文獻譯文---發(fā)現(xiàn)一個新的香味等位基因以及功能標記在水稻香味研究中的應用

1、原文：Discovery of a novel fragrant allele and development of functional markers for fragrance in rice文獻譯文發(fā)現(xiàn)一個新的香味等位基因以及功能標記在水稻香味研究中的應用原文：Gene Mapping Related to Yellow Green Leaf in a Mutant Line in Rice (Oryza sativa L.)作者：Qiang He . Yong-Jin Park出處：Mol Breeding (2015) 35:217 DOI 10.1007/s11032-015-0

2、412-4摘要水稻的香味是由于第8染色體上編碼甜菜堿醛脫氫酶（Badh2）基因原有功能缺失造成的。已報道的Badh2基因是主要的香味性狀等位基因，該基因在第7外顯子有8bp堿基缺失。本研究新發(fā)現(xiàn)的一個功能等位基因，可以用于改善水稻香味品質。從30份水稻資源里分析Badh2基因序列，并利用295份水稻資源全基因組測序數(shù)據(jù)篩選Badh2基因多樣性。從這些測序數(shù)據(jù)中鑒定出7個等位基因，其中6個和前人報道的一致，剩下的1個是新定位出的等位基因（badh2-E12）。該新定位出的等位基因在第12外顯子存在3bp堿基缺失。針對7個等位基因中的6個設計了5個功能標記，并利用14個水稻品種檢驗這些標記的可用性

3、。結果表明這5個分子標記能區(qū)分水稻是否含有香味基因。FME12-3和FME14I在2個F2群體的表現(xiàn)，表明這兩個標記能作為功能標記。此外，這兩個標記和香味表型呈現(xiàn)共分離。這些標記可以用于Badh2基因多樣性研究和通過分子標記輔助選擇改良香稻品質。前言水稻是最重要的農(nóng)作物之一，全球大約一半人口以稻米為主食。近年來，由于香米優(yōu)良的香味品質，市場需求量急劇增長（Myint et al. 2012; Bradbury et al. 2005b）。高價和消費者的青睞使得香米生產(chǎn)國家越來越受重視（Shi et al. 2014; Shao et al. 2013）。從香米中鑒定出的揮發(fā)性成分已經(jīng)超過200

4、多種（Mahattanatawee and Rouseff 2014; Champagne 2008）。2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP)是香稻中的一個主要的揮發(fā)物，在很低濃度就能檢測出爆米花氣味（(Buttery et al. 1982; Mathure et al.2014; Mahattanatawee and Rouseff, 2014）。研究者和育種家在香稻選育過程中發(fā)展出多種香味檢測方法。其中，兩種常見的方法是谷粒咀嚼法和KOH浸泡法（Bradbury et al. 2005b; Sood and Siddiq, 1978）。但是這兩種方法需要大量勞動力，準確性也不高（Bradbur

5、y et al. 2005b）。研究表明，水稻香味品質是由13個顯性基因或者隱性基因或者QTLS控制的。Ahn、Yano、Tragoonrung等在第8染色體上定位出一個隱性香味基因fgr。Bradbury等（2005）報道fgr基因編碼第8染色體上編碼甜菜醛脫氫酶（Badh2）該基因與水稻香味直接有關，在第7外顯子上有8bp的堿基缺失。Chen等（2006）也在69kb區(qū)域內(nèi)定位出fgr基因，隨后克隆出該基因。不同的研究結果揭示fgr基因的突變導致BADH2蛋白功能喪失，這可能是造成水稻產(chǎn)生香味的原因（Bradbury et al. 2005a; Chen et al. 2006, 2008

6、）。而利用RNA干擾技術（RNAi）和轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）敲除fgr基因證實了這一點(Chen et al. 2008; Niu et al. 2008; Shan et al. 2013)。通常認為fgr基因編碼BADH2酶，和badh2基因是同一個。在Badh2基因被報道之后，引發(fā)了研究人員新的研究浪潮。首先，Shi等和Amarawathi等在2008年定位出新的Badh2等位基因，檢測到第2外顯子有7bp的堿基缺失和第8外顯子有7bp的堿基插入。Kovach等利用280份普通野生稻和242份栽培稻badh2測序數(shù)據(jù)，在第1、10、13、14外顯子新發(fā)現(xiàn)8個等位基因。

