分子生物學(xué)第05章核酸的分子操作

1、5.1 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶5.2 操作和標(biāo)記核酸的酶操作和標(biāo)記核酸的酶5.3 分子雜交分子雜交5 5 核酸的分子操作工具酶的種類 核酸酶：用于切割或降解核酸分子。核酸酶：用于切割或降解核酸分子。 連接酶：用于把核酸分子連接到一起。連接酶：用于把核酸分子連接到一起。 聚合酶：用于核酸分子的擴(kuò)增和拷貝。聚合酶：用于核酸分子的擴(kuò)增和拷貝。 修飾酶：用于給核酸分子添上或減去某些修飾酶：用于給核酸分子添上或減去某些 化學(xué)基團(tuán)或核苷酸?；瘜W(xué)基團(tuán)或核苷酸。 工具酶的來(lái)源 這四大類酶大都是從細(xì)菌和噬菌體中純化出來(lái)的，這四大類酶大都是從細(xì)菌和噬菌體中純化出來(lái)的，在細(xì)胞中它們?cè)揪蛥⑴c在細(xì)胞中它們?cè)揪蛥⑴c

2、DNA復(fù)制、復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、降解轉(zhuǎn)錄、降解外來(lái)核酸分子、修復(fù)突變的外來(lái)核酸分子、修復(fù)突變的DNA分子和不同分子和不同DNA分子分子間重組等一系列重要的生命反應(yīng)過(guò)程。在重組間重組等一系列重要的生命反應(yīng)過(guò)程。在重組DNA技技術(shù)中，它們被用來(lái)在人工控制的條件下（體外）工作。術(shù)中，它們被用來(lái)在人工控制的條件下（體外）工作。值得一提的是，絕大多數(shù)這類酶促反應(yīng)是無(wú)法用其它值得一提的是，絕大多數(shù)這類酶促反應(yīng)是無(wú)法用其它方法來(lái)替代完成的，這種不可替代性使這些工具酶在方法來(lái)替代完成的，這種不可替代性使這些工具酶在重組重組DNA技術(shù)中占據(jù)了極其重要的地位。技術(shù)中占據(jù)了極其重要的地位。 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 20世

3、紀(jì)世紀(jì)50年代初有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室在研究噬菌體的年代初有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室在研究噬菌體的宿主范圍時(shí)相繼發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個(gè)噬菌體從其天然宿主，宿主范圍時(shí)相繼發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個(gè)噬菌體從其天然宿主，如如E. coli的品系的品系A(chǔ)，轉(zhuǎn)到另一個(gè)品系，轉(zhuǎn)到另一個(gè)品系B時(shí)，往往不能時(shí)，往往不能生長(zhǎng)。但如果進(jìn)行大量的感染，則有個(gè)別噬菌體能生長(zhǎng)。但如果進(jìn)行大量的感染，則有個(gè)別噬菌體能生存下來(lái)。研究表明，噬菌體在非天然宿主品系中生存下來(lái)。研究表明，噬菌體在非天然宿主品系中不能生存，是因?yàn)槭删w的不能生存，是因?yàn)槭删w的DNA被降解了，而細(xì)菌被降解了，而細(xì)菌自身的自身的DNA卻不被降解。為了解釋這種現(xiàn)象，人們卻不被降解。為了解釋這種現(xiàn)象，

4、人們提出了限制修飾酶假說(shuō)。提出了限制修飾酶假說(shuō)。 限制修飾假說(shuō) 限制修飾假說(shuō)認(rèn)為，細(xì)菌細(xì)胞中含有兩種酶，限制修飾假說(shuō)認(rèn)為，細(xì)菌細(xì)胞中含有兩種酶，一種是限制性核酸內(nèi)切酶，一種是一種是限制性核酸內(nèi)切酶，一種是DNA甲基化酶，甲基化酶，這兩種酶成對(duì)出現(xiàn)，二者對(duì)這兩種酶成對(duì)出現(xiàn)，二者對(duì)DNA分子有相同的識(shí)別分子有相同的識(shí)別序列。序列。DNA甲基化酶在識(shí)別序列處特定的核苷酸上甲基化酶在識(shí)別序列處特定的核苷酸上甲基化。限制性內(nèi)切酶只能切割非甲基化的甲基化。限制性內(nèi)切酶只能切割非甲基化的DNA，而不能切割不完全甲基化和完全甲基化的而不能切割不完全甲基化和完全甲基化的DNA。因。因此，非甲基化的外來(lái)此，非甲基

