一株紫杉醇內(nèi)生真菌的分離和鑒定

1、實(shí)驗(yàn)：一株紫杉醇內(nèi)生真菌的分離與鑒定不同的表面消毒方法和不同的培養(yǎng)基使得紅豆杉內(nèi)分離出來(lái)的內(nèi)生真菌有其多樣性，另外，由于紅豆杉品種的不同，也可能使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)一定的差異性以下結(jié)合了中國(guó)紅豆杉、南方紅豆杉以及三尖杉的處理方法，來(lái)探討從紅豆杉內(nèi)分離純化內(nèi)生真菌的方案，從而應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室具體操作和取得最佳結(jié)果如：采用化學(xué)法進(jìn)行表面滅菌處理,運(yùn)用平板涂布法及平板劃線法得到內(nèi)生真菌，然后利用分子鑒定法來(lái)鑒定菌種。一 材料及試劑.材料：百年紅豆杉的樹(shù)皮樣品，某年某月采于_.試劑：無(wú)菌水，蒸餾水，乙醇溶液，.升汞溶液,馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15-20g,蒸餾水100ml,lmol/LNaOH或l

2、mol/LHCL溶液 0.1g/l氯霉素或土霉素，0.05%呂氏堿性美藍(lán)染色液, 乙酸乙酯-丙酮，二甲醇，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇，濃硫酸，香草醛，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品,.儀器設(shè)備：無(wú)菌容器，培養(yǎng)皿，高溫蒸汽滅菌鍋，無(wú)菌剪刀或手術(shù)刀，無(wú)菌濾紙，細(xì)毛刷，恒溫箱，電子分析天平，玻璃棒，紗布，試管或者錐形瓶，pH試紙，恒溫箱，研缽，移液管，平板，接種環(huán)，超凈臺(tái)，酒精燈，膠頭滴管，蓋玻片，載玻片，鑷子，光學(xué)顯微鏡，三角瓶，抽濾器，蒸發(fā)皿，分液漏斗，UF254硅膠板，電熱鼓風(fēng)干燥箱，噴壺，鉛筆，直尺，毛細(xì)管，薄層板，層析缸，電吹風(fēng)，酒精燈，鑷子，紫外光燈，磨砂紙二實(shí)驗(yàn)操作.內(nèi)生真菌的分離.1方法一：將樹(shù)皮在洗衣

3、溶液中浸泡min,并用細(xì)毛刷刷去表面污垢，然后在自然水中沖洗min.沖洗完成后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌濾紙吸干，放入的乙醇中消毒s,然后用無(wú)菌水漂洗次，再放入.的升汞溶液中浸泡8min，取出后用無(wú)菌水漂洗次最后，用手術(shù)刀將樹(shù)皮剪成.cm小塊，再放入事先準(zhǔn)備好的PDA固體培養(yǎng)基平板中，恒溫培養(yǎng)d每天觀察一次，確定菌絲生長(zhǎng)時(shí)間等長(zhǎng)出菌絲后，挑取平板中單一菌落進(jìn)一步純化，純化后的菌株轉(zhuǎn)接到裝有PDA斜面培養(yǎng)基上，下恒溫保存當(dāng)菌落長(zhǎng)滿斜面后，劃線接種于平板培養(yǎng)基上，每d觀察一次，根據(jù)菌落的形狀顏色以及長(zhǎng)出時(shí)間的不同，有不純的菌落就要繼續(xù)劃線分離培養(yǎng)，直到得到純種將純化后的菌株編號(hào)記下，接入PDA斜面

4、培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)d后，保存于冰箱。(無(wú)菌水使用量：前后共使用無(wú)菌水次，大概需要？ml無(wú)菌水；乙醇制備：將100ml95%的酒精加蒸餾水至126ml后搖勻，即成75%的酒精，根椐C1V1=C2V2；無(wú)菌水與蒸餾水：一般用實(shí)驗(yàn)室中的蒸餾水通過(guò)高溫蒸汽法來(lái)滅菌即可得無(wú)菌水，無(wú)菌水水中的無(wú)機(jī)鹽等一般來(lái)說(shuō)不會(huì)減少其溫度指標(biāo)和壓力指標(biāo)是？升汞溶液制備：千分之一汞，1mL汞，汞的密度是13.6g/mL,用分析天平稱取13.6g汞. 表面消毒檢驗(yàn)：在材料是確定的情況下，肯定不會(huì)出現(xiàn)結(jié)果的“實(shí)驗(yàn)組”，我們稱之為陰性對(duì)照，我們可以取最后一次無(wú)菌水沖洗液ul涂布到分離培養(yǎng)基下下培養(yǎng)d，觀察消毒結(jié)果注：如果未進(jìn)行表