7、Shao等在2011年發(fā)現(xiàn)第4、5外顯子之間一個長達803bp的堿基缺失。隨后分別在第10外顯子發(fā)現(xiàn)一個SNP，在第2外顯子發(fā)現(xiàn)75bp的堿基缺失，在第4和5外顯子之間發(fā)現(xiàn)806bp的堿基缺失。Shi等(2014)在5 UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)3bp堿基缺失，啟動子中8bp堿基插入。最近，Ootsuka等（2014）在日本香稻地方品種中，在第1外顯子和第1內(nèi)含子之間發(fā)現(xiàn)一個SNP，作為剪接位點供體。對于Badh2基因功能的研究，較為廣泛。除使得水稻有香味外（Niu et al. 2008; Shan et al. 2013; Chen et al. 2008），該基因也與耐鹽性連鎖遺傳，后又在水稻高鹽處理

8、時發(fā)現(xiàn)與水稻減產(chǎn)有關（Fitzgerald et al. 2010）。通過對粳稻的badh2.1基因（第7外顯子8bp缺失）單一起源分析，Kovach等（2009）等認為badh2基因是馴化過程中選擇的基因。并進一步證實秈稻上的該等位基因來自于粳稻的基因滲入。對于badh2基因和香味的關系的理解，對鑒定香稻新等位基因意義重大。在重要的水稻資源中引入香味，將使得該水稻市場價值更高。對于水稻香味的研究，典型的做法是測定早期世代每株水稻幼苗是否有香味（Jin et al. 2010）。利用感官評價方法檢測水稻香味費時、費錢、可靠性不強。近來，氣相色譜質譜分析方法（GCMS）和電子鼻已經(jīng)用于水稻香味研

9、究中，可靠性更強。盡管這兩種方法成本更高，但育種家需要簡單有效的檢測方法。隨著各種DNA標記的高速發(fā)展，MAS的應用更加突出（Wang et al. 2011）。由于MAS的簡單準確，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛的用于水稻香味研究中。目前已經(jīng)開發(fā)了很多標記，用于香稻育種中。在已經(jīng)報道的17個badh2等位基因中，有7個是用MAS的方法檢測到的（(表1; Bradbury et al. 2005b; Shi et al. 2008, 2014; Sakthivel et al. 2009; Shao et al. 2011; Dissanayaka et al. 2014; Ootsuka et al. 201

10、4）。其中有5個被用于分離群體中香味的檢測。本研究中，我們準備從325份種質資源中篩選出新的等位基因，并開發(fā)功能標記便于香稻育種。材料和方法材料30份進行PCR擴增檢測供試品種如表S1所示，一共25個香稻，5個非香稻品種。另外的295份水稻種質資源進行了全基因組重測序。所有的這些種質資源于2012年種植在韓國國立公州大學試驗基地。2013年利用Dongji-wx和Mongdonjaerae（第12外顯子3bp堿基缺失）雜交得到的種子，于2014年播種為F2群體。另外一個F2群體是由非香稻品種和香稻品種A30（第14外顯子有1bp堿基插入）雜交獲得。香味鑒定葉片香味鑒定由一組香味鑒定員參照Soo

11、d和Siddiq等（1978）提出的方法進行，取2克左右嫩葉，剪成碎片放入15mL離心管, 加入1.7%KOH 溶液10 mL混勻。30水浴10分鐘，之后多人評價香味的有無。Badh2基因分析采用Shi等（2008）設計的10對引物，進行30份種質資源Badh2基因的全序列擴增。利用HiSeq 2000和HiSeq 2500用進行其余的295份種質資源的全基因組重測序，測序深度設置為9X，并參照國際水稻基因組測序計劃IRGSP-1.0數(shù)據(jù)進行全基因組序重測序獲得的數(shù)據(jù)，用于篩選295份種質資源的Badh2多態(tài)性差異。采用平均大于3X 的覆蓋度，檢測Badh2、SNPs、InDels。參照Dol

12、ye(1991)的CTAB法用水稻的葉片提取DNA。除了Badh2基因的第14外顯子特異性插入CAPS標記，是通過Primer v. 5.0（Lalitha2000）和NEBcutter v. 2.0 在線工具（ v. 5.0設計開發(fā)的。采用20mL PCR擴增體系，各組分是10 mM TrisHCl，50 mM KCl, 0.1 % Triton X100（聚乙二醇辛基苯基醚）, 1.8 mM MgCl2, 0.1 mM dNTPs, 0.2 mM primers, 1 U Taq DNA聚合酶, 50 ng DNA模板。由于第2外顯子GC含量較高，因此每10mL加入1mL的DMSO（二甲基

