控真核生物與原核生物的調(diào)控差異真核生物與原核生物的調(diào)控差異 一、真核基因組的復(fù)雜性 與原核生物比較，真核生物的基因組更為復(fù)雜，可列舉如下:真核基因組比原核基因組大得多，大腸桿菌基因組約4106bp，哺乳類基因組在109bp數(shù)量級，比細(xì)菌大千倍；大腸桿菌約有4000個基因，人則約有10萬個基因。 真核生物主要的遺傳物質(zhì)與組蛋白等構(gòu)成染色質(zhì)，被包裹在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分(如線粒體DNA等)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的層次和復(fù)雜性。 v原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體 ;v細(xì)菌多數(shù)基因按功能相關(guān)成串排列，組成操縱元的基因表達(dá)調(diào)控的

3、單元，共同開啟或關(guān)閉，轉(zhuǎn)錄出多順反子(polycistron)的mRNA；真核生物則是一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)，基本上沒有操縱元的結(jié)構(gòu)，而真核細(xì)胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亞基構(gòu)成的，這就涉及到多個基因協(xié)調(diào)表達(dá)的問題，真核生物基因協(xié)調(diào)表達(dá)要比原核生物復(fù)雜得多。 v原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核酸雜交等實驗表明：哺乳類基因組中僅約10%的序列為蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA等編碼，其余約90%的序列功能至今還不清楚。v原核生物的基因為蛋白質(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外

4、顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)，轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)剪接(splicing)去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質(zhì)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)。 v原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個拷貝外，重復(fù)序列不多。哺乳動物基因組中則存在大量重復(fù)序列(repetitive sequences)。 從上述可見：真核基因組比原核基因組復(fù)雜得多，至今人類對真核基因組的認(rèn)識還很有限，現(xiàn)在國際上制訂的人基因組研究計劃(human gene project)完成，繪出人全部基因的染色體定位圖，測出人基因組109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互關(guān)系，特別是要明了基因表達(dá)調(diào)控的全部規(guī)律，還需

5、要經(jīng)歷很長期艱巨的研究過程。 二、真核基因表達(dá)調(diào)控的特點 與原核生物比較它具有一些明顯的特點： (一)真核基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)更多 基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整個過程。同原核生物一樣，轉(zhuǎn)錄依然是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)。但真核基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核(線粒體基因的轉(zhuǎn)錄在線粒體內(nèi))，翻譯則多在胞漿，兩個過程是分開的，因此其調(diào)控增加了更多的環(huán)節(jié)和復(fù)雜性，轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控占有了更多的分量。 (二)真核基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān) 。真核基因組DNA絕大部分都在細(xì)胞核內(nèi)與組蛋白等結(jié)合成染色質(zhì)，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)中DNA和組蛋白的結(jié)構(gòu)狀態(tài)都影響轉(zhuǎn)錄，至少有以下現(xiàn)象： 1.染

6、色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄 2.組蛋白的作用：組蛋白與DNA結(jié)合阻止DNA上基因的轉(zhuǎn)錄，去除組蛋白基因又能夠轉(zhuǎn)錄。組蛋白是堿性蛋白質(zhì)，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基相結(jié)合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉(zhuǎn)錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用；染色質(zhì)中的非組蛋白成分具有組織細(xì)胞特異性，可能消除組蛋白的阻遏，起到特異性的去阻遏促轉(zhuǎn)錄作用。 v3.轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結(jié)構(gòu)。這些都表明核小體結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄。v4.轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域?qū)怂崦缸饔妹舾卸仍黾?。活躍進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)區(qū)域受DNase 消化常出現(xiàn)100200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其DNA受組蛋白掩蓋的結(jié)構(gòu)有變化，出現(xiàn)了對DN

7、ase 高敏感點(hypersensitive site)。這種高敏感點常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄基因的5側(cè)區(qū)(5 flanking region)、3末端或在基因上，多在調(diào)控蛋白結(jié)合位點的附近，分析該區(qū)域核小體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能有利于調(diào)控蛋白 結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。 5. DNA堿基修飾變化：真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5methylcytidine,m5C)，而活躍轉(zhuǎn)錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。這種甲基化最常發(fā)生在某些基因5側(cè)區(qū)的CG序列中，實驗表明這段序列甲基化可使其后的基因不能轉(zhuǎn)錄，甲基化可能阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA特定部位的結(jié)合從而影響轉(zhuǎn)錄。如果用基因打靶的方法除去主

