基因工程大題

1、基因工程大題2基因工程操作的基本步驟是什么？ 施工材料的準備，即目的基因、載體、工具酶和受體細胞（宿主）的準備。用限制性內(nèi)切酶分別將外源dna 和載體分子切開。（切） 目的基因與載體 dna 的體外重組，形成重組dna 分子。（接） 把重組的 dna 分子引入受體細胞，并建立起無性繁殖系。（轉(zhuǎn)和擴 篩選出所需要的無性繁殖系，并保證外源基因在受體細胞中穩(wěn)定遺傳、正確表達。（檢）3如何理解基因工程的兩個特點？答：基因工程的兩個基本特點是分子水平的操作和細胞水平的表達。分子水平的操作包括dna 分離、切割和連接（還有其他一些dna 的修飾等）。由于體外重組dna 的最終目的是要改變生物的遺傳性，所以

2、分子水平的操作和細胞水平的表達是基因工程的兩個最基本的特點。4基因克隆是如何使含有單個基因的dna 片段得到純化的？答：大分子質(zhì)量的dna 會含有許多特殊限制性內(nèi)切核酸酶的限制位點，因此用一種限制 酶處理一完整染色體或整個基因組會產(chǎn)生許多不同的dna 片段，每一個片段帶有基因組的一個不同的基因或一個不同的小片段。當全部片段與用同種限制酶處理過的載體分子混合時（如圖所示），每個片段將插入一個不同的載體分子(如一個質(zhì)粒)。同樣地，當用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞時，每個宿主細胞將只接收一個質(zhì)粒dna 分子，而篩選出的含重組質(zhì)粒的每個菌落實際上會含有某一特異的供體dna 片段的多個拷貝。一旦帶有待研究的特定

3、基因的克隆被確認了，此重組dna 分子可從宿主細胞中提取出來進行純化。5比較遺傳工程、基因工程和生物技術(shù)。答：遺傳工程是遺傳學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)科學(xué)。借用工程技術(shù)上的設(shè)計思想，在離體條件下，對生物細胞、細胞器、染色體或dna 分子進行按圖施工的遺傳操作，以求定向地改造生物的遺傳性。遺傳工程的概念有廣義和狹義之分。狹義的遺傳工程就是指基因工程?；蚬こ蹋╣ene engineering）又稱基因操作（gene manipulation）、重組dna（recombinant dna）?；蚬こ淌且苑肿舆z傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法手段，將不同來源的基因(dna 分子)，按

4、預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建雜種dna 分子，然后導(dǎo)入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品，或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能。生物技術(shù)又稱生物工藝學(xué)，生物工程學(xué)。是根據(jù)生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理進行工業(yè)規(guī)模的經(jīng)營和開發(fā)微生物、動植物細胞及其亞細胞組分，進而利用生物體所具有的功能元件(如基因、蛋白質(zhì))等來提供商品或社會服務(wù)的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。它包括基因工程、細胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等。6說明sanger dna 測序法的原理。答：sanger dna 測序法建立在兩個基本原理之上：核酸是依賴于模板在聚合酶的作用下由5端向3端聚合；可延伸的引物必須能提供游離的3羥基末端，雙脫氧核苷酸

5、由于缺少游離的3羥基末端，因此會終止聚合反應(yīng)的進行。如果分別用四種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會獲得四組長度不同的dna 片段。通過比較所有dna 片段的長度可以得知核苷酸的序列。11當兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時，若要進行雙酶切，應(yīng)采取什么措施 為什么答：注意星號活性；先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星號活性，或使用通用緩沖液。12何謂限制性物理圖譜？答：限制性物理圖譜即限制性內(nèi)切核酸酶作圖(restriction mapping)。簡單地說就是dna 分子中限制性內(nèi)切核酸酶切割位點的定位，即dna 分子中各種不同限制性內(nèi)

6、切核酸酶的酶切位點的線性排列圖。標明限制酶在dna 分子上的限制性位點的數(shù)目、限制性片段大小及其線性排列的順序。13什么是細菌的限制修飾系統(tǒng) (restriction modificationsystem，r-m system)答：細菌中有作用于同一dna 的兩種酶，即分解dna 的限制酶和改變dna 堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶。而且，這兩種酶作用于同一dna 的相同部位，把這兩種酶所組成的系統(tǒng)稱為限制與修飾系統(tǒng)。14細菌的限制修飾系統(tǒng)有什么意義?答：不同種的細菌或不同的細菌菌株具有不同的限制酶和修飾酶組成的限制與修飾系統(tǒng)。修飾的本質(zhì)是通過甲基化酶將dna 中某些堿基進行甲基化修飾，由

7、于宿主自身dna 上的這些位點進行了修飾，限制酶就不能進行切割。而外來的dna 在相應(yīng)的堿基上沒有被甲基化，宿主的限制酶通過對該位點的識別來分辨敵我，并將入侵的外來dna 分子降解掉。所以dna 限制作用和修飾作用為細胞提供了保護。15說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點。答：基本原則：屬名+種名+株名十序號。首字母：取屬名的第一個字母，且斜體大寫。第二個字母：取種名的第一個字母，斜體小寫。第三個字母：取種名的第二個字母，斜體小寫。第四個字母：若有株名，株名則作為第四個字母，用正體。順序號：若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以i、ii、iii 等，用正體。所有的限制酶，前面還應(yīng)帶有系

8、統(tǒng)的名稱,如限制性核酸內(nèi)切酶 r. hind iii。修飾酶則在前面加上甲基轉(zhuǎn)移酶m，如甲基轉(zhuǎn)移酶m. hind iii。在上下文已清楚只涉及限制酶的地方，r 可被省去。16何謂限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率?答：切割頻率是指限制性內(nèi)切核酸酶在某dna 分子中預(yù)測的切點數(shù)。由于dna 是由四種類型的單核苷酸組成，假定dna 的堿基組成是均一的，而限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點是隨機分布的，那么對于任何一種限制酶的切割頻率，理論上應(yīng)為14n，n 表示該限制酶識別的堿基數(shù)。如識別4 個堿基的限制酶，其切割頻率應(yīng)為每256 個堿基有一個識別序列和切點（144 = 1256），識別5 個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶

