生物化學實驗指導

1、實驗一實驗課題實驗一：氨基酸的分離鑒定紙層析法實驗類型綜合型對象生物技術(shù)本科實驗目的(含基本技能和實驗方法等)通過對氨基酸的分離，學習紙層析法的基本原理及操作方法。實驗難點理解并應用紙層析技術(shù)對氨基酸進行分析及鑒定。實驗方法實驗+示教課時安排20分鐘教學步驟一、實驗講解1.原理層析法又稱色譜法。1903年，發(fā)現(xiàn)用揮發(fā)油沖洗菊粉柱時，可將葉子的色素分成許多顏色的層圈。此后，把這種利用有色物質(zhì)在吸附劑上因吸附能力不同而得到分離的方法稱為色譜法（Chromatography）。雖然后來將色譜法應用于無色物質(zhì)分離，但是這個名字一直沿用下來。層析法除了吸附層析以外，還有離子交換層析和分配層析。一般認為紙

2、層析是分配層析中的一種，但也并存著吸附和離子交換作用。分配層析是利用不同的物質(zhì)在兩個互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而得到分離的。通常用表示分配系數(shù)。一個物質(zhì)在某溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)，在一定的溫度下是一個常數(shù)。紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析，濾紙纖維上的OH基具有親水性，因此能吸附一層水作為固定相，而通常把有機溶劑作為流動相。有機溶劑自上而下流動，稱為下行層析；自下而上流動，稱為上行層析。流動相流經(jīng)支持物時與固定相之間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相之間不斷分配而得到分離。顯然兩個物質(zhì)的分配系數(shù)差得越大，則越易分開。紙層析的實際操作是在濾紙的一端（通常距紙邊緣2厘米），點上樣品，干后，在密閉的容器

3、內(nèi)，待紙飽和了適當?shù)娜軇┱魵夂螅钊軇挠袠悠返囊欢私?jīng)過毛細管的作用，流向另一端，使樣品中的混合物得到分離。這種操作常稱單向?qū)游?。為了得到更好的分離，還可以作雙向操作或稱雙向?qū)游?。即在濾紙的一角上點樣品，先用一種溶系統(tǒng)展層后，使濾紙干燥，將紙調(diào)轉(zhuǎn)90°，再用另一個溶劑系統(tǒng)展層物質(zhì)分離后，層析點在圖譜上的位置，即在紙上的移動速率，用Rf表示。每一物質(zhì)的Rf值決定于該物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)（）和兩相的體積比（AS/AL）。這兩種相即是水（固定相）和有機溶劑（流動相）。兩相體積比在同一實驗情況下是不變的，所以Rf值的主要決定因素是分配系數(shù)（）。對于某一物質(zhì)在一條件下的值是固定的。因此Rf值

4、為其特征常數(shù)。現(xiàn)將影響Rf值的因素概括如下： (1)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響：極性物質(zhì)是易溶于極性溶劑（水）中，非極性物質(zhì)是易溶于非極性溶劑（有機溶劑）中，所以物質(zhì)的極性大小決定了物質(zhì)在水和有機溶劑之間的分配情況。例如酸性和堿性氨基酸極性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配較多，因此Rf低于后者。CH2基是疏水性基團，如果分子中極性基數(shù)目不變，則CH2基增加，整個分子的極性就降低，因此易溶于有機溶劑（流動相）中，Rf值亦隨之增加，例如氨基酸的Rf值：甘氨酸丙氨酸亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸谷氨酸。極性基團的位置不同也會引起Rf變化，例如在正丁醇-甲酸-水系統(tǒng)中層析時，-丙氨酸的Rf值大于-