5、化的外來(lái)DNA會(huì)被限制性內(nèi)切酶降解。會(huì)被限制性內(nèi)切酶降解。 完全甲基化和不完全甲基化 一條鏈上甲基化而另一條鏈上沒有甲基化的稱一條鏈上甲基化而另一條鏈上沒有甲基化的稱為不完全甲基化（如剛經(jīng)過(guò)半保留復(fù)制的為不完全甲基化（如剛經(jīng)過(guò)半保留復(fù)制的DNA分分子），兩條鏈都甲基化的稱為完全甲基化。子），兩條鏈都甲基化的稱為完全甲基化。DNA甲甲基化酶可以對(duì)非甲基化的及不完全甲基化的識(shí)別序基化酶可以對(duì)非甲基化的及不完全甲基化的識(shí)別序列進(jìn)行甲基化。列進(jìn)行甲基化。 1968年從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了年從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了型限制性內(nèi)切酶，型限制性內(nèi)切酶，1970年分離出了年分離出了型限制性內(nèi)切酶，從而證實(shí)了上型限制性內(nèi)切

6、酶，從而證實(shí)了上述假說(shuō)。述假說(shuō)。 各種類型限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)比較各種類型限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)比較 性性 質(zhì)質(zhì) 型型 型型 型型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能功能獨(dú)立的內(nèi)切酶和甲基獨(dú)立的內(nèi)切酶和甲基化酶化酶由由2個(gè)亞基組成的個(gè)亞基組成的雙功能酶雙功能酶由由3個(gè)亞基組成的個(gè)亞基組成的復(fù)合功能酶復(fù)合功能酶識(shí)別部位識(shí)別部位短小序列（大多為短小序列（大多為46 bp），常為回文結(jié)構(gòu)），常為回文結(jié)構(gòu)57bp的不對(duì)稱序的不對(duì)稱序列列不對(duì)稱序列，例如不對(duì)稱序列，例如（AACN6GTGC)*切割部位切割部位同于或接近于同于或接近于識(shí)別部位識(shí)別部位距識(shí)別位點(diǎn)距識(shí)別位點(diǎn)3端端2426bp處處非特異性，距識(shí)別非特異性，距

7、識(shí)別部位大于部位大于1000bp限制作用所需限制作用所需的輔助因子的輔助因子Mg2+ATP、Mg2+、S-腺腺苷甲硫氨酸苷甲硫氨酸ATP、Mg2+、S-腺腺苷甲硫氨酸苷甲硫氨酸型限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn) 型酶分子量小，為單亞基多體酶（同源二聚型酶分子量小，為單亞基多體酶（同源二聚體），以體），以Mg2+為輔助因子，只有切割作用，沒有修飾為輔助因子，只有切割作用，沒有修飾作用（有獨(dú)立的與之相匹配的甲基化酶）。作用（有獨(dú)立的與之相匹配的甲基化酶）。型酶的型酶的識(shí)別序列一般為識(shí)別序列一般為46個(gè)個(gè)bp,切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)或相切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)或相鄰處（鄰處（s型，型，shifted cleavage）

8、，見表），見表52。切割位。切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)相鄰處的例子如點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)相鄰處的例子如Hga，其識(shí)別序列和，其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)記為切割位點(diǎn)記為GACGC（5/10），表示切割位點(diǎn)為），表示切割位點(diǎn)為 5 G A C G C N N N N N 3 3 C T G C G N N N N N N N N N N 5表表52 部分部分型限制性內(nèi)切酶及其切割位點(diǎn)型限制性內(nèi)切酶及其切割位點(diǎn)酶酶鹽濃度鹽濃度溫度溫度識(shí)別序列及識(shí)別序列及切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)切割產(chǎn)生的末端切割產(chǎn)生的末端EcoR高高37 GAATTC (5 突出粘性末端）突出粘性末端）-G AATTC-CTTAA G-Hae 中中37 GGCC