9、，其切割頻率應(yīng)為每1024 個堿基有一個識別序列和切點，余類推。18雙酶消化法（double digest）繪制限制性內(nèi)切核酸酶酶譜的原理是什么?答：雙酶消化法是繪制dna 中兩個或兩個以上限制性內(nèi)切核酸酶圖譜所采用的方法。做法是在兩個限制性內(nèi)切核酸酶分別單獨消化dna 分子的基礎(chǔ)上，再用這兩個酶同時或先后消化dna，根據(jù)它們的結(jié)果構(gòu)建物理圖譜。17什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性受哪些因素的影響答：ii 類限制酶雖然識別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來的特異性。條件發(fā)生改變，限制酶的特異性就會松動，識別的序列和切割都有一些改變。改變后的活性

10、通常稱第二活性，而將這種因條件的改變會出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個星號表示，因此第二活性又稱為星號活性。誘發(fā)星號活性的因素有如下幾種：高甘油含量(5，vv)；限制性內(nèi)切核酸酶用量過高(100ugdna)；低離子強度(25mmoll)；高ph(80 以上)；含有有機溶劑，如dmso、乙醇等；有非mg2+的二價陽離子存在（如mn2+、cu2+、co2+、zn2+等）。19什么是dna 多態(tài)性 (dna polymorphism)答：在正常人群中，各個體dna 分子的某些位點可以發(fā)生中性改變，這些改變雖然會使dna 一級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定變化，但不影響基因的表達，如果這種中性突變在人群中的頻率不低于1，

11、這一現(xiàn)象被稱為多態(tài)性。dna 多態(tài)性本質(zhì)上是染色體dna 中核苷酸數(shù)目或排列順序的個體差異，這些差異多數(shù)為中性突變，不引起表型改變。20什么是限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fragment lengt hpolymorphism，rflp)答：當dna 序列的差異發(fā)生在限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點時，或當dna 片段的插入、缺失或重復(fù)導(dǎo)致基因組dna 經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶解后，其片段長度的改變可以經(jīng)凝膠電泳區(qū)分時，dna多態(tài)性就可應(yīng)用限制性內(nèi)切核酸酶進行分析，這種多態(tài)性稱為限制性片段長度多態(tài)性(rflp)。22何為回文序列？答：回文序列（palindromic sequence

12、）是一段自我互補的序列，即同其互補鏈一樣的序列（兩者的閱讀方向都是從53，)。根據(jù)回文序列的結(jié)構(gòu)可分為：完全的回文序列、不完全的回文序列和間斷的回文序列。完全回文序列（如gaattc），通常是限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列；不完全的回文序（tacctccat,cgtgata），常是其他蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(如阻抑蛋白)，在基因表達調(diào)控中有重要作用；間斷的回文序列（如ggttxxxaacc，有一段是顛倒的重復(fù)），它可使單鏈的核苷酸有可能在trna 中所見到的一樣，形成發(fā)夾環(huán)的結(jié)構(gòu)。23dna 連接酶的連接機理是什么？答：dna 連接酶是利用atp 或nad+煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)提供的能量催化d

13、na 雙鏈間的缺口形成磷酸二酯鍵。在連接反應(yīng)中，首先atp (nad+)與dna 連接酶反應(yīng)，同連接酶生成一種共價結(jié)合的酶-amp 復(fù)合物。其中amp(腺苷一磷酸)通過一種磷酸酰胺鍵同dna 連接酶的賴氨酸殘基的-氨基相連。同時釋放出焦磷酸或煙酰胺單核苷酸（nmn）。amp 激活dna 一條鏈的5-末端磷酸基團, 并轉(zhuǎn)移到磷酸基團上，形成dna-腺苷一磷酸復(fù)合物。最后，3-oh 對激活的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，同時釋放出amp。連接反應(yīng)是由在形成酶-腺苷酸復(fù)合體時，焦磷酸水解和釋放提供的能量驅(qū)動下進行的。在以atp作為能源的連接酶中，一個磷酸二酯鍵的形成消耗掉兩個高能磷酸鍵。29列舉

14、質(zhì)粒載體必須具有的基本條件。答：(1)能獨立復(fù)制；(2)具有選擇標記；(3)有獨特的酶切位點；(4)能轉(zhuǎn)化但不擴散。24dna 連接酶的作用特點有哪些？ 連接反應(yīng)需要在一條dna 鏈的3末端具有一個游離的-oh, 而另一條dna 鏈的5 末端具有一個磷酸基團(-p)的情況下，才能發(fā)揮其連接dna 分子的功能作用，而在末端帶有5-羥基和3-羥基；5-磷酸和3-二脫氧核苷基團的兩個dna 片段之間不起連接作用。 連接反應(yīng)中需要 atp 或nad+ 和mg2+ 為輔助因子和激活因子； dna 連接酶不能夠連接兩條單鏈的dna 分子，被連接的dna 鏈必須是雙螺旋的一部分。 dna 連接酶只封閉雙螺旋

15、dna 骨架上的缺口 (nick)，即在雙鏈dna 的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂，而不能封閉雙鏈dna 的某一條鏈上失去一個或數(shù)個核苷酸所形成的裂口25影響dna 連接酶連接反應(yīng)的因素主要有哪些？答：1) 反應(yīng)溫度：最佳反應(yīng)溫度37，但黏性末端之間退火形成的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，連接黏性末端的最佳溫度，一般認為420比較合適。2) dna 片段末端：不僅要考慮反應(yīng)體系中dna 末端的總濃度，還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。原則上應(yīng)保證一個dna 分子的末端有較高的幾率與另一 dna 分子連接，減少同一個分子兩個末端之間的自身連接。載體與插入片段 3：1 1