13、亞砜）。用Thermal Cycler S1000型PCR儀，程序為94 5min，5061 30s，72 1min，30個循環(huán)。之后72 10min進行擴增。每mg DNA加1U BslI內(nèi)切酶，55溫浴1h以消化PCR產(chǎn)物。 FME2-7、EME7和FME14I引物標記的PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠分離，而FMU1-2和FME12-3產(chǎn)物則經(jīng)6% PAGE變性膠分離。 結果水稻香味等位基因的鑒定對照香味鑒定結果（表2），發(fā)現(xiàn)30份種質資源中有25份有香味，剩下5份沒有香味。另外的295份水稻種質資源中有13份是有香味的。30份種子資源中，一共使用了10份重疊PCR引物用來擴增Badh2序列。

14、共檢測到5個等位基因（圖S1, 表2，注：表格里是6個）。在25份檢測到香味基因的材料中，有13份是在第7外顯子上有8bp缺失，3份是第2外顯子有7bp缺失，3份是在第13外顯子處有個C/T突變SNP位點。2份是在第13外顯子有2bp的堿基插入，還有2份是第14外顯子有1bp的堿基插入。這些和前人的報道是一樣的。另外首次在2份材料中同時檢測到兩個突變，即在第7外顯子存在8bp的堿基缺失和5 UTR區(qū)有3bp堿基缺失。我們從295份種子資源重測序數(shù)據(jù)中鑒定到一個新的badh2等位基因（未發(fā)表），有9份在第7外顯子出現(xiàn)8bp堿基缺失，3份第13外顯子處有個C/T突變SNP位點。并在韓國地方品種Mo

15、ngdonjaerae中發(fā)現(xiàn)一個新的香味等位基因，有3bp的堿基缺失導致一個氨基酸的丟失，這使得水稻有香味（圖 S2）。香味標記的應用針對5 UTR區(qū)3bp堿基缺失、第2外顯子7bp的堿基缺失、第7外顯子8bp的堿基缺失、第13外顯子3bp堿基插入，我們設計了幾對功能標記；同時，針對第14外顯子的1bp堿基插入，設計了1個CAP標記。對于新發(fā)現(xiàn)的等位基因badh2-E12，我們根據(jù)側翼序列設計了幾對標記。并根據(jù)PCR產(chǎn)物多態(tài)性最好的標記，選出最佳的引物。4對引物用來鑒定4個已知的等位基因。其中，有針對5 UTR區(qū)3bp堿基缺失的FMU1-2，第2外顯子7bp堿基插入的FME2-7，第7外顯子8

16、bp堿基缺失的FME7-1、的第14外顯子3bp堿基插入的FME14I。 針對新的等位基因，我們使用最佳的引物FME12-3進行檢測第12外顯子上3bp堿基插入情況。該引物標記也能檢測第13外顯子3bp堿基缺失情況。此外，F(xiàn)ME12-3引物也能擴增第13外顯子3bp堿基插入到第12外顯子3bp堿基缺失這142bp堿基大小的區(qū)間（表3，圖1）。FMU1-2引物在香和非香水稻DNA PCR擴增產(chǎn)物分別是160bp、163bp大小。FME2-7和FME7則分別是71bp、78bp和143bp、151bp大小。而FME14I引物則是266bp、265bp大小。經(jīng)過Bsll酶消化，非香水稻PCR產(chǎn)物片段

17、是205bp和 60bp，香稻則仍是266bp大小。FME12-3引物對12外顯子等位基因（badh2-E12）擴增的PCR產(chǎn)物在香和非香品種中為189bp、192bp大小，對13外顯子等位基因（badh2-E13）則是195bp、192bp大小（表3，圖1）。F2群體基因型表現(xiàn)5個功能標記用于14個種質資源的基因型分析，其中包括2個第1外顯子7bp缺失，2個第7外顯子8bp缺失，2個第7外顯子8bp缺失和5 UTR端3bp缺失，2個13外顯子3bp插入，2個14外顯子1bp插入，1個12外顯子3bp缺失，3個是所有這些都有的。所有種質資源都能被對應功能標記區(qū)分是否含對應的等位基因（圖1）。F

18、ME14I和FME12-3標記分別用于分析F2群體（非香×Ar-30（含等位基因badh2-E14）的每個單株基因型，以及Dongjin-wx (野生型) 和Mongdonjaerae (第12外顯子3bp堿基缺失)的基因型。分析F2群體時，每個家系取13個單株。只有1個單株是1bp的堿基插入，8個單株是雜合型的，4個單株是野生型的。1bp的堿基插入的單株有香味，其他的都沒有香味（圖2a）。對于“Badh2×badh2-E12”的F2群體，由帶型可知，兩個株系是3bp堿基缺失，7個是有兩條帶的雜合型，4個是野生型（圖2b）。3bp堿基缺失的個體有香味，其他的則沒有。結果表明