5、丙氨酸。（2）溶劑的影響：同一物質(zhì)在不同溶劑中Rf值不同，選擇溶劑系統(tǒng)時應使被分離物質(zhì)在適當Rf值范圍內(nèi)（0.005到0.85之間），并且不同物質(zhì)的Rf至少差別為0.05才能彼此分開。溶劑的極性大小也影響物質(zhì)的Rf值。在用與水互溶的脂肪醇作為溶劑時，氨基酸的Rf值隨著溶劑碳原子數(shù)目增加而降低。（3）pH的影響：溶劑系統(tǒng)的pH會影響物質(zhì)極性基團的解離形式，例如氨基酸在酸性或堿性溶劑中變化如下：對于酸性氨基酸則在酸性時所帶凈電荷比堿性時少。帶電荷越少親水性越小，因此在酸性溶劑中Rf值較堿性中大。而堿性氨基酸則與此相反。借此性質(zhì)用酸相和堿相溶劑進行雙向?qū)游?，可使酸堿性不同的氨基酸達到分離的目的。溶劑

6、的pH還可影響有機溶劑（流動相）含水量，溶劑酸堿度大，則含水量多。對于極性物質(zhì)如（氨基酸）來說Rf值增加，非極性物質(zhì)則減少。若pH不適合，使同種物質(zhì)有不同解離形式，其Rf也略有不同，則此物質(zhì)層析呈帶狀圖譜。因此溶劑中的酸或堿的含量必須足夠，并且層析缸（或箱）中用酸或堿的氣體飽和才可以防止上述現(xiàn)象，使物質(zhì)得到圓點狀圖譜。 課時安排20分鐘（4）濾紙的影響：層析濾紙必須質(zhì)地均勻、緊密，有一定機械強度，并且雜質(zhì)較少，如紙中含有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金屬離子雜質(zhì)，可與氨基酸形成絡(luò)合物使層析圖譜出現(xiàn)陰影，可用稀酸（0.01molL1或0.4molL1HCl）洗滌濾紙除去之。（5）溫度的影響：溫度

7、不僅影響物質(zhì)在溶劑中的分配系數(shù)，而且影響溶劑相的組成及纖維素的水合作用。溫度變化對Rf值影響很大，所以層析最好在恒溫室中進行，控制溫度相差不超過±0.5。除上述因素影響Rf值外。樣品中含有鹽份和其他雜質(zhì)以及點樣過多均會影響樣品的有效分離。無色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法（紫外光照射）或顯色法鑒定，氨基酸層析圖譜常用茚三酮或吲哚醌作顯色劑。茚三酮顯色反應受溫度、pH、時間影響較大，如果要使實驗結(jié)果能很好重復，必須嚴格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會使氨基酸不易顯色，如含有大量鹽時顯色點上會出現(xiàn)白斑，此外空氣中的雜質(zhì)如氨、硫化氫或酚等都會影響顯色結(jié)果。銅離子可以與氨基酸-茚三酮顯色物形成

8、絡(luò)合物，顏色較穩(wěn)定。用硫酸酮乙醇溶液洗脫層析后的顯色斑點，借比色法可定量測定氨基酸含量。2.實驗器材及試劑（一）器材1.層析缸2.毛細管3.噴霧器4.層析濾紙5.直尺7.鉛筆8.吹風機（二）試劑擴展劑：4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物。將20毫升正丁醇和5毫升冰醋酸放入分液漏斗中，與15毫升水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏斗內(nèi)的擴展劑約5毫升置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒入培養(yǎng)皿中備用。氨基酸溶液：0.5%的A、B、C、D、E、F氨基酸溶液（可能為賴氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸）及一種氨基酸的混合液G（含有上述氨基酸的一種或幾種），各組份濃度均為0.5%。

9、顯色劑：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。課時安排70分鐘二、學生做實驗1.操作步驟（1）將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中。（2）取層析濾紙（長1820厘米，寬14厘米）一張。在垂直于紙的紋路一端距邊緣23厘米處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2厘米作一記號，作為點樣位置，并用鉛筆在點樣點下端寫出所點氨基酸的編號，剪掉層析端的兩個直角。（3）點樣：用移液器（或毛細管）將各氨基酸樣品分別點在所標位置上。電吹風吹干后再點一次，共點三次。每點在紙上擴散的直徑最大不超過3毫米（每次上樣量不要超過1uL）。（4）擴展：把點完樣品的層析濾紙放入層析缸內(nèi)，擴展劑的液面需低于點樣線1厘米。待溶劑上升15厘