16、：3。3) 連接酶濃度：平末端dna 分子的連接反應(yīng)，最適酶量大約是12 單位；而黏末端dna 片段間的連接，在同樣的條件下，僅為 單位時，便能得到最佳連接效率。28切口平移法制備dna 探針的原理是什么？答：在mg 離子存在時，用低濃度的dna 酶i（dnase i）處理雙鏈dna，使之隨機產(chǎn)生單鏈斷裂。然后用dna 聚合酶i 的 5' 3'外切酶活性可以從斷裂處的 5' 端除去一個核苷酸，而其聚合酶活性則將一個單核苷酸添加到斷裂處的 3' 端。隨著反應(yīng)的進行，即5' 端核苷酸不斷去除，而 3' 端核苷酸同時摻入，導(dǎo)致斷裂形成的切口沿著dna

17、鏈按合成的方向移動，這種現(xiàn)象稱為切口平移。如果在反應(yīng)體系中加入放射性同位素標記的核苷酸，則這些標記的核苷酸將取代原來的核苷酸殘基，產(chǎn)生帶標記的dna 分子，用作dna 分子雜交探針。27堿性磷酸酯酶主要有兩種，細菌堿性磷酸酯酶（bip）和小牛腸堿性磷酸酯酶（cip），二者有什么不同在基因工程中有什么用途答：主要差別是cip 在68時失活，而bap 在68穩(wěn)定，且耐酚抽提。應(yīng)用：dsdna 的5端脫磷酸，防止dna 的自身連接。但是用cip 處理后，最好將cip 除去，再進行連接反應(yīng)。dna 和rna 脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進行末端標記。30舉例說明什么是穿梭載體？答：穿梭載體是含有細菌質(zhì)

18、粒和克隆的真核生物dna 片段的雜種質(zhì)粒，有兩個復(fù)制起點和能在兩種不同細胞中進行選擇的選擇標記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個宿主 (來回穿梭)。38質(zhì)粒制備的基本原理？答：帶有質(zhì)粒的細菌細胞在sds 作用下裂解，并在堿性條件下使dna 變性。調(diào)節(jié)ph 值至中性時，質(zhì)粒dna 首先復(fù)性，而細菌基因組dna 不能復(fù)性而與sds-蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，可以被離心沉淀除去。上清液中的質(zhì)粒dna 分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀純化出來。1226什么是klenow 酶有哪些活性在基因工程中有什么作用答：klenow 酶是1974 年klenow 用枯草桿菌蛋白酶水解dna 聚合酶i，得到的兩個片段。其中大片

19、段的分子質(zhì)量為75kda，它具有53聚合酶和3 5外切核酸酶的活性，小片段具有53外切核酸酶活性。由于大片段失去了dna 聚合酶i 中會降解5引物的53外切核酸酶活性，所以在基因工程中更有用。klenow 酶主要有下列用途：(1) 修復(fù)反應(yīng)，制備平末端?？捎胟lenow 酶修復(fù)限制性內(nèi)切核酸酶或其他方法產(chǎn)生的5或3突出端，制備平末端，這樣可以使原來具有不相容的黏性末端的dna 片段通過平末端重組。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標記的脫氧核苷酸，用這種末端填補的方法可以制備3端標記的探針。用klenow 酶修復(fù)5突出端的反應(yīng)主要是利用了klenow 酶的dna 聚合酶活性，是填補反應(yīng)；而修復(fù)3突

20、出端則是用klenow 酶的3 5外切核酸酶的活性，是切割反應(yīng)。用klenow 酶的切割反應(yīng)來修復(fù)3突出端是不理想的，改用t4 dna聚合酶或其他的酶是更好的選擇。(2) 標記dna 3突出端 (protruding end)。該反應(yīng)分兩步進行：先用3 5的外切核酸酶活性除去3突出端，產(chǎn)生3隱含末端，然后在高濃度的標記底物 (32p-dntp) 存在下，使降解3 5) 作用與聚合 (53) 作用達到平衡。這種反應(yīng)也叫交換或取代反應(yīng) (exchangereplacement reaction)。不過這一反應(yīng)用t4 dna 聚合酶的效果更好，因它的3 5的外切核酸酶活性較強。(3)其他的一些用途。

21、包括用雙脫氧末端終止法進行dna 序列分析、用于cdna 第二鏈的合成、在定點突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法 (primer extension) 制備單鏈dna 探針等。31yac 載體具有什么樣的為什么在克隆大片段時，yac 具有優(yōu)越性答：（1）功能性dna 序列:來自于酵母的125bp dna 片段的著絲點序列 (cen4)。來自酵母的自主復(fù)制序列 (ars1)，起始在酵母中的dna 復(fù)制。來自酵母的端粒序列，它是 (5-tgtgggtgtggtg-3) 的多拷貝重復(fù)，它對染色體的復(fù)制和維持是必需的。在酵母中進行選擇的標記基因，ura3（尿嘧啶生物合成基因）和trp1（色氨酸合成基因

22、）。寄主是這些基因的營養(yǎng)缺陷性，只有帶有這些基因的轉(zhuǎn)化體才能在選擇培養(yǎng)基上生活具有細菌的復(fù)制起始點和選擇標記基因。yac 載體通常含有cole1 的ori 和氨芐青霉素抗性標記基因，可以在大腸桿菌中復(fù)制和繁殖，所以它也是一種穿梭載體。（2）優(yōu)越性：yac 能夠容納長達上千kb 的外源dna，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。40為什么野生型的噬菌體dna 不宜作為基因工程載體?答：(1) 噬菌體dna 沒有容載能力，因為噬菌體的頭部對dna 包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105，所以