5、面消毒檢驗(yàn)，沒(méi)有作陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，在出現(xiàn)結(jié)果時(shí)，我們要注意以平板劃線法來(lái)排除其它雜菌污染；此方法為平板劃線法的具體操作，涂布平板法有所不同)(此過(guò)程所需試劑：無(wú)菌水，蒸餾水，乙醇溶液，.升汞溶液；此過(guò)程所需儀器：無(wú)菌容器，培養(yǎng)皿，高溫蒸汽滅菌鍋，細(xì)毛刷，手術(shù)刀，無(wú)菌濾紙，恒溫箱)2.1.2方法二：組織研磨法，表面消毒方法同組織分離法，后將組織剪碎，置于研缽中充分研磨。以1: 10的比例加入無(wú)菌水，制備勻漿液，吸取100uL加入到分離平板中涂布。待菌絲長(zhǎng)出后，挑取單菌落接種于PDA固體培養(yǎng)基中。純化結(jié)束后接種至試管斜面上，于4冰箱中保藏備用。（此過(guò)程所需儀器：研缽，移液管，平板，接種環(huán)，超凈臺(tái)，

6、酒精燈，試管；此過(guò)程中接種操作注意：選取邊緣清晰又比較大的菌落，一環(huán)下去，能接觸到菌落，記住不要插，輕輕碰一下就有幾十萬(wàn)個(gè)菌，然后迅速轉(zhuǎn)接到試管，整個(gè)過(guò)程不超過(guò)5秒。）.4注意操作：平板劃線法與涂布劃線法的區(qū)別涂布之后整個(gè)平板很均勻，劃線操作不均勻，只有劃線的地方有涂布的前提是有菌液就能涂布，劃線的前提是有菌落存在涂布法簡(jiǎn)單，均勻，缺點(diǎn)是如果菌液密度大，不適合單菌落劃線操作麻煩，但能保證單菌落，分離純化效率高2.2純化內(nèi)生真菌的方法-PDA培養(yǎng)基的制作方法2.2.1培養(yǎng)基配制方法流程1.洗凈去皮，稱取200g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛（煮沸2030分鐘，能被玻璃棒戳破即可） 2. 用四層紗布過(guò)濾

7、，再據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要加葡萄糖和瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻 3. 稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000毫升，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，（121）滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面或者搖勻，冷卻后貯存?zhèn)溆?2.2.2注意事項(xiàng)u 培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37C恒溫箱培養(yǎng)24h，無(wú)菌生長(zhǎng)的時(shí)候方可使用u PDA培養(yǎng)基一般不需要調(diào)pH。對(duì)于要調(diào)節(jié)pH的培養(yǎng)基，一般用pH試紙測(cè)定其pH。如果培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用lmol/LNaOH或1mol/LHCL溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿破壞培養(yǎng)基成分。 u 培養(yǎng)基在使用時(shí)也可以做成不含瓊脂的液體培養(yǎng)基，用于菌類(lèi)的震蕩培養(yǎng)u 培養(yǎng)

8、基也可以加入氯霉素或土霉素，加入量為0.1g/L培養(yǎng)基，主要是為了抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，減少干擾性 (此步實(shí)驗(yàn)儀器：玻璃棒,紗布,試管或者錐形瓶,pH試紙,恒溫箱)2.3內(nèi)生真菌的鑒定2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定法：肉眼觀察，將分離純化的內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基上，于28培養(yǎng)7d觀察，記錄菌落大小、顏色、表面特征等;用透明膠帶粘取菌絲并用美藍(lán)染色制作臨時(shí)裝片；光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照，記錄菌絲、孢子和分生抱子梗形態(tài)等特征；參考【真菌鑒定手冊(cè)】對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定.（此過(guò)程所需試劑：0.05%呂氏堿性美藍(lán)染色液；此過(guò)程所需實(shí)驗(yàn)儀器：膠頭滴管，蓋玻片，載玻片，接種環(huán)，鑷子，光學(xué)顯微鏡；制作臨時(shí)裝片注意：

9、美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型呈無(wú)色，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力。能使美藍(lán)的藍(lán)色氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型。真菌有還原性，因此，具有還原能力的真菌是顯藍(lán)色的 染液不宜過(guò)多或過(guò)少，否則，在加上蓋玻片時(shí)，菌液會(huì)溢出而出現(xiàn)大量氣泡而影響觀察，在操作的過(guò)程中應(yīng)慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上，以免產(chǎn)生氣泡而影響觀察，最后滴好美藍(lán)染液之后，接種菌種，然后在染色2-3分鐘之后再加蓋玻片在高倍鏡下鏡檢。）2.3.2薄層層析法：采用簡(jiǎn)單薄層層析的方法(TLC)進(jìn)行檢測(cè)，利用層析靜相與流動(dòng)相的原理，吸附力強(qiáng)的移動(dòng)慢，吸附力弱的移動(dòng)快，從而檢測(cè)菌種液體培養(yǎng)的產(chǎn)物里是否含有紫杉醇。