10、米左右時即取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風機熱風吹干。（5）顯色：用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮丙酮溶液；然后置烘箱中烘烤5分鐘（100）或用熱風吹干即可顯出各層析斑點。（6）計算：取斑點中心，測量中心點到點樣點的距離和前沿線到點樣線的距離，計算結(jié)果。2.結(jié)果分析與討論各種氨基酸的Rf值（1）請根據(jù)所上表所提供的幾種氨基酸在正丁醇-乙酸溶液中的Rf值，鑒定出A、B、C、D、E和F氨基酸的名稱，并在層析結(jié)果上標出；（2）利用同樣的方法鑒定出混合氨基酸樣品G中氨基酸的種類及名稱，并同樣在層析結(jié)果上標出；（3）對這幾種氨基酸移動快慢的原因做出簡要分析；（4）將層析圖譜粘貼于實驗報告

11、并完成實驗報告。 3.實驗注意事項: （1）氨基酸的層析方向是順著濾紙紋路； （2）裁剪濾紙時一定要戴手套，避免手與濾紙的直接接觸防止汗液污染； （3）劃線時一定要使用鉛筆，禁止使用油性水筆； （4）點樣時要遵循“少量多次”原則，避免點樣過多導致層析條帶不易分析； （5）展層液要低于點樣位置1CM左右，切勿沒過點樣線； （6）測量時應選擇多次選擇中心點的位置，并取平均值。小 結(jié)對本節(jié)實驗主要內(nèi)容進行總結(jié)。實驗報告交完整實驗報告。實驗二實驗課題實驗二：酪蛋白的制備及蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定實驗類型綜合型對象生物技術(shù)本科實驗目的(含基本技能和實驗方法等)1、學習從牛奶中制備酪蛋白的原理和方法。2、掌握等電點

12、沉淀法提取蛋白質(zhì)的方法。實驗難點實驗方法實驗+示教課時安排20分鐘教學步驟一、實驗講解1.原理：牛乳中的主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點為4.7。利用等電點時溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純酪蛋白。2.雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180左右加熱，放出1個分子氨后得到的產(chǎn)物在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過1個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。3.考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)

13、濃度，是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。 考馬斯亮藍G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。考馬斯亮藍G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍G-250結(jié)合，在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1小時內(nèi)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)-染料復合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測定蛋白質(zhì)濃度時靈敏度很高

14、，可測微克級蛋白質(zhì)含量。2.材料、試劑與器具（一）材料 新鮮牛奶（二）試劑1、95%乙醇 200mL 2、無水乙醚 200mL 3、0.2mol/L pH4.7醋酸醋酸鈉緩沖液 300ml 先配A液與B液A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液 稱NaAC3H2O 54.44g，定容至2000ml。B液：0.2mol/L醋酸溶液，稱冰醋酸（含量大于99.8%）12.0ml定容至1000ml。取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸醋酸鈉緩沖液3000ml。4、乙醇乙醚混合液5、雙縮脲試劑：取0.75g硫酸銅和3.0g酒石酸鉀鈉溶于250ml蒸餾水，加入150ml 10%NaOH溶液

15、（可另加0.5gKI以防止Cu2+自動還原成一價氧化亞銅沉淀），用水稀釋至500ml。此試劑可以長期保存。6、考馬斯亮藍G-250蛋白試劑：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL7、10mg/ml蛋白溶液：取1.0gNaOH加入500ml蒸餾水中，配成0.05mol/lNaOH溶液。用.05mol/lNaOH溶液溶解0.25g酪蛋白，定容至25ml。乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）（三）器具1、離心機 2、抽濾裝置 3、精密pH試紙或酸度計 4、 電爐 5、燒杯 6、溫度計 7、天平 8、容量瓶 課時安排70分鐘二