9、（平端）（平端）-GG CC-CC GG-Mbo 高高37 GATC（5 突出粘性末端）突出粘性末端）- GATC-CTAG -Pst 中中2137 CTGCAG（3 突出粘性末端）突出粘性末端）-CTGCA G-G ACGTC-限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的多寡 如果如果DNA上的核苷酸順序是隨機(jī)的，則對(duì)于上的核苷酸順序是隨機(jī)的，則對(duì)于以以4個(gè)個(gè)bp為識(shí)別序列的為識(shí)別序列的型酶來(lái)說(shuō)，平均型酶來(lái)說(shuō)，平均44（256）個(gè)核苷酸就有一個(gè)靶序列；而對(duì)于以個(gè)核苷酸就有一個(gè)靶序列；而對(duì)于以6個(gè)個(gè)bp為識(shí)為識(shí)別序列的酶則平均別序列的酶則平均46（4096）個(gè)核苷酸就有一個(gè)）個(gè)核苷酸就有一個(gè)靶序列。靶序列。 同裂酶

10、和同尾酶 具 有 相 同 識(shí) 別 序 列 的 酶 稱 為 同 裂 酶具 有 相 同 識(shí) 別 序 列 的 酶 稱 為 同 裂 酶（isoschizomers），切割位點(diǎn)可以相同也可以不），切割位點(diǎn)可以相同也可以不同。如同。如Mbo和和Sau3A的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)均的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)均為為GATC，Xma的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)為的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)為CCCGGG，而具有與其相同識(shí)別序列的，而具有與其相同識(shí)別序列的Sma的切割位點(diǎn)為的切割位點(diǎn)為CCCGGG。 識(shí)別序列不同，但切出的粘性末端相同的酶識(shí)別序列不同，但切出的粘性末端相同的酶稱為同尾酶（稱為同尾酶（isocaudamers）。例如）。例如

11、 BamH GGATCC Bgl AGATCT Bcl TGATCA Sau3A GATC型限制性內(nèi)切酶所需反應(yīng)條件 反應(yīng)溫度和時(shí)間：反應(yīng)溫度和時(shí)間：37保溫適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，保保溫適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，保溫時(shí)間一般從半小時(shí)到數(shù)小時(shí)，可通過(guò)預(yù)備實(shí)驗(yàn)溫時(shí)間一般從半小時(shí)到數(shù)小時(shí)，可通過(guò)預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定或按文獻(xiàn)資料進(jìn)行。確定或按文獻(xiàn)資料進(jìn)行。 反應(yīng)體積：一般為幾十反應(yīng)體積：一般為幾十l。 底物底物DNA：用無(wú)：用無(wú)DNase的的RNase除去可能污染除去可能污染的的RNA；用乙醇多次沉淀可除去各種雜質(zhì)（如酚、；用乙醇多次沉淀可除去各種雜質(zhì)（如酚、SDS、EDTA等），最后吹干乙醇并溶于適當(dāng)?shù)牡龋?，最后吹干乙醇并溶?/p>

12、適當(dāng)?shù)木彌_液中。緩沖液中。型限制性內(nèi)切酶所需反應(yīng)條件 反應(yīng)系統(tǒng)：緩沖液應(yīng)過(guò)濾除菌或高壓滅菌，根反應(yīng)系統(tǒng)：緩沖液應(yīng)過(guò)濾除菌或高壓滅菌，根據(jù)不同的限制性內(nèi)切酶選擇高、中、低鹽濃度。據(jù)不同的限制性內(nèi)切酶選擇高、中、低鹽濃度。當(dāng)用兩種以上的限制性內(nèi)切酶切割時(shí)，應(yīng)先用需當(dāng)用兩種以上的限制性內(nèi)切酶切割時(shí)，應(yīng)先用需低鹽濃度的酶，再用需高鹽濃度的酶。所加酶量低鹽濃度的酶，再用需高鹽濃度的酶。所加酶量要適當(dāng)。要適當(dāng)。1單位酶的定義：在限定的溫度（一般單位酶的定義：在限定的溫度（一般為為37）和緩沖液條件下，在）和緩沖液條件下，在20l反應(yīng)液中，反應(yīng)液中，1小時(shí)消化小時(shí)消化1g DNA所需的酶量。所需的酶量。 限