8、要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常發(fā)育而死亡，可見DNA的甲基化對基因表達(dá)調(diào)控是重要的。 由此可見，染色質(zhì)中的基因轉(zhuǎn)錄前先要有一個被激活的過程，但目前對激活機(jī)制還缺乏認(rèn)識。 (三)真核基因表達(dá)以正性調(diào)控為主：真核RNA聚合酶對啟動子的親和力很低，基本上不依靠自身來起始轉(zhuǎn)錄，需要依賴多種激活蛋白的協(xié)同作用。真核基因調(diào)控中雖然也發(fā)現(xiàn)有負(fù)性調(diào)控元件，但其存在并不普遍；真核基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有兩種作用者，但總的是以激活蛋白的作用為主。即多數(shù)真核基因在沒有調(diào)控蛋白作用時是不轉(zhuǎn)錄的，需要表達(dá)時就要有激活的蛋白質(zhì)來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。換言之：真核基因表達(dá)以正性調(diào)控為主導(dǎo)。 三、真核基

9、因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 真核細(xì)胞的三種RNA聚合酶(、和)中，只有RNA聚合酶能轉(zhuǎn)錄生成mRNA，以下主要討論RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。(一)順式作用元件(cisacting elements) 真核基因的順式調(diào)控元件是基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而影響轉(zhuǎn)錄的DNA序列。其中主要是起正性調(diào)控作用的順式作用元件，包括啟動子(promoter)、增強(qiáng)子(enhancer)；近年又發(fā)現(xiàn)起負(fù)性調(diào)控作用的元件靜止子(silencer) 1.啟動子 與原核啟動子的含義相同，是指RNA聚合酶結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的DNA序列。但真核啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結(jié)合DNA而起動轉(zhuǎn)錄，而是

10、需要多種蛋白質(zhì)因子的相互協(xié)調(diào)作用，不同蛋白質(zhì)因子又能與不同DNA序列相互作用，不同基因轉(zhuǎn)錄起始及其調(diào)控所需的蛋白因子也不完全相同，因而不同啟動子序列也很不相同，要比原核更復(fù)雜、序列也更長。真核啟動子一般包括轉(zhuǎn)錄起始點及其上游約100200bp序列，包含有若干具有獨立功能的DNA序列元件，每個元件約長730bp。最常見的哺乳類RNA聚合酶啟動子中的元件序列見表1。 元件名稱共同序列結(jié)合的蛋白因子 名稱分子量結(jié)合DNA長度TATAboxTATAAAATBP30,00010bpGC boxGGGCGGSP-1105,00020bpCAAT boxGGCCAATCTCTF/NF160,00022bpO

11、ctamerATTTGCATOct-176,00010bpOct-253,00020bpkBGGGACTTTCCNFkB44,00010bpATFGTGACGTAFT?20bp哺乳類RNA聚合酶啟動子中的元件序列 啟動子中的元件可以分為兩種：核心啟動子元件(core promoter element)指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始點及其上游25/30bp處的TATA盒。核心元件單獨起作用時只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點和產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。v上游啟動子元件(upstream promoter element)包括通常位于70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點更遠(yuǎn)

12、的上游元件。這些元件與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合能提高或改變轉(zhuǎn)錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達(dá)分別有不同的調(diào)控。 2.增強(qiáng)子 是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子。增強(qiáng)子通常占100200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構(gòu)成，基本核心組件常為812bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強(qiáng)子的作用有以下特點： v增強(qiáng)子提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠(yuǎn)距離作用，通?？删嚯x14kb、個別情況下離開所調(diào)控的基因30

13、kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。 v增強(qiáng)子作用與其序列的正反方向無關(guān)，將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒就不能起作用，可見增強(qiáng)子與啟動子是很不相同的。 增強(qiáng)子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強(qiáng)子不能表現(xiàn)活性。但增強(qiáng)子對啟動子沒有嚴(yán)格的專一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。例如當(dāng)含有增強(qiáng)子的病毒基因組整合入宿主細(xì)胞基因組時，能夠增強(qiáng)整合區(qū)附近宿主某些基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)增強(qiáng)子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉(zhuǎn)錄。使某些癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)，可能是腫瘤發(fā)生的因素之一。 v增強(qiáng)子的作用機(jī)理雖然還不明確，但與其他順式調(diào)控元件一樣，必須與特定

14、的蛋白質(zhì)因結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性，許多增強(qiáng)子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有的特異性蛋白質(zhì)因子所決定的。 3.靜止子 最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在T淋巴細(xì)胞的T抗原受體基因的轉(zhuǎn)錄和重排中證實這種負(fù)調(diào)控順式元件的存在。目前對這種在基因轉(zhuǎn)錄降低或關(guān)閉中起作用的序列研究還不多，但從已有的例子看到：靜止子的作用可不受序列方向的影響，也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達(dá)起作用。 (二)反式作用因子(transacting factors) 由不同染色體上基因座位編碼的、能直接或間接地識別或結(jié)合在各順式作用元件8一12bP核心序列上并參與調(diào)控靶基

