LncRNA芯片分析-自己總結(jié)

1、· lncRNA芯片分析lncRNA芯片分析 修改時(shí)間2010/6/16 13:57:12 點(diǎn)擊3210次  1. 歸一化       lncRNA芯片采用的歸一化的方法為quantile normalization。 2. 差異LncRNA的篩選       lncRNA芯片中既有l(wèi)ncRNA的探針又有mRNA的探針，分別做差異基因的篩選，篩選方法同表達(dá)譜的篩選方法是一致的，參見表達(dá)譜的差異基因篩選。 3. 差異lncRNA的重注釋    &#

2、160;  lncRNA芯片注釋不完善，因此需要將篩選出來的lncRNA進(jìn)行重注釋。將差異lncRNA在基因組上位置上下游延伸，以尋找lncRNA附近的有功能的基因。 差異lncRNA重注釋示例 4. 差異lncRNA靶基因的預(yù)測(cè)       lncRNA可能通過調(diào)控相應(yīng)的mRNA發(fā)揮功能，因此有必要預(yù)測(cè)lncRNA的靶基因。我們提取差異lncRNA和mRNA的序列，首先用blast進(jìn)行初篩，之后用RNAplex進(jìn)行進(jìn)一步篩選，以預(yù)測(cè)lncRNA可能調(diào)控的mRNA。 差異lncRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果示例 5. 差異lncRNA與靶基因共

3、表達(dá)網(wǎng)絡(luò)       預(yù)測(cè)出lncRNA的靶基因后，并可進(jìn)一步在mRNA的數(shù)據(jù)中探尋該mRNA是否發(fā)生表達(dá)量的變化。由此構(gòu)建差異lncRNA與靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。 差異lncRNA與靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。方框代表lncRNA，圓形代表mRNA。連線表示可能的調(diào)控關(guān)系。節(jié)點(diǎn)面積越大，表示調(diào)控的mRNA越多，預(yù)示該lncRNA在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所起的作用可能越大。 6. 差異lncRNA與差異mRNA的共表達(dá)分析       SBC Human lncRNA芯片能同時(shí)檢測(cè)出差異表達(dá)的lncRNA和mRN

4、A。我們將差異lncRNA和差異mRNA在一組樣品中進(jìn)行共表達(dá)分析，可以發(fā)現(xiàn)與某個(gè)lncRNA具有相同表達(dá)模式的mRNA。       要求：每組數(shù)據(jù)3個(gè)或3個(gè)以上生物學(xué)重復(fù) 實(shí)驗(yàn)組： 對(duì)照組： lncRNA與mRNA共表達(dá)分析作用圖，圓形帶圈代表lncRNA，圓形代表mRNA。紅色為上調(diào)基因，綠色為下調(diào)基因。  7. 差異lncRNA靶基因的GO analysis       對(duì)lncRNA的靶基因進(jìn)行GO Ontology的生物學(xué)的分類，根據(jù)Fisher's Exact T

5、est,得到p-value，得到lncRNA靶基因?qū)?yīng)的顯著性功能，從而了解lncRNA的功能。 8. 差異lncRNA靶基因的pathway analysis       對(duì)lncRNA靶基因按照Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫KEGG和Biocarta來進(jìn)行分類，對(duì)Pathway中的基因進(jìn)行基于離散分布的顯著性分析，得到與實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠酗@著聯(lián)系的Pathway 分類,由這些pathway對(duì)應(yīng)相應(yīng)的靶基因，從而獲得該分類即導(dǎo)致lncRNA差異的最重要Pathway。 9. 差異lncRNA的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)    

6、60;  提取lncRNA TSS的上游2000bp，下游500bp,利用HMM的算法根據(jù)TRANSFAC8.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄因子。  1) 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，預(yù)處理及均一化處理。2) 差異表達(dá)lncRNA及mRNA 的篩選：根據(jù)客戶提供樣本量的大小與分布或?qū)嶒?yàn)?zāi)康?，?yīng)用倍數(shù)法、多重假設(shè)檢驗(yàn)等手段，對(duì)兩條件或多條件下的表達(dá)差異的lncRNA和mRNA分別進(jìn)行計(jì)算和篩選。 表達(dá)模式聚類分析：針對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行樣本及差異表達(dá)lncRNA和mRNA的聚類，尋找屬于同一表達(dá)趨勢(shì)的基因或樣本。 GO和pathway顯著性富集分析：差異基因，應(yīng)用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集分析

