外源DNA殘留量測(cè)定(熒光定量PCR法)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程SOP

1、外源dna殘留量測(cè)定(熒光定量pcr法)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程sop外源性dna殘留量測(cè)定法（熒光定量pcr法）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼： xxxxxx 目 錄1.目的12.范圍13.職責(zé)14.依據(jù)15.定義16.內(nèi)容1.原理1.實(shí)驗(yàn)材料2.操作步驟3.結(jié)果計(jì)算6.判定標(biāo)準(zhǔn)7.注意事項(xiàng)77.相關(guān)文件78.附件79.變更歷史721. 目的1.1. 規(guī)范外源性dna殘留量測(cè)定法（熒光定量pcr法）的操作過(guò)程。2. 范圍2.1. 本規(guī)程適用于采用熒光定量pcr法對(duì)cho細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品進(jìn)行外源性dna殘留量的測(cè)定。3. 職責(zé)3.1. 方法學(xué)研究員負(fù)責(zé)嚴(yán)格執(zhí)行本規(guī)程規(guī)定；3.2. 質(zhì)量研究室負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)本規(guī)程的培訓(xùn)并監(jiān)督

2、本規(guī)程的執(zhí)行。4. 依據(jù)4.1. dna殘留量檢測(cè)樣品處理試劑盒（prepseqtm residual dna sample preparation kit，applied biosysterms）使用說(shuō)明書(shū)。5. 定義5.1. ltr：long tandem repeat，長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)序列5.2. pcr：polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)5.3. ct：閾值循環(huán)，即熒光信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)設(shè)置的閾值強(qiáng)度時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)6. 內(nèi)容6.1. 原理cho工程細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，其外源性dna殘留量的測(cè)定采用熒光定量pcr法。該方法是以熒光定量pcr儀為設(shè)備平臺(tái)基礎(chǔ)，選擇

3、cho細(xì)胞中含量較豐富的一段ltr（long tandem repeat，長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)序列）為靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，建立基于taqman探針的定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。用已知量的cho細(xì)胞基因組dna做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)對(duì)ct值進(jìn)行線(xiàn)性回歸計(jì)算樣品中dna的含量。6.2. 實(shí)驗(yàn)材料6.2.1. 試藥與試液6.2.1.1. 滅菌水使用電阻率不低于·cm的超純水，121滅菌20分鐘以上。本方法所有試液均用滅菌水配制。6.2.1.2. 1mol/l tris-hcl 緩沖液（ph=）稱(chēng)取 三羥甲基氨基甲烷（tris），溶于400ml水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph值到，加水至500ml。室溫保存。6.2.1.3. mo

4、l/l edta溶液（ph=）稱(chēng)取乙二酸四乙酸二鈉，溶于400ml水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值到，加水至500ml。室溫保存。6.2.1.4. te緩沖液量取1 mol/l tris-hcl緩沖液5ml， mol/l edta溶液1ml，加水至500ml。室溫保存。6.2.1.5. nacl溶液稱(chēng)取 nacl用適量水溶解后，加入1mol/l tris-hcl 緩沖液（ph=）4ml，并用水稀釋至200ml。室溫保存。6.2.1.6. dna殘留量檢測(cè)樣品處理試劑盒prepseqtm residual dna sample preparation kit購(gòu)自applied biosystems，c

5、at：4413686，根據(jù)試劑盒說(shuō)明將各組分分別貯存于室溫或冰箱。6.2.1.7. 定量pcr預(yù)混溶液premix ex tagtm（probe qpcr）購(gòu)自takara cat：rr390a，每管啟用前-20保存，啟用后4保存，避免多次凍融。6.2.1.8. cho-49引物探針探針引物序列如下：上游引物：tcgaggttaagagcaccaactg；下游引物：gattgttgtgagccaccatgtg；探針：ccagaggtcctgagttcaattcccagc；引物混合物的配制：將上下游引物分別用te緩沖液稀釋至27mol/l，等體積混合后分裝，-20保存。探針的配制：用te緩沖液稀