13、制性內(nèi)切酶的命名 第一個(gè)大寫字母（斜體）為產(chǎn)酶微生物屬名的第第一個(gè)大寫字母（斜體）為產(chǎn)酶微生物屬名的第一個(gè)字母，第二、三兩個(gè)小寫字母（斜體）為種名的一個(gè)字母，第二、三兩個(gè)小寫字母（斜體）為種名的前兩個(gè)字母，第四個(gè)大寫或小寫字母（正體）為變種前兩個(gè)字母，第四個(gè)大寫或小寫字母（正體）為變種或株系名的第一個(gè)字母，最后的羅馬數(shù)字為序號(hào)（從或株系名的第一個(gè)字母，最后的羅馬數(shù)字為序號(hào)（從同一種微生物中分離出了幾種限制性內(nèi)切酶時(shí)按發(fā)現(xiàn)同一種微生物中分離出了幾種限制性內(nèi)切酶時(shí)按發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序編號(hào)）。和分離的先后順序編號(hào)）。流感嗜血桿菌（流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）Rd株：

14、株：Hind大腸桿菌（大腸桿菌（Escherichia coli）Ry13株：株：EcoR淀粉液化芽孢桿菌（淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）H株：株：B BamH核酸的凝膠電泳 為了檢測(cè)酶切后為了檢測(cè)酶切后DNA片段的大小，必須進(jìn)行凝片段的大小，必須進(jìn)行凝膠電泳分離。往電泳體系中加溴化乙錠或電泳結(jié)束膠電泳分離。往電泳體系中加溴化乙錠或電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，就可以在紫外光下看到后用溴化乙錠染色，就可以在紫外光下看到DNA帶，帶，靈敏度可達(dá)靈敏度可達(dá)5ng。RNA電泳也可用溴化乙錠染色，但電泳也可用溴化乙錠染色，但靈敏度低得多。靈敏度低得多。 DNA凝膠

15、電泳常以瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝凝膠電泳常以瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)，前者用于較大片段的分離，后者用于較膠為介質(zhì)，前者用于較大片段的分離，后者用于較小片段的分離和序列測(cè)定。小片段的分離和序列測(cè)定。溴化乙錠結(jié)構(gòu)式表表53 凝膠濃度與凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍分子的有效分離范圍凝膠種類凝膠種類凝膠濃度凝膠濃度（%）分離線性分離線性DNA的的有效范圍有效范圍二甲苯青二甲苯青溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)瓊脂糖瓊脂糖0.30.60.91.21.52.05 60 kb1 20 kb0.5 7 kb0.4 6 kb0.2 4 kb0.1 3 kb1000 bp150 bp聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺3.55.08.

16、012.020.0100 2000 bp80 500 bp60 400 bp40 200 bp6 200 bp460 bp260 bp160 bp70 bp45 bp100 bp65 bp45 bp20 bp15 bpDNA大小與遷移距離的關(guān)系 在一定范在一定范圍內(nèi)，圍內(nèi)，DNA分分子遷移的距離子遷移的距離與其核苷酸對(duì)與其核苷酸對(duì)（bp）的對(duì)數(shù)）的對(duì)數(shù)成反比。成反比。 DNA分子的狀態(tài)與遷移速度的關(guān)系 在無(wú)在無(wú)EB下電泳，下電泳，cccDNA泳動(dòng)速度最快，泳動(dòng)速度最快，linear DNA次之，次之，ocDNA最慢。隨著最慢。隨著EB濃度的增加，更多的濃度的增加，更多的EB結(jié)合到結(jié)合到DNA上

17、，上，cccDNA分子的負(fù)超螺旋逐漸解開，分子的負(fù)超螺旋逐漸解開，其分子半徑增加，遷移速率減小。達(dá)到游離染料的臨界其分子半徑增加，遷移速率減小。達(dá)到游離染料的臨界濃度時(shí)，不再有超螺旋，濃度時(shí)，不再有超螺旋，cccDNA分子的遷移速率達(dá)最分子的遷移速率達(dá)最小值。繼續(xù)增加小值。繼續(xù)增加EB，便形成正超螺旋，便形成正超螺旋，DNA分子變得分子變得更加致密，遷移速率迅速增加。對(duì)絕大多數(shù)更加致密，遷移速率迅速增加。對(duì)絕大多數(shù)cccDNA分分子而言，游離子而言，游離EB的臨界濃度介于的臨界濃度介于0.10.5g/ml。由于電由于電荷的中和，以及荷的中和，以及EB賦予賦予DNA較大的剛性，隨著較大的剛性，隨