7、，挖掘具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因的功能類別。顯著性P值越小，則它隨機(jī)聚集差異表達(dá)基因的概率越小，其功能相關(guān)性的非隨機(jī)性就越小，該功能模塊有較大的可能與疾病（或藥物作用） 相關(guān)。 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析：研究與指定蛋白質(zhì)相互作用的其他蛋白質(zhì)的信息，以使研究人員能夠更加深入地認(rèn)清相關(guān)蛋白質(zhì)的功能，更清楚地理解其調(diào)控機(jī)制。3) lncRNA-mRNA共表達(dá)分析：對(duì)于每一個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，計(jì)算得到與之共表達(dá)的編碼基因。4) lncRNA表達(dá)模式分析：考察差異表達(dá)LncRNAs 的表達(dá)模式，將LncRNAs 以及與該LncRNAs 顯著共表達(dá)的編碼基因的表達(dá)模式繪制heatmap。5) lncRN

8、A功能預(yù)測(cè)：篩選出表達(dá)顯著相關(guān)的lncRNA-mRNA 關(guān)系對(duì)，利用成熟的mRNA 的功能來推導(dǎo)lncRNA 的功能，對(duì)異常表達(dá)lncRNA 顯著相關(guān)的mRNA 進(jìn)行功能富集分析。6) lncRNA cis作用機(jī)制研究：對(duì)于感興趣的差異表達(dá)lncRNAs，搜索其上下游100K范圍內(nèi)的所有編碼基因，并與該lncRNAs 有顯著共表達(dá)的基因取交集。這些在基因組上臨近、且表達(dá)模式上共表達(dá)的基因很可能被該lncRNAs 所調(diào)控。7) lncRNA trans作用機(jī)制研究：計(jì)算LncRNAs 共表達(dá)的編碼基因，集合與轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)調(diào)控復(fù)合物的靶基因集合的交集，利用超幾何分布計(jì)算該交集的富集程度，得到與

9、lncRNAs 顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而識(shí)別可能與lncRNAs 聯(lián)合發(fā)揮調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)調(diào)控因子。 lncRNA-轉(zhuǎn)錄因子二元關(guān)系及網(wǎng)絡(luò)分析 lncRNA-轉(zhuǎn)錄因子-靶基因三元關(guān)系及網(wǎng)絡(luò)分析綜述長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA） 來源: 新藥篩選中心   /點(diǎn)擊: 1464lncRNA長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白的RNA 分子，長(zhǎng)度在200bp 以上，起初被認(rèn)為是RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能；近期的研究表明lncRNA 具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以與蛋白、DNA 和RNA 相互作用，參與多

10、種生物學(xué)過程的調(diào)控，尤其在腫瘤當(dāng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控角色，如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活和抑制、轉(zhuǎn)錄后調(diào)解以及作為miRNA 的誘導(dǎo)分子干擾基因的表達(dá)等。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的lncRNA 被注釋，但是絕大多數(shù)的lncRNA 的功能仍然不清楚，因此lncRNA 的研究是一片非常廣闊的未知領(lǐng)域，具有極大的研究?jī)r(jià)值和意義。 lncRNA介紹長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。lncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。然而，近年來的研究表明lncRNA能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后

11、水平上調(diào)控基因表達(dá)，參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治都有著密切聯(lián)系。為何細(xì)胞不惜耗費(fèi)能量對(duì)這些非編碼RNA的表達(dá)和定位進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控呢？這些RNA分析究竟有何功能？RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使人們得以初窺這一神秘分子，現(xiàn)在lncRNA的許多相關(guān)信息都可以再新數(shù)據(jù)庫中查到，例如Broad研究所、哈佛大學(xué)和麻省理工共同開發(fā)的Human Body Map lincRNAs catalog。雖然近年來關(guān)于lncRNA的研究進(jìn)展迅猛，但是現(xiàn)在人們了解到的lncRNA只是冰山一角，絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的

