雌激素對紫外線作用下人永生化角質形成細胞的保護作用

1、作者：仇金鵬 李澄 任明胡玉琳 佟倜 王艷【摘要】目的 探討雌二醇(17be2)對中波紫外線(uvb)照射下人永牛化角質形成細胞(hacat細胞)的保護作用。方法 將體外培養(yǎng)的hacat細胞隨機分為3組：正常組、uvb組、e2組，分別 加入不同的處理因素，uvb組在uvb燈下照射6 min后繼續(xù)培養(yǎng)，e2組 照射前預先給予17 be2使其終濃度達107 mol/l,正常組不加處理因素；照射結束后繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收集細胞，測定各組細胞的超氧 化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)水平以及細胞內鈣離子濃度和細胞 線粒體膜電位的變化。結果 與正常組比較，uvb組和e2組細胞線粒體 膜電位顯箸降低(

2、p<0. 05),細胞內鈣離子濃度顯箸升高(p<0. 05), sod 水平顯箸降低(p<0. 05), mda水平顯著升高(p<0. 05)；與uvb組相比 較，e2組細胞線粒體膜電位顯著升高(p<0. 05),細胞內鈣離子濃度差 別不顯著(p0. 05), sod水平顯著升高(p0. 05), mda水平顯著降低 (p<0. 05) o結論170e2可通過抗氧化和抗凋亡作用拮抗uvb引起的hacat細胞損傷，對uvb照射下的hacat細胞具有保護作用?！娟P鍵詞】17p 雌二醇；hacat細胞；中波紫外線(uvb)接觸過多的紫外線可以使人類的皮膚癌、白內障

3、等疾病的發(fā)病率升 高。紫外線可以通過損傷皮膚細胞dma,誘發(fā)自由基和細胞因子/炎癥 趨化因子的產生，產生脂質過氧化損傷對皮膚造成光損傷導致皮膚衰老 其至引發(fā)皮膚癌(13。雌激素作為一種當體類激素，可以通過影響 皮膚厚度、濕度、彈性、血管供應、色素沉著來阻止皮膚老化，在抗皮 膚衰老方面，有其獨到之處(4, 5，有研究表明雌激素可以抑制氧自 由基(ros)產生，減少氧化應激，具有一定的抗氧化和抗凋亡作用(6),然而對于雌激素對人角質形成細胞(hacat細胞)是否具有保護 作用，通過什么途徑進行保護還知之甚少。因此，本實驗預先用雌二醇(17be2)處理hacat細胞來觀察其對中波紫外線(uvb)照射

4、導致細胞損傷的影響，探討雌激素的作用機制，為研究皮膚光老化發(fā)生中17 b r2的作用提供實驗依據。1材料與方法1.1 材料與儀器rpmi1640培養(yǎng)基、胰蛋口酶(gibco,美國)、臺盼藍(amresco,美國)、mda試劑盒(南京建成)、dmso (sigma,北京鼎 國分裝，美國)、fac scan流式細胞儀(bection dickinson facscalibur,美國)、牛物顯微鏡(ch型，olympus,日木)、uvb燈(15w,上海顧村光電儀器廠)、fluo 3/am (biotium,美國)、羅丹明123 （sigma,美國）。1.2 方法1. 2. 1 細胞培養(yǎng)hacat細胞

5、在37°c、5%c02條件下培養(yǎng)于含10%標準胎牛血清 （fbs）的rpmt1640培養(yǎng)基中。當細胞融合至85%90%吋傳代，棄掉 培養(yǎng)液，pbs沖洗2遍，用0.25%胰酶常規(guī)消化，用含血清的培養(yǎng)液迅 速終止消化，制成單細胞懸液。細胞計數，按ix 105接種于100価培 養(yǎng)皿中備用。1.2.2 分組及處理當培養(yǎng)皿內細胞融合達60%左右時，將細胞隨機分為正常組、uvb 組、176 e2組。棄掉舊培養(yǎng)液，用高壓滅菌的pbs沖洗3遍后，正 常組和uvb組加入含1%fbs的10 ml rpmt1640培養(yǎng)液，17 b e2組加 入 5 u1 0. 2 mmol/l 雌激素+含 1%fbs 的

6、0 ml rpmt1640 培養(yǎng)液，放 培養(yǎng)箱屮繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄掉舊的培養(yǎng)液，用高壓滅菌的pbs沖洗3 遍，向每個平皿內加入4 ml pbs,使之能浸沒整個平皿底。uvb組和 17 b e2組打開平皿蓋在15 w的uvb燈正下方照射6 min,正常組細 胞用錫紙蓋住。照射后，立即棄掉平皿內pbs,加入4 ml 4°c預冷的 pbs沖洗3遍。之后加入rpmi1640培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收 獲各組細胞備用。1.2.3 細胞內鈣離子（ca2+ i）濃度測定將各組細胞常規(guī)消化后制成單細胞懸液，用pbs調整細胞訃數至 106個/ml。取含有5x105個細胞的懸液至1.5 ml微

7、量離心管屮；向 微量離心管中加入fluo 3/am ester （終濃度5 umol/l）,混勻； 在37°c孵箱中避光反應45 min后用pbs洗滌2次（1 500 r/min, 5 min）；在流式細胞儀（fcm）檢測，檢測條件為激發(fā)波長488 nm發(fā) 射波長530 miio1.2.4 細胞線粒體膜電位（屮m）測定各組細胞消化后制成單細胞懸液，用pbs調整細胞計數至106個 /mlo取含有5x105個細胞的上述細胞懸液至1.5 ml微量離心管中； 向微量離心管屮加入rhl23 （終濃度5 mg/l）,混勻；在37 °c孵箱屮 避光反應45 min后pbs洗滌細胞2次（1 500 r/min, 5 min）；在流 式細胞儀（fcm）檢測，檢測條件為激發(fā)波長488 nm發(fā)射波長530 nnio細胞中sod能清除超氧陰離子自由基(022),保護細胞免受損傷。受uvb照射后的細胞超氧陰離子自由基增高，細胞中sod對自由基 進行清除從而含量減少。022可氧化疑胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紫紅色，用可見光分光光度計測其吸光度。當被測樣品中含有 sod吋，則對0