15、因轉(zhuǎn)錄效率的這些結(jié)合蛋白稱作反式作用因子(transacting factor)。它們在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中具有特殊的重要性。這類DNA結(jié)合蛋白有多種能特異性識別這類蛋白的序列也有多種正是不同的DNA結(jié)合蛋白與不同識別序列之間在空間結(jié)構(gòu)上的相互作用，以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，構(gòu)成了復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)。 研究得較多的反式作用因子有Spl、CTF、Apt、 Ap2、 oct1、oct2等。 四、激素的調(diào)控作用：激素的調(diào)控作用： 激素誘導(dǎo)模式：真核生物內(nèi)的調(diào)控信號來自體內(nèi)激素，這些可擴(kuò)散的物質(zhì)稱反式作用因子。 五、五、基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控（一）不同剪接方式可產(chǎn)生不同的mR

16、NA： 組成型剪接、交替剪接、組成型剪接：大多數(shù)前體mRNA都含有多個內(nèi)含子，他們常被有序的逐一切除，形成一個由各外顯子連接而成的成熟mRNA，這種剪接方式稱。 交替剪接（alternative splicing)：來自同一個基因的前體mRNA中某個內(nèi)含子5端供點又可在特定條件下與另一個內(nèi)含子的3端受點進(jìn)行剪接，從而刪除這兩個內(nèi)含子及其中間的全部外顯子和內(nèi)含子。這樣，一個前體mRNA就可因剪接方式不同產(chǎn)生多種mRNA，轉(zhuǎn)譯出多個不同蛋白質(zhì)，這樣的剪接方式稱為交替剪接. 剪接方式有3類（P291） 類型1：不同5末端 交替剪接 類型2：不同3末端 類型3：不同剪接方式（二）RNA編輯： 定義：轉(zhuǎn)

17、錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基插入， 缺失或轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象。 意義：糾正某些移碼突變；構(gòu)建或刪除起始密碼子、終止密碼子；增減核苷酸擴(kuò)充遺傳信息。 六、基因翻譯水平的調(diào)控1. 翻譯多肽過程的調(diào)控： 真核生物的許多組織或細(xì)胞中，經(jīng)轉(zhuǎn)錄mRNA受抑制不能翻譯成多肽，以失活的狀態(tài)貯存。如植物種子在發(fā)芽的早期階段，雖沒有mRNA 的合成，但有蛋白質(zhì)的合成。海膽卵內(nèi)mRNA在受精前不能進(jìn)行翻譯，受精后的蛋白質(zhì)合成速率猛增。 調(diào)節(jié)機(jī)制：調(diào)節(jié)機(jī)制：. mRNA加尾過程：卵細(xì)胞中mRNA僅具有20個核苷酸的多聚(polyA) 尾端序列，在生物發(fā)育適宜時期，尾端序列加長至幾百個核苷酸序列，并翻譯成蛋白質(zhì)。 . 阻遏蛋白

18、特異結(jié)合：如鐵蛋白的翻譯調(diào)控：鐵蛋白的功能是貯存鐵。鐵蛋白的mRNA翻譯取決于鐵的供應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞沒有鐵時，阻遏蛋白與鐵蛋白mRNA啟動子區(qū)域鐵反應(yīng)元（iron response element，IRE）結(jié)合，阻止翻譯進(jìn)行；當(dāng)有鐵存在時，阻遏物不再與IRE結(jié)合，翻譯順利進(jìn)行。 2. 蛋白質(zhì)加工過程的調(diào)控：蛋白質(zhì)加工過程的調(diào)控：. 蛋白質(zhì)的折疊：蛋白質(zhì)在一定的條件下（如伴蛋白chaperones 存在時)，才能折疊成一定的空間構(gòu)型并具有生物學(xué)功能。. 蛋白酶的切割： . 末端切割：有些分泌蛋白對細(xì)胞有毒害作用，常以無活性的前體蛋白形式貯存在于細(xì)胞內(nèi)，需要這種蛋白時，由蛋白酶切割加工成有功能的蛋白。如，蜜蜂在叮咬動物時注入蜜毒素，引起細(xì)胞溶解，蜜毒素也能使蜜蜂自身的細(xì)胞溶解。翻譯后以前體形式儲存于細(xì)胞內(nèi)，能被細(xì)胞間隙的一種蛋白酶識別和切割，釋放出