23、要將噬菌體改造成載體，必須削減本身的分子大小；(2) 野生型的dna 對于一些常用的酶都有多個識別和切割位點，不便于克隆；(3) 沒有可供選擇的標記；(4) 野生型的噬菌體具有感染性，因此不夠安全。33什么是yacyac 克隆載體常出現(xiàn)哪些問題答：yac 即酵母人工染色體（yeast artificial chromosome）的縮寫，是人工構(gòu)建的染色體樣大容量克隆載體，基本組成有著絲點、能在細菌和酵母中進行復(fù)制的復(fù)制起始點和選擇標記及端粒。最大dna 克隆片段可達到2000kb。問題有：(1) yac 有嵌合現(xiàn)象，一個yac 中克隆的dna 片段可能來自兩個或多個不同的染色體。在基因組文庫中

24、，嵌合體占克隆總數(shù)的1060。(2) yac 內(nèi)部有重組現(xiàn)象，插入的dna 較大，序列發(fā)生重排，導(dǎo)致和原來染色體的序列不一致，重組很難檢出。(3) yac 還有缺失現(xiàn)象，影響yac 文庫的代表性。(4) yac 結(jié)構(gòu)和酵母天然染色體結(jié)構(gòu)相似，使用常規(guī)方法不易將yac 和酵母天然染色體分開。(5) 構(gòu)建好的yac 轉(zhuǎn)化原生質(zhì)化的酵母菌，轉(zhuǎn)化效率低。(6) 建好庫后保存方便，但要篩選某個基因時工作量大32由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全。進行嚴格地監(jiān)控對質(zhì)粒載體的安全是十分重要的。請問質(zhì)粒載體的安全條件包括哪幾個方面?答：(1) 非傳遞性和不被帶動轉(zhuǎn)移。對于多數(shù)基

25、因克隆操作來說，都不希望載體能夠進行自主傳遞，也不希望被帶動轉(zhuǎn)移。(2) 具有條件致死突變，如溫度敏感質(zhì)粒pjc307 (cole1 的衍生質(zhì)粒) 在哺乳動物正常體溫下就喪失復(fù)制能力，可防止克隆基因擴散，只存在于限定的宿主細胞中。(3) 一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因為重組后有可能給宿主帶來突變。(4) 有較小的宿主范圍。34什么是 bacbac 載體的組成與優(yōu)缺點有哪些 細菌人工染色體（bac）是從大腸桿菌f 因子改造構(gòu)建而來的，能夠攜帶大約300kb 的dna 插入片段。 載體具有 f 因子的復(fù)制起始點（oris），可使載體維持每個細胞一個拷貝的水平。 載體包括有 4 個維持dn

26、a 復(fù)制和拷貝數(shù)目的基因，repe, para, parb and parc。 具有一個抗生素選擇標記基因，和 lacz基因。在lacz基因中組裝有一多克隆位點，便于外源片段的插入和藍白反應(yīng)篩選克隆子。 插入的 dna 片段非常穩(wěn)定，可以在大腸桿菌細胞中維持數(shù)百代，而且不易發(fā)生重組和從寄主細胞中丟失。 主要缺點是每個細胞中的拷貝數(shù)少（12 個），使得分離和篩選較為困難。35利用pbr322 質(zhì)粒插入失活分離帶有外源dna 片段的重組克隆的原理是什么？ 外源 dna 片段插入在pbr322 質(zhì)粒tetr 基因的編碼序列內(nèi)（bamhi）位點，使該基因失活； 體外重組反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 amps

27、tets 菌株，并涂布在amp 瓊脂平板上，凡獲得了pbr322質(zhì)粒和重組質(zhì)粒(amprtets)的寄主細胞都可長成菌落； 將 amp 瓊脂上的菌落原位影印在tet 瓊脂平板上生長，對比這兩個平板的菌落生長情況，凡在amp平板上能夠生長而在tet 平板上不能生長的菌落，便是屬于帶有重組體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子克隆；挑出這樣的陽性克隆，擴增分離帶有外源dna 插入片段的重組體質(zhì)粒。46分離dna 時，為什么要在緩沖液中加入一定濃度的edta 和蔗糖？答： edta 是螯合劑，可同mg2+螯合，使核酸酶失去了作用的輔助因子，而被抑制活性。 蔗糖增加緩沖液的黏度，保護dna 不易斷裂。36puc 質(zhì)粒利用-互

28、補作用篩選重組子原理是什么？答：puc 系列質(zhì)粒載體是在pbr322 質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上改造來的，它用lacz 基因取代了pbr322質(zhì)粒載體上的tetr 基因。lacz 基因編碼-半乳糖苷酶的n 末端1-63 個氨基酸(-肽鏈)的dna 片段, 在lacz 基因內(nèi)組入了一個多克隆位點（mcs），但不影響lacz基因的功能。 puc 載體的宿主（e. coli）攜帶一個編碼-半乳糖苷酶c 端序列的基因片段, 它們本身用這個基因片段產(chǎn)生的-半乳糖苷酶片段是無活性的, 但它們可以通過-互補作用在體內(nèi)相互彌補, 即兩部分產(chǎn)物可以結(jié)合形成有活性的-半乳糖苷酶。當puc 質(zhì)粒引入大腸桿菌中，在含有指示劑x-

29、gal 和 iptg 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，菌落成藍色。如果在mcs 插入外源dna 片段（基因），破壞了lacz 基因的功能（插入失活），不再產(chǎn)生-肽鏈，不能和宿主細胞產(chǎn)生的多肽片段形成有活性的-半乳糖苷酶，形成的菌落是無(白)色的。因此，根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測出含有外源dna 插入序列的重組體克隆。37自然界中具備理想條件的質(zhì)粒載體為數(shù)不多，即使是cole1 和pscl01 這兩個自然質(zhì)粒也不盡如人意，通常需要進行改造。請問質(zhì)粒改造包括哪些基本內(nèi)容答：基本內(nèi)容包括：(1) 刪除一些非必要的區(qū)段及對宿主有不良影響的區(qū)段；削減載體的分子質(zhì)量，使載體具有更大的容納外源片段的能