16、、學生做實驗1.操作步驟（一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加熱至40。在攪拌下慢慢加入預熱至40、pH4.7的醋酸緩沖液100mL.用精密pH試紙或酸度計調(diào)pH至4.7。將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘（3000 r /min）。棄去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的純化1、用水洗滌沉淀 3次，離心10分鐘（3000r/min），棄去上清液。2、在沉淀中加入30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。3、將沉淀攤開在表面 上，風干；得酪蛋白純品。 4.準確稱重計算含量和得率（三）雙縮脲反應取10mg/ml酪蛋白溶于1ml

17、于試管中，加入4ml雙縮脲試劑，室溫下震蕩搖勻，顯色30分鐘后觀察前后顏色變化。（四）與考馬斯亮藍反應取10mg/ml酪蛋白溶液1ml于試管中，加入考馬斯亮藍1ml搖勻放置2min后觀察顏色變化。2.結(jié)果分析及討論（1）計算酪蛋白的率（2）觀察蛋白質(zhì)各種顯色反應前后的顏色變化。（3）列舉氨基酸的一些其它化學性質(zhì)。（4）完成實驗報告。小 結(jié)1、根據(jù)實際操作，以流程圖形式總結(jié)酪蛋的制備方法；2、合理分析實驗所得率3、學會利用雙縮脲和考馬斯亮藍完成蛋白質(zhì)性質(zhì)的鑒定實驗報告交完整實驗報告。實驗三實驗課題實驗三：還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法實驗類型綜合型對象生物技術(shù)本科實驗目的(含基本技

18、能和實驗方法等)1、掌握還原糖和總糖測定的基本原理2、學習比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計的使用。實驗難點實驗方法實驗+示教課時安排20分鐘教學步驟一、實驗講解1.原理還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，如乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則

19、被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計，在540 nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。2.實驗材料、試劑和器具（一）實驗材料：小麥面粉(1000 g)（二）試劑（1）1mg/mL葡萄糖標準液準確稱取80 烘至恒重的分析純葡萄糖100 mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，混勻，4冰箱中保存?zhèn)溆谩?（2）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試

20、劑3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.5 g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L氫氧化鈉溶液325 mL，再加入45 ml丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化鉀溶液：稱取5 g碘和10 g碘化鉀，溶于100 mL蒸餾水中。（4）酚酞指示劑：稱取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。（5）6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分別取59.19 mL 37 %濃鹽酸和24克NaOH定容至100mL） （三）器具（1）具塞玻璃刻度試管：20 mL×11 （2） 濾紙 （3）燒杯：100 mL

21、15;2 （4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2；10 mL×1 （7）恒溫水浴鍋 （8）煤氣爐 （9）漏斗 （10）天平 （11）分光光度計課時安排70分鐘二、學生做實驗1.操作步驟（一）標準曲線的繪制（二）樣品中還原糖和總糖的鑒定（1）還原糖的提取準確稱取3.00 g食用面粉，放入100 mL燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入50 mL蒸餾水，攪勻，置于50 恒溫水浴中保溫20 min，不時攪拌，使還原糖浸出。過濾，將濾液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至

22、刻度，即為還原糖提取液。（2）總糖的水解和提取準確稱取1.00 g食用面粉，放入100 mL三角瓶中，加15 mL蒸餾水及10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加熱水解30 min, 取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍色。水解畢。冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6 mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100 mL，過濾取濾液10 mL于100 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測定。（3）顯色和比色取4支20 mL具塞刻度試管，編號，按表2所示分別加入待測液和顯色劑，將各管搖勻，在沸水浴中