18、著EB濃度濃度的增加，的增加，linearDNA和和ocDNA的遷移速率也有不同程度的遷移速率也有不同程度的減小。的減小。 大分子DNA的電泳分離 在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳中，有效分離天然在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳中，有效分離天然DNA分子的大小最大只能到分子的大小最大只能到1520kb。更大的線。更大的線狀雙鏈狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速率相同。分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速率相同。此時(shí)凝膠不能再按分子大小分離此時(shí)凝膠不能再按分子大小分離DNA，DNA分子分子像通過(guò)彎管一樣，以其一端指向電場(chǎng)的一極而通像通過(guò)彎管一樣，以其一端指向電場(chǎng)的一極而通過(guò)凝膠，這種遷移模式謂之過(guò)凝膠，這種遷移模式謂之“爬行

19、爬行”。 脈沖電泳 1983年，年，Schwartz等提出了脈沖電場(chǎng)凝膠電泳等提出了脈沖電場(chǎng)凝膠電泳的設(shè)計(jì)思想，從而找到了解決這一問題的辦法。這的設(shè)計(jì)思想，從而找到了解決這一問題的辦法。這一方法在凝膠上外加正交的交變脈沖電場(chǎng)。每當(dāng)電一方法在凝膠上外加正交的交變脈沖電場(chǎng)。每當(dāng)電場(chǎng)方向改變后，大場(chǎng)方向改變后，大DNA分子便滯留在爬行管里，直分子便滯留在爬行管里，直至沿新的電場(chǎng)軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動(dòng)。至沿新的電場(chǎng)軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動(dòng)。若若DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA分子就可以按其大小分開。分子越大，轉(zhuǎn)向所分子就可以按其大小

20、分開。分子越大，轉(zhuǎn)向所需的時(shí)間越長(zhǎng)，總的遷移距離就越短，從而達(dá)到分需的時(shí)間越長(zhǎng)，總的遷移距離就越短，從而達(dá)到分離的目的。離的目的。 交變脈沖垂直定向電場(chǎng)電泳 Schwartz和和Cantor（1984）最先設(shè)計(jì)的脈沖電）最先設(shè)計(jì)的脈沖電場(chǎng)凝膠電泳裝置采用了交變脈沖垂直定向電場(chǎng)和線場(chǎng)凝膠電泳裝置采用了交變脈沖垂直定向電場(chǎng)和線電極。電極。 non-uniform field（200V）in the N-S directionuniform field（85V）in the E-W direction電場(chǎng)倒轉(zhuǎn)凝膠電泳，F(xiàn)IGE Carle等（等（1986）設(shè)計(jì)的裝置為利于單個(gè)電場(chǎng)的）設(shè)計(jì)的裝置為利于

21、單個(gè)電場(chǎng)的周期性倒轉(zhuǎn)（電場(chǎng)倒轉(zhuǎn)凝膠電泳，周期性倒轉(zhuǎn)（電場(chǎng)倒轉(zhuǎn)凝膠電泳，field-inversion gel electrophoresis，F(xiàn)IGE），舍棄了正交排列的兩個(gè)電），舍棄了正交排列的兩個(gè)電場(chǎng)。電場(chǎng)在兩個(gè)方向上都是均一的，而正向脈沖稍長(zhǎng)場(chǎng)。電場(chǎng)在兩個(gè)方向上都是均一的，而正向脈沖稍長(zhǎng)于反向脈沖，從而導(dǎo)致了于反向脈沖，從而導(dǎo)致了DNA沿相當(dāng)筆直的軌跡運(yùn)沿相當(dāng)筆直的軌跡運(yùn)動(dòng)。應(yīng)用微處理機(jī)增加電泳時(shí)脈沖的絕對(duì)長(zhǎng)度并保持動(dòng)。應(yīng)用微處理機(jī)增加電泳時(shí)脈沖的絕對(duì)長(zhǎng)度并保持正反象脈沖的比例不變，可以使分辨力達(dá)到最大。正反象脈沖的比例不變，可以使分辨力達(dá)到最大。FIGE可分辨長(zhǎng)達(dá)可分辨長(zhǎng)達(dá)2000kb