30、力。(2) 加上易于選擇或檢測的標記。(3) 限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點的改造，便于外源基因插入到載體中的特定位置。(4) 加上一些調(diào)控元件，有利于克隆基因的表達。(5) 安全性改造，限定載體的宿主范圍。42噬菌體載體具有哪些優(yōu)點與不足?答：優(yōu)點：(1) 基因組中有13 的非必需區(qū)可以被置換。改造成載體后，克隆的片段較大(可 達20kb)，而質(zhì)粒載體的克隆片段只有幾個kb；(2) 用噬菌體dna 作為載體，即使不進行體外包裝，轉(zhuǎn)染的頻率也比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率高，包裝后的效率就更高了；(3) 可通過溶原化反應(yīng)整合到寄主染色體上，當不需要外源基因大量表達時，可讓 它以溶原性存在，若要表達，可通過誘導(dǎo)即

31、可進入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體，得到的重組dna 的拷貝數(shù)就會很多。缺點：(1) 包裝比較麻煩，包裝率不穩(wěn)定，購買包裝蛋白的費用高；(2) 沒有質(zhì)粒的用途廣泛。43以置換型噬菌體作為載體進行克隆時，為什么說能夠形成噬菌斑的就一定是重組體?答：改造的置換型噬菌體載體，重組入外源片段之后，總體積不能超過入基因組的105，不能小于又基因組的75。以置換型噬菌體dna 作為載體，首先要分離左、右兩臂同外源dna 重組。如果沒有外源片段，僅是兩臂連接，長度短于久基因組的75，不能被包噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，總長度超過基因組105后，也不能包入噬菌體顆粒，

32、自然也不能形成噬菌斑。44m13 系列載體具有哪些優(yōu)缺點?答：m13 克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點：(1) 克隆的片段大：m13 噬菌體的dna 在包裝時不受體積的限制，所以容載能力大。有報道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體dna 長67 倍的 dna(插入片段可達40kb)。(2)可直接產(chǎn)生單鏈dna，這對于dna 測序、dna 誘變、制備特異的單鏈dna 探針都是十分有用的。(3) 單鏈dna 和雙鏈dna 都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標記進行篩選。m13 克隆系列的不足：(1) 較大的外源片段插入后，在擴增過程中往往不夠穩(wěn)定。一般說，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的概率越大。(2)

33、 單鏈載體分子感染的細胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。45黏粒載體具有哪些特點與不足?答：主要特點有： 柯斯質(zhì)粒是含有噬菌體 cos 位點的質(zhì)粒載體?？滤官|(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，進入寄主細胞后能夠像質(zhì)粒一樣進行復(fù)制，并且能夠被氯霉素擴增。 具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標記和克隆位點。 插入片段的消化、連接及后來重組克隆的純化與質(zhì)粒載體相同。 具有噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化細菌細胞不同，重組體像 載體一樣，需體外包裝后轉(zhuǎn)染細菌。 包裝后形成的 顆粒用來感染大腸桿菌，重組dna 像 dna 一樣注入細菌細胞，并以cos位點環(huán)化。由于缺乏 的其他dna 序列，環(huán)化dna

34、 在細菌體內(nèi)以質(zhì)粒一樣維持。 簡化了篩選。載體體積小，承載外源 dna 片段大。如果載體的分子質(zhì)量在5kb 的話，得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎排除由載體自連的可能性，因為要被成功包裝，至少要7 個分子的載體自連。盡管如此，也是不能被包裝的，因為cos 位點太多了。重組體只有達到32-45kb 才能有效包裝體外包裝，這就提供了對重組體的正向選擇。 對轉(zhuǎn)化體的選擇是基于載體上的抗生素標記。 感染后形成菌落，而不是噬菌斑。黏粒載體也有如下不足： 如果兩個黏粒之間有同源序列，可能會發(fā)生重組，結(jié)果會使被克隆的片段重排或丟失。 含不同重組 dna 片段的菌落生長速度不同，會造成同一個平板上菌落大小不一。另外由于不同大

35、小的插入片段對宿主細胞的作用不同，會造成文庫擴增量的比例失調(diào)。 包裝過程復(fù)雜，包裝效率不穩(wěn)定，代價高。47分離dna 用酚抽提蛋白質(zhì)時，離心后，為什么蛋白質(zhì)總是停留在水相和酚相之間？答：酚使蛋白質(zhì)分子間脫水而變性，變性蛋白的密度比水大，但比酚小，因此停留在中間層。39噬菌體dna 被包裝到噬菌體的頭部需要哪些基本條件為什么答：兩個cos 位點；線性dna；分子大小在噬菌體基因組的75%105%。48為什么從細胞中分離dna 時往往會斷裂？答：(1) 胞內(nèi)存在很高的核酸酶活性，dna 裸露后，很容易遭到核酸酶的降解。(2) 在分離dna 的過程中，要用到一些酸堿等化學(xué)試劑，也會使dna 斷裂。(

36、3) 在dna 的分離過程中要經(jīng)過多次離心、吸取、轉(zhuǎn)移等，產(chǎn)生的機械張力剪切會使dna 斷裂。49在dna 分離過程中，酚通常與氯仿聯(lián)合使用，即使不聯(lián)合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，為什么?答：原因是酚和水有一定程度的互溶，所以單獨使用酚抽提dna，最終不能除去酚，殘留的酚會使起切割和連接作用的限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶變性。氯仿也是蛋白質(zhì)變性劑，它不與水互溶，但是能夠同苯酚互溶。這樣，酚和氯仿聯(lián)合使用，就可以帶走殘留的酚。50何謂簡并引物 (degenerate primer)答：所謂簡并引物是指根據(jù)肽鏈的氨基酸序列(或部分序列)，并充分考慮密碼子的簡并性而設(shè)計的、用于pcr 擴增的混