19、，badh2基因是控制水稻隱性香味性狀的基因。討論隨著遺傳和基因組學分析工具的引進，水稻育種已進入基因組學的時代。許多表型的遺傳變異情況，可以通過各種分子標記技術和單核酸改變來解釋。為剖析復雜的農(nóng)藝性狀和品質性狀的自然變異，QTLs和分子遺傳連鎖圖譜受到廣泛關注。但是，QTL標記只能專用于特定的群體。而根據(jù)特定性狀能穩(wěn)定遺傳的基因序列設計的功能標記是另一種選擇。這種標記能夠用于任何親本和任何雜交，標記-性狀關聯(lián)分析方法已被證實可以用于分離群體(Jin et al.2010)。育種過程中，高效的從分離群體中選擇目標性狀的個體是很重要的。如果育種家能加快育種進程、縮短育種年限，這無疑更能節(jié)省時間和

20、成本。很不幸的是，目標性狀（如產(chǎn)量、食味品質等）往往體現(xiàn)在谷粒上。谷粒相關性狀要在收獲種子后才能考察，但相對的時間也就過了一季。只能在下一個開花期，進行回交，這減緩了育種進度。分子標記輔助選擇育種（MAS）具有省時、簡化水稻育種過程等優(yōu)點，能在一個相當短的周期里將一個重要的等位基因導入到優(yōu)良的家系中。Wang等（2010）利用高產(chǎn)粳稻武香粳14武香粳14號和低直鏈淀粉和透明度高的優(yōu)質粳稻關東194雜交，通過用一個能區(qū)分含Wx-mq純合基因型或不含的雜合基因型的CAPS標記，歷時9年育成一個新品種南粳46。Shi等（2008）的研究表明，盡管水稻中被檢測到的香味揮發(fā)成分超過114種，但是其中香味

21、的主要成分是2-AP。常用的水稻香味鑒定方法是咀嚼法、KOH浸泡法和熱水法，但是這些方法都取決于測試人員的感覺。當2-AP的濃度較低或是需要同時檢測大量的樣品時，傳統(tǒng)的方法對于2-AP定性或定量檢測的可靠性就不高，效率也低。由于香稻較高的的經(jīng)濟價值和特有的香味，盡管在許多分離群體中選育目標個體很困難，但是育種學家們還是用傳統(tǒng)的方法選育出一些優(yōu)質香稻品種（Siddiq et al. 2012）。正如前面討論的，MAS可以使得育種家在短時間內(nèi)選育出目標性狀材料。幸運的是，水稻的香味基因Badh2已經(jīng)被Bradbury等（2005）克隆出。在非香的水稻中編碼BADH2的基因是完整的Badh2基因，能

22、夠抑制2-AP的合成。與之相對的是，隱性等位基因badh2導致香味物質2-AP的積累，致使水稻產(chǎn)生香味(Chen et al. 2008)。因此，通過設計隱性等位基因badh2的功能標記，能夠提高香稻育種效率。badh2基因導致BADH2原有功能喪失，致使水稻產(chǎn)生香味。因此，Badh2基因任何突變都會產(chǎn)生一個新的等位基因badh2。Shan等（2013）通過TALEN技術敲除非香水稻的Badh2基因，獲得一份香稻材料。功能等位基因可作為香稻的選育工具。在本研究中，我們從5份非香水稻和25份香稻的序列設計了10對引物。從25份水稻資源中鑒別出6個等位基因，其中5份與前人研究一致(Bradbury

23、 et al.2005a; Shi et al. 2008, 2014; Shao et al. 2011; Kovach et al. 2009)，新發(fā)現(xiàn)一個等位基因badh2-UTR-7（表2）。2012年到2014年，295份水稻資源進行了全基因組重測序（未發(fā)表）。同時，也從全基因組重測序數(shù)據(jù)中篩選Badh2基因的序列。我們從Mongdonjaerea中新鑒定一個等位基因badh2-E12，該等位基因在第12外顯子處有3bp堿基缺失（表2）?？偟膩碚f，從我們的材料中鑒定到7個等位基因（表2，圖S1）。Shi等（2008）針對badh2-E2 、badh2-E7以及從分離群體中已確定的共分