10、取0.03 g紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品，溶于60 ml甲醇中，配制成濃度為0.5 g/l紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇按照體積比為88：7：5的比例配制展開(kāi)劑按照甲醇:濃硫酸:香草醛體積比為90 ml:10 ml:1g的比例制成特異性顯色劑，置于噴壺中檢測(cè)方法:在層析片的一端1 cm處用鉛筆和直尺畫(huà)一直線，在直線上相隔0.5公分處均勻的點(diǎn)兩個(gè)點(diǎn)作為標(biāo)記；用毛細(xì)管吸取適量的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，分別點(diǎn)在層析片標(biāo)記處，試樣點(diǎn)直徑不能超過(guò)0.2公分，注意毛細(xì)管要換一根或用適當(dāng)?shù)姆椒ㄇ逑春迷倮^續(xù)點(diǎn)樣；點(diǎn)樣完成后，將層析片置于裝有0.2公分高的展開(kāi)劑的展開(kāi)槽中，鋁鉑紙加小燒杯作展開(kāi)槽，然后在側(cè)壁

11、放一張潤(rùn)濕的長(zhǎng)型濾紙，完全揮發(fā)之后再使用鑷子夾層析片放入展開(kāi)槽中間，成斜立的狀態(tài)，注意起始線必須高于展開(kāi)劑的高度，當(dāng)展開(kāi)劑到達(dá)層析片前沿時(shí)取出，觀察揮發(fā)情況，最后用鉛筆劃出前沿并標(biāo)出試樣點(diǎn)的位置和顏色，準(zhǔn)備計(jì)算各點(diǎn)的RF值；當(dāng)層析片上出現(xiàn)斑點(diǎn)，紫杉醇在特異性顯色劑噴灑后會(huì)顯示藍(lán)色斑點(diǎn)，并測(cè)量斑點(diǎn)的Rf值（實(shí)驗(yàn)試劑：三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇，濃硫酸:香草醛，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)儀器：薄層層析片，鑷子，毛細(xì)管，展開(kāi)槽（可用鋁鉑紙加小燒杯），濾紙，展開(kāi)劑，紫外光燈，磨砂紙，鉛筆和直尺，酒精燈，噴壺相關(guān)操作效果：紫外光燈：照射層析片從而看到實(shí)驗(yàn)結(jié)果；酒精燈：為了使毛細(xì)管在其外焰下加熱，使毛細(xì)管氧化利于拉伸

12、，再用磨砂紙從中折斷；高極性的乙酸乙酯作為展開(kāi)劑來(lái)使用，吸附力較高，輕易帶動(dòng)化合物上升，獲得更好的分離效果；RF值的計(jì)算=化合物上升高度/展開(kāi)劑前沿上升高度，注明展開(kāi)劑比例）2.3.3薄層層析硅膠板法(1)搖床培養(yǎng)。將分離純化的菌株分別接種到液體PDA培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)。搖床溫度為27 °C，轉(zhuǎn)速為180 r /min，避光培養(yǎng)，液體培養(yǎng)時(shí)間一般為12d(2)液體培養(yǎng)物的提取。將三角瓶中的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，抽濾后取上清液在50下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/10，加入相同體積的乙酸乙酯-丙酮(體積比為1：1進(jìn)行萃取，萃取2-3次，收集有機(jī)相。將發(fā)酵液在50下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至液體蒸發(fā)

13、完，殘留物體用10 ml二甲醇溶解，在4冰箱中保存?zhèn)溆谩?3)提取物的檢測(cè)。采用薄層層析的方法(TLC)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)菌種液體培養(yǎng)的產(chǎn)物里是否含有紫杉醇。把UF254硅膠板在電熱鼓風(fēng)干燥箱中110活化30 min用三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇按照體積比為88:7:5的比例配制展開(kāi)劑。按照甲醇:濃硫酸:香草醛體積比為90 ml:10 ml:1g的比例制成特異性顯色劑，置于噴壺中。取0.03 g紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品，溶于60 ml二甲醇中，配制成濃度為0.5 g/l紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。檢測(cè)方法:在薄層板的一端1 cm處用鉛筆畫(huà)一直線，在直線上均勻的點(diǎn)幾個(gè)點(diǎn)作為標(biāo)記。用毛細(xì)管吸取適量的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，分別點(diǎn)在薄層板標(biāo)記處，點(diǎn)樣完成后，將薄層板置于裝有展開(kāi)劑的層析缸中，展開(kāi)時(shí)間為30 min，當(dāng)展開(kāi)劑到達(dá)薄層板前沿時(shí)取出。在烘箱中干燥薄層板后，用噴壺均勻噴灑特異性顯色劑，噴灑完用電吹風(fēng)加熱，直至薄層板上出現(xiàn)斑點(diǎn)。紫杉醇在特異性顯色劑噴灑后會(huì)顯示藍(lán)色斑點(diǎn)，并測(cè)量斑點(diǎn)的Rf值。(實(shí)驗(yàn)試劑：液體PDA培養(yǎng)基，乙酸乙酯-丙酮，