37、合引物群體，這種混合引物之間具有不同的堿基組成，但堿基的數(shù)量是相同的。由于充分考慮了密碼的簡并性，在這種混合引物中必定有一種引物是可以和該基因的dna 序列精確互補。51簡并引物設(shè)計的一般原則是什么答：(1) 選擇保守區(qū)設(shè)計簡并引物。(2) 選擇簡并性低的氨基酸密碼區(qū)設(shè)計引物。(3) 注意密碼的偏愛性。(4) 使用盡可能短的引物，以降低簡并性，最短可用1520 個堿基。(5) 由于taq dna 聚合酶在pcr 擴增時容易摻入錯誤堿基，所以設(shè)計的引物，其3端盡量使用具有簡并密碼的氨基酸。52如何用pcr 制備突變dna 分子?答：可用pcr 進行定點突變 (site directed muta

38、genesis)，即在特定位點引入點突變。該突變可以是堿基替代、插入或者缺失。為了在靶基因特定位點導(dǎo)入突變，在pcr 引物設(shè)計時，將一條引物設(shè)計成與靶序列互補但在預(yù)期位點作堿基替換或缺失。在引物中的誘發(fā)突變序列應(yīng)該位于引物的5端或在引物中間部位，但絕不能位于3端。誘變引物的3區(qū)域(至少610 個堿基)必須與靶dna 完全互補以使引物與模板的退火完全而且taq 酶能延伸引物。pcr 反應(yīng)先在低特異性環(huán)境下反應(yīng)510 個循環(huán)以使錯配得以發(fā)生(即在松弛的溫度下)，一旦少量的突變模板產(chǎn)生，就可以作為靶序列與引物完全互補。擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物即是所需的含有突變的擴增dna 分子，然后通過克隆和序列分析進行確

39、證。53 用pcr 技術(shù)擴增目的dna 片段時，需要一對特意合成的引物來限定目的片段的擴增區(qū)域，試說明引物序列合成應(yīng)遵循什么樣原則。答：1）引物長度一般為1530 個核苷酸。2）引物的堿基盡可能隨機， g+c 含量一般占4555。tm4(g+c)+ 2(a+t)3）引物自身不應(yīng)存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4）兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其應(yīng)避免3端的互補重疊。5）引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不超過70，引物3末端連續(xù)8 個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。6）引物3端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板dna 配對。7）引物與模板結(jié)合時，引物的5端最

40、多可以游離十幾個堿基而不影響pcr 反應(yīng)的進行。8）引物的5端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點等。56怎樣將一個平末端的dna 片段插入到ecor i 的限制位點中去？答：可以化學(xué)合成一個連接子（linker），即一段長為lobp 含有ecor i 識別位點的短的dna 片段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用ecor i 切割這種連接片段，就會產(chǎn)生ecor i 的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何ecor i 的限制性核酸內(nèi)切酶位55taqman 定量 pcr 擴增的原理是什么？答：taqman 定量 pcr 使用3 個引物，或兩個引物和一個特異性探針。兩個引物接合到目的dna上下

41、游，以進行目的dna 的合成。第三個引物，或稱探針，是特異合成的一段短的dna 片段，可特異性第接合到一條dna 鏈中間。探針帶有兩個修飾基團，5端熒光報告基團（r）和3端的熒光淬滅基團（q），這兩個基團由于距離靠近會發(fā)生熒光淬滅而檢測不到熒光。隨著pcr 的進行， taqman探針接合到目的dna 序列上，并且被具有外切酶活性的taq dna 酶逐個切除而降解。被切下來的熒光基團（r）解除了熒光淬滅的束縛，會在激發(fā)光下發(fā)出熒光，因此所產(chǎn)生的熒光強度直接反應(yīng)了擴增靶dna 的總量。54pcr 技術(shù)體外擴增dna 分子的基本原理是什么？答：pcr 是在試管中進行的dna 復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)

42、細胞內(nèi)dna 半保留復(fù)制的機理，以及體外dna 分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈dna 變成單鏈，單鏈dna 與人工合成的引物退火，然后耐熱dna 聚合酶以dntp 為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈dna。pcr 全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。需要重復(fù)進行dna 模板解鏈、引物與模板dna 結(jié)合、dna 聚合酶催化新生dna 的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸個步驟構(gòu)成pcr 反應(yīng)的一個循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進行，就可使目的dna 得以迅速擴增。dna 模板變性：模板雙鏈dna®單鏈dna，94。退火：引物單鏈dn

43、a®雜交鏈，引物的tm 值。引物的延伸：溫度至70 左右， taq dna 聚合酶以種dntp 為原料，以目的dna 為模板，催化以引物末端為起點的53dna 鏈延伸反應(yīng)，形成新生dna 鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板pcr，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的dna 得到高效快速擴增。57構(gòu)建基因組文庫時為什么要對基因組dna 進行部分酶切（列舉至少兩條理由）答：部分酶切可獲得長度適宜的片段（如獲得中等長度的酶切片段）；部分酶切可保證切出的dna 片段內(nèi)部依然保留了部分限制酶位點，便于后續(xù)的克隆分析。58什么是基因組文庫(genomic library)它同遺傳學(xué)