12、。隨著研究的推進(jìn)，各類lncRNA的大量發(fā)現(xiàn)，lncRNA的研究作為RNA研究的新領(lǐng)域，已經(jīng)成為一個(gè)非常吸引人的方向，有待廣大科學(xué)家去探尋。lncRNA研究當(dāng)前面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是，研究工具還在不斷開發(fā)和改進(jìn)中，而lncRNA研究中非常關(guān)鍵的一步就是發(fā)現(xiàn)與特定疾病相關(guān)的lncRNA?，F(xiàn)階段，基因芯片技術(shù)發(fā)展趨于成熟穩(wěn)定，在此平臺(tái)上，通過設(shè)計(jì)不同檢測(cè)lncRNA探針篩選lncRNA是一種準(zhǔn)確快捷的方法。  lncRNA特征lncRNA通常較長(zhǎng)，具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，有些具有poly(A)尾巴，有些沒有poly(A)尾巴，分化過程中有動(dòng)態(tài)的表達(dá)與不同的剪接方式，與編碼基因相比，l

13、ncRNA表達(dá)量更低。 組織特異性：不同組織之間的lncRNA表達(dá)量不同。 時(shí)空特異性：同一組織或器官的不同生長(zhǎng)階段，其中的lncRNA表達(dá)量也會(huì)變化。 lncRNA啟動(dòng)子同樣可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，如Oct3/4，Nanog，CREB，Sp1，c-myc，Sox2與p53，局部染色質(zhì)組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結(jié)構(gòu)特征。 大多數(shù)的lncRNA在組織分化發(fā)育過程中，都具有明顯的時(shí)空表達(dá)特異性，如有人針對(duì)小鼠的1300個(gè)lncRNA進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在腦組織中的不同部位，lncRNA具有不同的表達(dá)模式。 在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達(dá)方式。 lncRNA的亞細(xì)胞位置上也呈多樣化，在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)

14、胞器均有分布，甚至某些lncRNA具有獨(dú)特的亞細(xì)胞位置，有可能是全新的亞細(xì)胞構(gòu)成。    lncRNA功能 lncRNA可從染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后加工等多種層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控：a) lncRNA通過招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物至特定的基因組位點(diǎn)使其發(fā)生催化活性。如HOTAIR21，Xist、RepA和Kcnqot1招募Polycomb complex至HoxD位點(diǎn)，使得X染色體或Kcnq1功能域的組蛋白H3 第27位賴氨酸發(fā)生3甲基化（me3K27），誘導(dǎo)異染色質(zhì)形成，從而抑制該區(qū)域基因表達(dá)。b) lncRNA通過多種機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。

15、lncRNA結(jié)合到基因cyclin D1上，招募RNA結(jié)合蛋白TLS來調(diào)控蛋白CBP和p300的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)而抑制cyclin D1轉(zhuǎn)錄。c) 超保守增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄出lncRNA-Evf2，該lncRNA能激活轉(zhuǎn)錄因子DLX2，進(jìn)而調(diào)控基因Dlx6轉(zhuǎn)錄。d) DHFR次要啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄出的lncRNA與該基因主要啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合形成三聚體，抑制轉(zhuǎn)錄因子TFIID結(jié)合，從而使基因DHFR發(fā)生沉默。e) 反義lncRNA能夠與剪接體（splicesome）中鋅指同源mRNA Zeb2的5'剪切位點(diǎn)結(jié)合，使內(nèi)含子未被剪切掉，而該內(nèi)含子序列中保留有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRE位點(diǎn)），翻譯過