24、離標記，開發(fā)了一些功能標記。針對badh2-E14設計的CAPS標記引物，用于篩選共分離群體中香稻資源（Dissanayaka et al. 2014）。Shi等（2014）研究發(fā)現(xiàn)5UTR有3bp的堿基缺失。但這些研究都沒有針對這些位點設計功能標記，除了在badh2基因啟動子上游有8bp堿基的插入。本研究中，針對6個等位基因（除badh2-E13.2，表3）開發(fā)了5個功能標記。這5個標記都能鑒別水稻是否含香味基因（圖1）。此外，在確認了FME12-3和FME14I標記在分離群體中的功能，而且兩個標記和表型完美的呈現(xiàn)共分離。所有的這些功能標記對于Badh2基因多樣性研究，分子標記輔助選擇育種改

25、良的香稻種質有著重要意義。文中所有圖表如下所示：表1 Badh2外顯子多態(tài)性研究情況等位基因區(qū)域序列差異標記分離檢測參考文獻badh2-p-5UTR5端非編碼區(qū)3bp缺失N-Shi et al. (2014)badh2-E1.1第1外顯子2bp缺失N-Kovach et al. (2009)badh2-E1.2第1外顯子、1內(nèi)含子之間G/A snpYYOotsuka et al. (2014)badh2-E2.1第2外顯子7bp缺失YYShi et al. (2008)badh2-E2.2第2外顯子75bp缺失N-Shao et al. (2013)badh2-E4-5.14、5外顯子之間80

26、6bp缺失N-Shao et al. (2013)badh2-E4-5.24、5外顯子之間803bp缺失YNShao et al. (2011)badh2-E7第7外顯子8bp缺失YYBradbury et al. (2005a, b),Shi et al.(2008)badh2-E8第8外顯子7bp插入N-Amarawathi et al. (2008)badh2-E10.1第10外顯子1bp插入N-Kovach et al. (2009)badh2-E10.2第10外顯子1bp缺失N-Kovach et al. (2009)badh2-E10.3第10外顯子G/T snpN-Kovach

27、et al. (2009)badh2-E10.4第10外顯子G/A snpN-Shao et al. (2013)badh2-E12第12外顯子3 bp缺失YYabadh2-E13.1第13外顯子3 bp插入YYKovach et al. (2009)badh2-E13.2第13外顯子C/T snpN-Kovach et al. (2009)badh2-E14.1第14外顯子1bp插入YNKovach et al. (2009)badh2-E14.2第14外顯子G/T snpN-Kovach et al. (2009)a本研究中的發(fā)現(xiàn)表2 本研究中各等位基因的表現(xiàn)等位基因序列差異樣品編號香味5

28、UTR 3bp缺失第2外顯子7bp缺失第7外顯子8bp缺失第12外顯子3bp缺失第13外顯子3bp插入第13外顯子C/T SNP第14外顯子1bp插入Badh2aA01A05badh2-UTR-E7A09, A10badh2-E2A06, A07, A08badh2-E7A11A23, RWG-042, RWG-061,RWG-064, RWG-069, RWG-179,RWG-201, RWG-236, RWG-272,RWG-295badh2-E12RWG-031badh2-E13A24, A25badh2-E13.2A26, A27, A28, RWG-088, RWG-191, WG-

29、197badh2-E14A29, A30/：是/否 a野生型表3 開發(fā)設計的badh2-UTR-E7, badh2-E2, badh2-E7, badh2-E12, badh2-E13, badh2-E14標記信息等位基因功能標記引物序列退火溫度酶處理PCR產(chǎn)物大小（非香/香）badh2-UTR-E7FMU1-2F: TCCCACCACCACTCCACA61-163/160R: ACGAAGAGCTGCCGCTGCbadh2-E2FME2-7F: ACGAAGAGCTGCCGCTGC61-78/71R: GCGATTGCGCGGAGGTACTbadh2-E7FME7F: TCCTGTAATCA

30、TGTATACCC50-151/143R: AATTTGGAAACAAACCTTbadh2-E12 FME12-3F: TTGGTCCAGTGCTCTGTGTG58-192/189R: GCACCAGCCAGACCATAACbadh2-E13 FME12-3F: TTGGTCCAGTGCTCTGTGTG58-192/195R: GCACCAGCCAGACCATAACbadh2-E14FME14IF: TCGATGCCGGAATTATCTGGGTGA61BSlI60,205/266R: TCCCCACGGCTCATCGGAGG表S1 本研究所用材料清單（略）圖1 5個功能標記在9個香稻和3個非香品種中的表現(xiàn) 1-3為非香的野生型，沒有香味。4-5含badh2-UTR-E7基因；6-7含badh2-E2標基因；8-9含ba