第九章RNA干擾與基因表達(dá)

1、第九章 RNA干擾與基因表達(dá)lRNA干擾（RNAi）概念：u內(nèi)源或外源雙鏈RNA（ds RNA）介導(dǎo)的同源mRNA的高效、特異性降解的現(xiàn)象。引起基因轉(zhuǎn)錄后沉默。第一節(jié) RNA干擾及其機(jī)制 一、RNAi的發(fā)現(xiàn)l真菌：基因消融l植物： PTGS（post-transcription gene silencing）l2001 science 10大科學(xué)進(jìn)展l美國(guó)科學(xué)家Andrew Fire and Craig C.Mello發(fā)現(xiàn)，獲2006年若獎(jiǎng)。二、干擾機(jī)制1.RNAi的起始階段：內(nèi)源或外源dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞，在dicer酶作用下切割為siRNA（21-23bp）2. RNAi的效應(yīng)階段： siR

2、NA介導(dǎo)靶mRNA的降解。3. RNAi循環(huán)放大階段：微量的dsRNA就可以使RNAi效應(yīng)遍及整個(gè)機(jī)體。dsRNA切割生成siRNA，siRNA以靶mRNA為模板，合成dsRNA。三、RNAi的特點(diǎn)1.RNAi是PTGS機(jī)制2.特異性：只特異降解與之匹配的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA。3.高效性：體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)表明，RNAi抑制基因表達(dá)具有很高的效率。4.dsRNA長(zhǎng)度的局限性： 一般不得短于21bp，長(zhǎng)鏈dsRNA也必須被dicer酶切割為21bp的siRNA。5.可傳播性：細(xì)胞之間可以長(zhǎng)距離傳遞。6.ATP依賴性7.穩(wěn)定性dsRNA和 siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)，比較穩(wěn)定8.快捷性：siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，

3、48h就能觀察到靶基因的抑制作用。第二節(jié) RNAi與基因沉默l事實(shí)上，siRNA對(duì)基因表達(dá)調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄水平，及轉(zhuǎn)錄后水平。l轉(zhuǎn)錄水平：包括RNA介導(dǎo)的DNA甲基化，異染色質(zhì)的形成，和DNA分子消融l轉(zhuǎn)錄后基因沉默是指siRNA在mRNA水平抑制靶基因的表達(dá)。一、轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGS）：mRNA轉(zhuǎn)錄尚未啟動(dòng)，siRNA分子通過(guò)修飾染色體DNA分子或與其結(jié)合的組蛋白，阻止轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。n誘導(dǎo)DNA甲基化n誘導(dǎo)異染色質(zhì)的形成nDNA分子消融u1.RNAi與甲基化傳統(tǒng)認(rèn)為RNAi只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，最近研究發(fā)現(xiàn)，siRNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)。RdDM（RNA dire

4、cted DNA methylation）：RNA指導(dǎo)的DNA甲基化。1994年，Wassengger在研究一種病毒感染煙草時(shí)發(fā)現(xiàn)。l在siRNA作用下，基因GC島中C和組蛋白H3的第9個(gè)lys發(fā)生甲基化，抑制基因表達(dá)。lRdDM是否具有普遍性？哺乳動(dòng)物的DNA分子甲基化滅活X染色體，可能就是一種RdDM現(xiàn)在。2.RNAi與異染色質(zhì)的形成線蟲中發(fā)現(xiàn)，RNAi來(lái)修飾染色質(zhì)，抑制基因表達(dá)。具體來(lái)講，是siRNA修飾組蛋白H3第9為lys殘基。組蛋白乙?；?，不能與DNA結(jié)合，基因活化；組蛋白去乙?；?，與DNA結(jié)合，基因表達(dá)受抑制。3.RNAi與DNA分子消融（elimination） 四膜蟲中最早發(fā)

5、現(xiàn)，siRAN介導(dǎo)異染色質(zhì)形成后，DNA分子會(huì)發(fā)生消融和重組。l二、轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（ PTGS）1.siRNA介導(dǎo)的RNAisiRNA能誘導(dǎo)靶mRNA降解導(dǎo)致基因沉默。分為啟動(dòng)、剪接、循環(huán)放大3個(gè)階段。2.miRNA介導(dǎo)RNAimiRNA是內(nèi)源性的，能與靶mRNA互補(bǔ)，抑制基因表達(dá)。1993年Lee等在一種線蟲中發(fā)現(xiàn)。pmiRNA的特點(diǎn)：廣泛分布，單鏈，長(zhǎng)度21-25bp，較長(zhǎng)的miRNA要被dicer切割。pmiRNA作用機(jī)制： miRNA是編碼基因指導(dǎo)合成。包括前體合成、微處理復(fù)合體識(shí)別和切割、轉(zhuǎn)運(yùn)、dicer酶切割、形成RISC（RNA-induced silencing comp

6、lex）、miRNP、與靶mRNA的互補(bǔ)。3.siRNA與miRNA的區(qū)別表9-1，（做詳細(xì)介紹）第三節(jié) RNAi的研究方法l一、siRNA的設(shè)計(jì)siRNA的反義鏈與作用的mRNA有嚴(yán)格的互補(bǔ)關(guān)系。siRNA只能與靶RNA高度同源性，與其他基因同源性盡可能低。siRNA正義鏈19bp要與靶mRNA相同，3端UU或dTdT。二、siRNA的制備l1.體外制備法：包括化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、dsRNA體外降解法。l2.體內(nèi)表達(dá)：轉(zhuǎn)染DNA模板在體內(nèi)表達(dá)。siRNA載體、siRNA表達(dá)框架在細(xì)胞中的表達(dá)。3. siRNA的導(dǎo)入磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、機(jī)械法第四節(jié) RNA干擾的應(yīng)用l一、研究基因功能 與基