44、上的基因庫有什么不同答：基因組文庫是用基因工程的方法，人工構(gòu)建的含有某一生物基因組dna 的各種片段的克隆群。包括下列過程：高分子質(zhì)量染色體dna 的制備；體外重組連接；將重組dna 導(dǎo)入寄主細胞并擴增；篩選?；蚪M文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念?；驇?gene poo1)是指在進行有性生殖的某一群體中，能進行生殖的個體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構(gòu)建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫、yac 文庫、bac 文庫等。61如何使用甲基化酶對克隆dna 進行保護有什么意義答：在構(gòu)建基因文庫時，可用與接頭中限制性內(nèi)切核酸酶相應(yīng)的甲基化酶對克隆dna 先

45、進行甲基化修飾，將插入片段上該酶可能的識別序列先行保護起來。意義：用這種方法，不僅保護了插入片段的大小不會改變，又有利于插入片段的回收，因為插入片段中特定限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點被保護起來，重組后可以用特定的限制性內(nèi)切核酸酶將插入片段回收。59什么是cdna 文庫同基因組文庫有何差別答：同mrna 互補的dna 稱為cdna。cdna 文庫是以某一生物的總mrna 為模板，在無細胞系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成一互補的dna，即第一鏈，破壞rna 模板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈，得到的雙鏈dna 稱為cdna。選用適合的載體，將合成的cdna 重組導(dǎo)入寄主細胞，經(jīng)篩選得到的cdna

46、 克隆群稱為cdna 文庫。由于cdna 技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。由于細胞內(nèi)的基因在表達的時間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時間性，有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cdna 文庫是不可能構(gòu)建得十分完全的，也就是說，任何一個cdna 文庫都不可能包含某一生物的全部編碼基因。cdna 文庫與基因組文庫的主要差別是：(1) 基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的dna 序列；cdna 文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因。(2) 基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響；cdna 文庫克隆的是不完全 的編碼dna 序列，因它受

47、發(fā)育和調(diào)控因子的影響。(3) 基因組文庫中的編碼基因是真實基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而cdna 克隆的是不含內(nèi)含子的基因。62何為稀有酶（舉例說明）答：所謂稀有酶是指那些識別序列在基因組dna 中不常見的酶，因此它們的切割頻率較低。如not i 就是最常用的稀有酶，它的識別序列為gcggccgc。另外有些酶的識別序列雖然不長，但它的識別序列很特別，在基因組出現(xiàn)的頻率較低。如nru i (tcgcga)和bssh ii (gcgcgc)，它們的靶序列在哺乳動物基因組中出現(xiàn)的頻率極低。60什么是同聚物加尾連接法 (homopolymer tails joining) 用何種方法加尾具有哪些優(yōu)缺點答

48、：所謂同聚物加尾法就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈dna 的3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源dna 和載體dna 分子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如da（dg）和dt（dc），然后在dna 連接酶的作用下，連接成為重組的dna。這種方法的核心是利用末端轉(zhuǎn)移酶的功能，將核苷酸轉(zhuǎn)移到雙鏈dna 分子的突出或隱蔽的3'-oh上。以mg2+作為輔助因子，該酶可以在突出的3'-oh 端逐個添加單核苷酸，如果用co2+作輔助因子，則可在隱蔽的或平末端的3'-oh 端逐個添加單個核苷酸。同聚物加尾法實際上是一種人工黏性末端連接法，具有很多優(yōu)點：首先不易自身環(huán)化，這是

49、因為同一種dna 兩端添加的序列是相同的，所以不存在自身環(huán)化；因為載體和外源片段的末端是互補的黏性末端，所以連接效率較高；用任何一種方法制備的dna 都可以用這種方法進行連接。同聚物加尾法也有一些不便之處：方法繁瑣；外源片段難以回收。由于添加了許多同聚物的序列，可能會影響外源基因的表達。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會產(chǎn)生某種限制性內(nèi)切核酸酶的切點。 ，68插入失活法和插入表達法篩選重組體的主要差別是什么？答：主要差別是：(1) 插入失活法是直接根據(jù)失活基因的表型變化來篩選重組體。(2) 插入表達法是根據(jù)一個基因的失活引起另一個基因的表達表型來選擇。66構(gòu)建表達

50、載體應(yīng)注意些什么？答：(1) 構(gòu)建表達載體的關(guān)鍵是用于表達克隆序列的啟動子類型，如果目的是基因的高效表達，就要選用強的啟動子；如果表達產(chǎn)物對寄主細胞有毒性，可選擇弱的啟動子，最好使用可誘導(dǎo)型啟動子，使在一定的條件下表達。(2)表達載體還應(yīng)具有以下組成元件： 攜帶能在寄主細胞中維持的復(fù)制的起始點。 具有抗生素選擇標記或其他選擇機制。 在緊接啟動子的下游安排限制性位點，用于插入需表達的基因。 具有單一的酶切位點來克隆基因，克隆位點應(yīng)位于準確的位置，以使克隆基因有效表達。67你在做southern 印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。根據(jù)方案，下面一個步驟是用naoh 溶液浸泡凝膠，使dna 變性

51、為單鏈。為了節(jié)省時間，你略過了這一步，直接將dna 從凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。然后用標記探針雜交，最后發(fā)現(xiàn)放射自顯影片是空白。錯在哪里？提示：轉(zhuǎn)移到膜上的dna 未變性成單鏈dna，不能與單鏈的探針雜交。如果你的雜交探針是雙鏈的，可能因為在加入雜交混合物之前忘記將探針變性而得到空白的放射自顯影結(jié)果。69一個攜帶有氨芐和卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒被僅在卡那霉素基因中有識別位點的ecor i 消化。消化物與酵母dna連接后轉(zhuǎn)化對兩種抗生素都敏感的e. coli 菌株。(1) 利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質(zhì)粒的細胞？(2) 怎樣區(qū)分接受了插入酵母dna 的質(zhì)粒的克??？提示：(1) 選擇ampr 的轉(zhuǎn)化