22、的的DNA片段。片段。 10.5V/cm，/Xho兩個(gè)片段，兩個(gè)片段，15kb和和33.5kb，在正向在正向0.5sec，反向，反向0.25sec分得很開；分得很開；T5 125kb，T4 170kb，在正向，在正向3sec，反向，反向1sec分得很開。分得很開。 電場(chǎng)倒轉(zhuǎn)凝膠電泳的分離效果垂直凝膠脈沖電泳 Gardiner等（等（1986）使用的是垂直凝膠裝置，）使用的是垂直凝膠裝置，鉑絲電極裝在凝膠的兩個(gè)對(duì)邊上。鉑絲電極裝在凝膠的兩個(gè)對(duì)邊上。DNA先向一組電先向一組電極移動(dòng)，電場(chǎng)轉(zhuǎn)換后則向另一組電極移動(dòng)。這種極移動(dòng)，電場(chǎng)轉(zhuǎn)換后則向另一組電極移動(dòng)。這種“之之”字形運(yùn)動(dòng)的凈結(jié)果是從加樣孔指向凝

23、膠底部字形運(yùn)動(dòng)的凈結(jié)果是從加樣孔指向凝膠底部的直線。由于凝膠中的所有泳道均處在相同的電場(chǎng)的直線。由于凝膠中的所有泳道均處在相同的電場(chǎng)下，所以下，所以DNA的條帶不會(huì)發(fā)生水平變形。這種系統(tǒng)的條帶不會(huì)發(fā)生水平變形。這種系統(tǒng)的分辨上限大約為的分辨上限大約為9000kb。 鉗位均勻電場(chǎng)脈沖電泳 鉗位均勻電場(chǎng)電泳（鉗位均勻電場(chǎng)電泳（CHEF）中，由多個(gè)在水平）中，由多個(gè)在水平凝膠的周圍沿正方形或六邊形排列的電極產(chǎn)生電場(chǎng)，凝膠的周圍沿正方形或六邊形排列的電極產(chǎn)生電場(chǎng)，這些電極都被鉗制在預(yù)定的電位上。正方形排列的這些電極都被鉗制在預(yù)定的電位上。正方形排列的電極產(chǎn)生的電場(chǎng)互成電極產(chǎn)生的電場(chǎng)互成90，六邊形排列

24、的電極產(chǎn)生，六邊形排列的電極產(chǎn)生的電場(chǎng)雖凝膠的位置和電極極性的不同而互成的電場(chǎng)雖凝膠的位置和電極極性的不同而互成120或或60。結(jié)合運(yùn)用低電場(chǎng)強(qiáng)度（。結(jié)合運(yùn)用低電場(chǎng)強(qiáng)度（1.3V/cm）、低濃度）、低濃度瓊脂糖（瓊脂糖（0.6%）、延長(zhǎng)轉(zhuǎn)換間隔（）、延長(zhǎng)轉(zhuǎn)換間隔（1小時(shí)）和延長(zhǎng)電小時(shí)）和延長(zhǎng)電泳時(shí)間（泳時(shí)間（130小時(shí)）等條件，有可能分離長(zhǎng)達(dá)小時(shí)）等條件，有可能分離長(zhǎng)達(dá)5000kb的的DNA分子。分子。 鉗位均勻電場(chǎng)電泳的電極分布（CHEF） 物理圖譜的定義 標(biāo)明限制性內(nèi)切酶在標(biāo)明限制性內(nèi)切酶在DNA分子上的切割位點(diǎn)和分子上的切割位點(diǎn)和切割位點(diǎn)間距離的圖譜，稱為切割位點(diǎn)間距離的圖譜，稱為DNA