23、準確加熱5 min，取出，冷水迅速冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20 mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進行比色。調(diào)波長540 nm，用0號管調(diào)零點，測出710號管的光密度值。表2 樣品還原糖測定管 號 還原糖 總糖 蒸餾水（mL） DNS（mL） 光密度值 查曲線 平均值 待測液（mL） 待測液（mL） （OD540nm） 葡萄糖量（mg） 7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5 10 1 1 1.5 結(jié)果與計算計算出7、8號管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在標準曲線上分別查出相應的葡萄糖毫克數(shù)，按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量(以葡

24、萄糖計)。還原糖（%）=查曲線所得葡萄糖毫克數(shù)×提取液總體積×100測定時取用體積樣品毫克數(shù)總糖（%）=查曲線所得水解后葡萄糖毫克數(shù)×稀釋倍數(shù)×0.9×100樣品毫克數(shù)注意事項:標準曲線制作與樣品測定應同時進行顯色，并使用同一空白調(diào)零點和比色。面粉中還原糖含量較少，計算總糖時可將其合并入多糖一起考慮。2.結(jié)果分析及討論(1)在樣品的總糖提取時，為什么要用濃HCl處理？而在其測定前，又為何要用NaOH中和？(2)標準葡萄糖濃度梯度和樣品含糖量的測定為什么應該同步進行？比色時設(shè)0號管有什么意義？(3)完成實驗報告。小 結(jié)實驗報告交完整實驗報告。實驗

25、四實驗課題實驗四：油脂酸價的測定實驗類型綜合型對象生物技術(shù)本科實驗目的(含基本技能和實驗方法等)1.初步掌握測定油脂酸價的原理和方法； 2.了解測定油脂酸價的意義。實驗難點實驗方法實驗+示教課時安排20分鐘教學步驟一、實驗講解1.原理油脂在空氣中暴露過久，部分油脂會被水解產(chǎn)生游離脂肪酸和醛等物質(zhì)，并且這些物質(zhì)具有刺激性氣味，使油脂產(chǎn)生酸價。酸敗的程度使以水解產(chǎn)生的游離脂肪酸的多少為指標的，常以酸價或者是酸值來表示。同一油脂若酸價高，則說明水解產(chǎn)生的游離脂肪酸就多。酸價是指中和1g油脂中游離脂肪酸所需的氫氧化鉀的毫克數(shù)。酸價越高，油脂的質(zhì)量也越差。2.材料、試劑與器具（一）材料花生油、菜油、芝麻

26、油等；（二）試劑乙醇-乙醚混合液(1:1,V/V)；0.1 KOH（1克KOH溶于1000 mL純水中）（三）器具錐形瓶（250 mL）3個； 量筒（50 mL）1支；堿式滴定管1支。課時安排70分鐘二、學生做實驗（一）操作步驟1. 準確稱取12 g油脂于250 mL錐形瓶中。2. 在瓶內(nèi)加入乙醇乙醚混合液50 mL，充分振蕩，使油脂樣品完全溶解成透明溶液。待油樣完全溶解后，加入1酚酞指示劑35滴，立即用0.1 KOH標準溶液滴定至溶液成微紅色（放置30 S內(nèi)不褪色）為終點，并記錄用去的KOH的體積，并按下式進行計算。酸價2(V2-V1)/W V2 ：滴定油樣時耗用氫氧化鉀溶液的毫升數(shù) V1 ：滴定空白對照耗用氫氧化鉀溶液的毫升數(shù) W：油樣重(g)注：滴定過程中如出現(xiàn)混濁或分層，表明由堿液帶進水過多，乙醇量不足以使乙醚與堿溶液互溶。一旦出現(xiàn)此現(xiàn)象，可補加乙醇，促使均一相體系的形成。（二）結(jié)果分析及討論1、2、完成實驗報告。小 結(jié)實驗報告交完整實驗報告。實驗五實驗課題實驗五：脂肪酸碘值的測定實驗類型綜合型對象生物技術(shù)本科實驗