52、子；(2) 所需的克隆是ampr 和kans。任何能夠抗這兩種藥物的克隆都是自連的非重組質(zhì)粒。70用ecor i 和hind iii 分別切割同一來源的染色體dna，并進行克隆。在前者的克隆中篩選到a 基因，但在后者的克隆中未篩選到a 基因，請說明原因。提示：因為hindh i 的切點位于a 基因內(nèi)。71什么是western 印跡 它與southern 印跡有什么不同提示：western 印跡是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進行檢測。它與southern 印跡的不同在于探針的性質(zhì)不同，在western 印跡中使用的探針是抗體(蛋白質(zhì))，而southern 印

53、跡中使用的探針是dna。72用一限制性內(nèi)切核酸酶切割lac+ tetr 的質(zhì)粒載體，已知該酶識別的是4 個堿基序列，并產(chǎn)生有兩個堿基突出的單鏈末端，該酶在lac 基因內(nèi)有切割位點，并在第二個氨基酸密碼子內(nèi)，該位點可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用dna 聚合酶將單鏈末端補齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環(huán)，轉(zhuǎn)化lac- tet- 受體菌，篩選tetr 轉(zhuǎn)化子，問：lac 的基因型是什么？并說明原因。提示：基因型是lac，原因是在該密碼子中插入了兩個堿基，造成了移碼突變，所以lac 的基因是缺陷的。嚴謹雜交實驗是如何控制的？答：雜交反應(yīng)的嚴謹程度由下面兩個因素所決定：溫度和鹽

54、濃度。強的堿基對能耐受高的溫度，而高的鹽濃度使弱的堿基對間的配對變得穩(wěn)定。因此，高度嚴謹?shù)碾s交在高溫和低鹽濃度下進行，而低嚴謹型雜交在低溫和高鹽濃度下進行。73rna 與基因組dna 復(fù)性已被廣泛用于檢測不同類dna 的轉(zhuǎn)錄。dna 驅(qū)動的復(fù)性實驗與rna 驅(qū)動的復(fù)性實驗有何不同？答：在過量dna 雜交(dna 驅(qū)動雜交)實驗中，基因組dna 的復(fù)性過程中加入少量的放射性標記rna。因為dna 的量大大超過rna，所以全部rna 能夠與dna 雜交。同樣道理，rna 驅(qū)動的雜交反應(yīng)中rna 過量而dna 的量受到限制，所以所有的互補dna 鏈都能與rna 雜交。74在基因工程中，為了在細菌細胞

55、中表達真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用cdna 而不用基因組dna 為什么要在cdna 前加上細菌的啟動子答：這是因為細菌沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識別真核生物的啟動子的原因。75如何根據(jù)下面的應(yīng)用設(shè)計探針(1) 假定你分離純化了一未知功能的蛋白質(zhì)，需要確定是何種組織和細胞表達這種蛋白質(zhì)。(2) 假定你獲得了綿羊的胰島素mrna，如何進一步從人的cdna 文庫中獲得含人胰島素的克隆并使之在e. coli 中表達?提示：(1) 首先對該蛋白質(zhì)進行部分測序，然后根據(jù)測得的氨基酸序列設(shè)計簡并引物。(2) 以該mrna 為模板反轉(zhuǎn)錄，得到cdna，即可進行標記用作探針。76什么是遺傳學(xué)選擇法?答：

56、所謂遺傳學(xué)選擇法（genetic selection）主要是根據(jù)受體細胞接受了重組dna 分子后所發(fā)生的遺傳表型的變化直接選擇重組體的方法。遺傳表型的變化包括抗藥性、缺陷基因的功能互補表型及噬菌斑的變化等。選擇的方法主要是根據(jù)平板上可見的表型變化，用于選擇的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表達抗生素平板、顯色平板等，由于這些方法都是直接從平板上篩選，所以又稱為平板篩選法。77單鏈rna 作為探針，具有哪些單鏈dna 探針所沒有的優(yōu)點？答：單鏈rna 探針的下列優(yōu)點是單鏈dna 探針所沒有的：(1) rnarna 和rnadna 比dnadna 雜交體具有更高的穩(wěn)定性。因此，雜交

57、可以在更嚴格的各件下講行雜交后的信號也比較強。(2) 單鏈rna 由于不存在互補雙鏈的競爭性結(jié)合，所以雜交效率比較高。3) rna 中不存在重復(fù)序列，所以特異性比較高。(4) 雜交后可用rnase 消化掉未雜交的rna，因此降低了本底。78良好的固相支持物 (如硝酸纖維素濾膜、尼龍膜) 必須具備哪些優(yōu)良特性？答：(1) 同核酸分子具有較強的結(jié)合能力，一般要求每平方厘米結(jié)合核酸分子的量在10g 以上。(2) 與核酸分子結(jié)合后，不影響其同探針分子雜交的反應(yīng)。(3) 與核酸分子的結(jié)合牢固，能經(jīng)受得住雜交、洗滌等過程而極少脫落。(4) 非特異性吸附少，在洗膜條件下，能將非特異性吸附在其表面的探針分子洗脫。(5) 具有良好的機械性能，不宜破碎。16 簡述以黏粒為載體構(gòu)建基因文庫的原理。(1)cos位點可以自身環(huán)化(2)可以利用cos位點包裝l噬菌體顆粒；(3)可以感染寄主細胞；(4)利用質(zhì)粒復(fù)制子復(fù)制，不整合、不裂解。79以硝酸纖維素濾膜 (nitrocellulose filter membrane) 作為雜交的固相支持物具有哪些優(yōu)、缺點?答：優(yōu)點：(1) 硝酸纖維素濾膜具有較強的吸附單鏈dna 和rna 的能力，特別在高鹽溶液中，結(jié)合能力達到80100gcm2。(2) 雜交信號本底較低。由于硝酸纖維素濾膜非特異性吸附蛋白質(zhì)的能力較弱，因此特別適合于那些涉及蛋白質(zhì)