25、的物理圖譜，又的物理圖譜，又叫限制性圖譜。叫限制性圖譜。 圖圖51 多限制酶多限制酶消化法制消化法制作物理圖作物理圖譜譜圖圖52 部分消化法制作物理圖譜部分消化法制作物理圖譜 A D D D B0.5 2.2 1.3 1.032 P5.0 kb4.02.70.5DNA聚合酶的性質(zhì)酶酶35外外切酶切酶53外切酶外切酶聚合反應(yīng)聚合反應(yīng)速率速率持續(xù)合成持續(xù)合成能力能力大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶低低有有中中低低大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶大片段（大片段（Klenow酶）酶）低低無(wú)無(wú)中中低低逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)低低中中T4 DNA聚合酶聚合酶高高無(wú)無(wú)中中低低天然天然T7 DNA聚合酶聚

26、合酶高高無(wú)無(wú)高高高高化學(xué)修飾化學(xué)修飾T7 DNA聚合酶聚合酶（測(cè)序酶）（測(cè)序酶）低或無(wú)低或無(wú)無(wú)無(wú)高高高高Taq DNA聚合酶聚合酶無(wú)無(wú)有有高高高高測(cè)序酶 化學(xué)修飾化學(xué)修飾T7 DNA聚合酶是將天然聚合酶是將天然T7 DNA聚合聚合酶與酶與O2、低濃度的、低濃度的Fe 2+ 一起保溫?cái)?shù)天，修飾一起保溫?cái)?shù)天，修飾T7 DNA聚合酶的聚合酶的N端結(jié)構(gòu)域，使其喪失端結(jié)構(gòu)域，使其喪失99%以上的以上的35外切酶活性，而聚合酶活性不受影響，稱為測(cè)外切酶活性，而聚合酶活性不受影響，稱為測(cè)序酶（序酶（sequenase）。后來(lái)又發(fā)展出了基因工程手段）。后來(lái)又發(fā)展出了基因工程手段產(chǎn)生出一種改進(jìn)的測(cè)序酶（測(cè)序酶產(chǎn)

27、生出一種改進(jìn)的測(cè)序酶（測(cè)序酶2.0版），它完全版），它完全喪失了喪失了35外切酶活性。外切酶活性。 DNA聚合酶的聚合酶的53聚合酶活性聚合酶活性切口平移標(biāo)記核酸探針 帶有易帶有易檢測(cè)標(biāo)記的、已知其序列或來(lái)源的檢測(cè)標(biāo)記的、已知其序列或來(lái)源的DNA片段稱為探針。探針的用途是通過(guò)堿基互補(bǔ)片段稱為探針。探針的用途是通過(guò)堿基互補(bǔ)探尋能夠與之雜交的未知探尋能夠與之雜交的未知DNA片段片段。 先用先用DNase（牛胰）輕微作用于（牛胰）輕微作用于DNA（在（在Mg 2+存在下），在雙鏈存在下），在雙鏈DNA上產(chǎn)生一些切口，然上產(chǎn)生一些切口，然后用大腸桿菌后用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶及及4種種dNTP（其

28、中（其中1種種帶有帶有32P標(biāo)記）進(jìn)行切口平移標(biāo)記。此法利用的是標(biāo)記）進(jìn)行切口平移標(biāo)記。此法利用的是該酶的聚合酶活性和該酶的聚合酶活性和53外切酶活性。外切酶活性。圖圖54 切口平移法制備切口平移法制備32P標(biāo)記的探針標(biāo)記的探針Klenow片段的產(chǎn)生 用枯草桿菌蛋白酶裂解完整的大腸桿菌用枯草桿菌蛋白酶裂解完整的大腸桿菌DNA聚合聚合酶酶，得到，得到C端端70%的分子量為的分子量為76 kD的片段，稱為的片段，稱為Klenow片段。片段。Klenow fragment 具有聚合酶活性和具有聚合酶活性和35外切酶活性，沒有外切酶活性，沒有53外切酶活性。外切酶活性。53外切酶活性位于全酶外切酶活性