6、釋至10mol/l后分裝，-20保存。6.2.2. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6.2.2.1. cho 細(xì)胞 dna 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，分裝后-20保存。6.2.3. 儀器與用具熒光定量pcr儀、無(wú)菌低吸附離心管（pcr級(jí)潔凈）、離心機(jī)、潔凈工作臺(tái)、渦旋混合儀、水浴鍋、移液器、防氣溶膠帶濾芯移液器吸頭、磁力架（applied biosystems）、熒光定量pcr反應(yīng)管/板。6.3. 操作步驟6.3.1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)稀釋取已分裝的cho 細(xì)胞 dna 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，用te緩沖液稀釋到3×105 pg /ml后，按下表分別進(jìn)行10倍梯度稀釋。tube編號(hào)稀釋方法dna濃度(pg /ml

7、)sd1/3×105sd250l sd1+450l te3×104sd350l sd2+450l te3×103sd450l sd3+450l te300sd550l sd4+450l te30sd650l sd5+450l te36.3.2. 樣品處理根據(jù)各品種項(xiàng)下具體要求，進(jìn)行樣品處理；如需采用試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行殘留dna提取，應(yīng)按以下步驟進(jìn)行：6.3.2.1. 待測(cè)樣品：根據(jù)各品種項(xiàng)下規(guī)定，取待測(cè)樣品100l或200l于的離心管，一般每批樣品做三個(gè)平行。6.3.2.2. 加標(biāo)樣品：取待測(cè)樣品100l或200l于的離心管，并加入適量陽(yáng)性dna，dna加入量應(yīng)約為

8、樣品dna含量的210倍。6.3.2.3. 提取陰性對(duì)照（neg）：取100l或200l的te緩沖液于的離心管，作為提取陰性對(duì)照。6.3.2.4. 以上各管加入10l（每100l樣品）的nacl溶液，調(diào)整鹽離子的含量。6.3.2.5. 蛋白酶處理：各管加入蛋白酶k混合液70l（每100l樣品），其中含蛋白酶k 10l、蛋白酶k緩沖液60l。56水浴30分鐘。6.3.2.6. lysis buffer solution mix的配制：glycogen（5mg/ml）180l、trna（10mg/ml）4 l、lysis buffer 7600 l混勻，每管各加入360l（每100l樣品）。6.3

9、.2.7. 37水浴處理磁性納米顆粒（magnetic particles）10分鐘，渦旋振蕩使其充分混勻，直到磁性納米顆粒完全懸浮，每管各加入30l（每100l樣品），用吸頭上下吸動(dòng)幾次混勻。6.3.2.8. 各管加入300l的binding solution（每100l樣品），顛倒離心管兩次，渦旋震蕩5分鐘。6.3.2.9. 快速離心15秒，將離心管放到磁力架上5分鐘或直到溶液變清，吸掉上清。6.3.2.10. 各管加入300l的wash buffer（每100l樣品），來(lái)回顛倒離心管兩次，渦旋震蕩5秒。6.3.2.11. 快速離心15秒，將離心管放到磁力架上1分鐘，吸掉上清。以相同的方法

10、用wash buffer重復(fù)洗滌樣品一次，最后將離心管管底的殘留液體吸干。6.3.2.12. 打開(kāi)離心管管蓋，室溫放置20分鐘，讓殘留管壁的液體揮發(fā)晾干。6.3.2.13. 各管加入100 l的洗脫緩沖液（elution buffer），讓磁性納米顆粒充分懸浮。70水浴10分鐘，在水浴過(guò)程中渦旋震蕩離心管三次。6.3.2.14. 離心15秒，將離心管放到磁力架上2分鐘，轉(zhuǎn)移上清于干凈的離心管，高速離心3分鐘，放磁力架1分鐘。6.3.2.15. 轉(zhuǎn)移上清于另一支干凈的 ml的離心管，作為供試品進(jìn)行pcr反應(yīng)。6.3.3. 定量pcr檢測(cè)6.3.3.1. dna標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制：見(jiàn)。6.3.3.2.