16、程中識(shí)別并結(jié)合該位點(diǎn)，導(dǎo)致Zeb2基因表達(dá)和翻譯。 lncRNA分子機(jī)制隨著lncRNA功能逐步顯現(xiàn)，其與靶點(diǎn)的作用機(jī)制成為進(jìn)一步的熱點(diǎn)。早期認(rèn)為原位調(diào)控是LncRNA作用的唯一機(jī)制，它通過招募形成染色質(zhì)修飾復(fù)合物而沉默鄰近基因轉(zhuǎn)錄，例如IGF2R反義RNA(antisense of IGF2RRNA，AIR)、XIST等。而Hox基因反義基因間RNA(Hox antisense intergenic RNA，HOTAIR)的發(fā)現(xiàn)提示LncRNA可能存在遠(yuǎn)程調(diào)控。同源異型基因(homeotic genes，HOX)在細(xì)胞增殖與定向分化中起關(guān)鍵作用，人類Hox基因簇約含100個(gè)ncRN

17、A基因，其中HOTAIR定位于HOXC基因座12q13.13。HOTAIR的5'端可招募結(jié)合多梳蛋白抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex2，PRC2)，借助PRC2上三個(gè)H3K27甲基化酶EZH2、SUZ12和EED，使另一基因座HOXD上長(zhǎng)約40kb的序列轉(zhuǎn)錄沉默，從而在乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄傾向于胚胎成纖維細(xì)胞樣表型。超過20%的LncRNA能夠通過結(jié)合PRC2或其他類似復(fù)合物發(fā)揮作用，提示LncRNA的遠(yuǎn)程調(diào)控機(jī)制在生物體內(nèi)廣泛存在。其作用機(jī)制如下圖所示，主要包括以下幾種情況：1) 在編碼蛋白基因的上游啟動(dòng)子區(qū)（橘色）轉(zhuǎn)錄，從而干擾鄰近蛋白編碼

18、基因（藍(lán)色）的表達(dá)（如酵母SER3基因）；2) 抑制RNA 聚合酶，或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾，而影響基因（藍(lán)色）表達(dá)；3) lncRNA（紫色）與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，進(jìn)而產(chǎn)生不同的剪切形式；4) lncRNA（紫色）與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA，調(diào)控基因的表達(dá)水平；5) lncRNA（綠色）結(jié)合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6) 作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7) 結(jié)合在特定蛋白上從而改變?cè)摰鞍椎陌|(zhì)定位；8) 可作為小分子RNA（如miRNA）的前體分子。 lncRNA芯片數(shù)據(jù)分

19、析策略1) 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，預(yù)處理及均一化處理。2) 差異表達(dá)lncRNA及mRNA 的篩選：根據(jù)客戶提供樣本量的大小與分布或?qū)嶒?yàn)?zāi)康?，?yīng)用倍數(shù)法、多重假設(shè)檢驗(yàn)等手段，對(duì)兩條件或多條件下的表達(dá)差異的lncRNA和mRNA分別進(jìn)行計(jì)算和篩選。 表達(dá)模式聚類分析：針對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行樣本及差異表達(dá)lncRNA和mRNA的聚類，尋找屬于同一表達(dá)趨勢(shì)的基因或樣本。 GO和pathway顯著性富集分析：差異基因，應(yīng)用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集分析，挖掘具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因的功能類別。顯著性P值越小，則它隨機(jī)聚集差異表達(dá)基因的概率越小，其功能相關(guān)性的非隨機(jī)性就越小，該功能模塊有較大的可能與疾病（或藥物作用） 相關(guān)。 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析：研究與指定蛋白質(zhì)相互作用的其他蛋白質(zhì)的信息，以使研究人員能夠更加深入地認(rèn)清相關(guān)蛋白質(zhì)的功能，更清楚地理解其調(diào)控機(jī)制。3) lncRNA-mRNA共表達(dá)分析：對(duì)于每一個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，計(jì)算得到與之共表達(dá)的編碼基因。4) lncRNA表達(dá)模式分析：考察差異表達(dá)LncRNAs 的表達(dá)模式，將LncRNAs 以及與該LncRNAs 顯著共表達(dá)的編碼基因的表達(dá)模式繪制heatmap。5) lnc