11、打開(kāi)7500熒光定量pcr儀，預(yù)熱至少30分鐘。6.3.3.3. 加樣pcr反應(yīng)體系如下：加樣成分每個(gè)反應(yīng)體系加樣體積premix ex tag（2×）15lrox reference dye（50×）l引物（各mol/l）l探針（10mol/l）lte緩沖液l模板10l根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系數(shù)量計(jì)算各加樣成分所需總體積，并將除模板以外的成分預(yù)先混合。于熒光定量pcr反應(yīng)管/板中分別加入20l預(yù)先混合好的試劑，再分別移取dna標(biāo)準(zhǔn)品、提取陰性對(duì)照（neg）、陰性對(duì)照（ntc，為te緩沖液）、待測(cè)樣品、加標(biāo)樣品各10l至稀釋板中，設(shè)3個(gè)平行。6.3.3.4. 輕拍反應(yīng)板并瞬時(shí)

12、離心，去除底部氣泡。6.3.3.5. 打開(kāi)計(jì)算機(jī)和檢測(cè)軟件(sds 。6.3.3.6. 在儀器選項(xiàng)卡下，設(shè)置如下參數(shù)：階段1：95，30秒；階段2：95，5秒，60，35秒，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系體積：30l。6.3.3.7. 將反應(yīng)板放置在7500熒光定量pcr儀中運(yùn)行反應(yīng)。6.3.3.8. pcr運(yùn)行結(jié)束后，點(diǎn)擊“analysis”按鈕，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6.4. 結(jié)果計(jì)算6.4.1. 計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果：采用檢測(cè)軟件分析數(shù)據(jù)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)、各供試品ct值、各供試品定量值等結(jié)果。6.4.2. 按照以下公式計(jì)算回收率：回收率（%）加標(biāo)樣品定量值（pg/ml）待測(cè)樣品定量值（pg/ml）

13、15;100%加入陽(yáng)性dna終濃度（pg/ml）6.4.3. 實(shí)驗(yàn)有效性標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)r2值應(yīng)；陰性對(duì)照ct值應(yīng)低于標(biāo)曲3pg/ml點(diǎn)ct值；加標(biāo)樣品的回收率應(yīng)在50%150%之間。6.4.4. 外源性dna殘留量的計(jì)算如無(wú)特殊規(guī)定，按以下方式進(jìn)行計(jì)算。6.4.4.1. 如待測(cè)樣品定量值位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，按以下公式進(jìn)行計(jì)算：外源性dna殘留量（pg/劑量）待測(cè)樣品定量均值（pg/ml）×劑量（mg/劑量）待測(cè)樣品濃縮倍數(shù)×蛋白質(zhì)含量（mg/ml）6.4.4.2. 如待測(cè)樣品定量值位于標(biāo)曲范圍外并低于3pg/ml的定量限，應(yīng)采用3pg/ml進(jìn)行限度分析，計(jì)算公式如下：外源性dna殘留量（pg/劑量）方法定量限（pg/ml）×劑量（mg/劑量）待測(cè)樣品濃縮倍數(shù)×蛋白質(zhì)含量（mg/ml）6.5. 判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)各品種項(xiàng)下要求。6.6. 注意事項(xiàng)6.6.1. 樣品dna提取過(guò)程中殘余的乙醇和磁性納米顆粒對(duì)熒光定量pcr反應(yīng)有抑制作用，應(yīng)小心操作，避免帶入定量反應(yīng)體系中。6.6.2. 為避免污染，樣品dna提取、pcr反應(yīng)、反應(yīng)體系配制等過(guò)程均應(yīng)按污染的嚴(yán)重程度分區(qū)。熒光定量pcr