29、位于全酶N端分子量為端分子量為36 kD的的小片段中?，F(xiàn)已用基因工程的方法直接生產(chǎn)小片段中?，F(xiàn)已用基因工程的方法直接生產(chǎn)Klenow片段（片段（Klenow酶）。酶）。 隨機(jī)引物標(biāo)記法制備探針 先使待標(biāo)記的雙鏈先使待標(biāo)記的雙鏈DNA變性成單鏈，再與變性成單鏈，再與6bp長(zhǎng)長(zhǎng)的隨機(jī)引物混合物一起退火，加的隨機(jī)引物混合物一起退火，加Klenow酶和酶和4種種dNTP（其中（其中1種帶有種帶有32P標(biāo)記）合成模板的互補(bǔ)鏈。標(biāo)記）合成模板的互補(bǔ)鏈?；パa(bǔ)鏈從引物的互補(bǔ)鏈從引物的3端延伸。端延伸。 圖圖55 采用采用Klenow酶的隨機(jī)引物標(biāo)記法酶的隨機(jī)引物標(biāo)記法逆轉(zhuǎn)錄酶 已經(jīng)商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：一種

30、是來(lái)自禽成已經(jīng)商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：一種是來(lái)自禽成髓細(xì)胞瘤病毒（髓細(xì)胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV），），稱為禽源逆轉(zhuǎn)錄酶。它包括兩條多肽鏈，稱為禽源逆轉(zhuǎn)錄酶。它包括兩條多肽鏈，鏈鏈65kD，鏈鏈95kD，具有逆轉(zhuǎn)錄活性及很強(qiáng)的，具有逆轉(zhuǎn)錄活性及很強(qiáng)的RNaseH活性（降活性（降解解DNA:RNA雜交雙鏈中的雜交雙鏈中的RNA）。另一種是從一株）。另一種是從一株能表達(dá)克隆化的能表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒（鼠白血病病毒（mouse leucocytosis virus, Mo-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿）逆轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離得到的

31、，稱為鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶。它是分子量為菌中分離得到的，稱為鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶。它是分子量為84kD的單鏈蛋白，具有逆轉(zhuǎn)錄活性和相對(duì)較弱的的單鏈蛋白，具有逆轉(zhuǎn)錄活性和相對(duì)較弱的RNaseH活性。活性。逆轉(zhuǎn)錄酶 由于由于RNaseH活性對(duì)活性對(duì)RNA模板有破壞作用，因模板有破壞作用，因此禽源逆轉(zhuǎn)錄酶制劑中高水平的此禽源逆轉(zhuǎn)錄酶制劑中高水平的RNaseH活性往往活性往往趨向于抑制趨向于抑制cDNA的產(chǎn)量，并限制的產(chǎn)量，并限制cDNA合成的長(zhǎng)度。合成的長(zhǎng)度。然而，與鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶相比，禽源逆轉(zhuǎn)錄酶能更有然而，與鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶相比，禽源逆轉(zhuǎn)錄酶能更有效地拷貝較復(fù)雜的效地拷貝較復(fù)雜的mRNA。 T4 DNA聚合酶 T4

32、DNA聚合酶與聚合酶與Klenow酶相似，它們都具有酶相似，它們都具有53聚合酶活性及聚合酶活性及35外切酶活性，而且外切酶活性，而且35外切酶活性對(duì)單鏈外切酶活性對(duì)單鏈DNA的作用比對(duì)雙鏈的作用比對(duì)雙鏈DNA更強(qiáng)。更強(qiáng)。T4 DNA聚合酶的外切核酸酶活性要比聚合酶的外切核酸酶活性要比Klenow酶強(qiáng)酶強(qiáng)200倍。倍。T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶用于補(bǔ)平或標(biāo)記限制酶消化聚合酶用于補(bǔ)平或標(biāo)記限制酶消化DNA后產(chǎn)生的后產(chǎn)生的3凹端，還用于對(duì)帶有凹端，還用于對(duì)帶有3突出端的突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。（先切分子進(jìn)行末端標(biāo)記。（先切3突出端成凹端，突出端成凹端，再補(bǔ)上。這一從凹端或平端上

33、循環(huán)往復(fù)地去除和加再補(bǔ)上。這一從凹端或平端上循環(huán)往復(fù)地去除和加上上3端核苷酸的反應(yīng)又稱為置換反應(yīng)。）端核苷酸的反應(yīng)又稱為置換反應(yīng)。） 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)（同聚物加尾）（同聚物加尾） 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶是從小牛胸腺中純化出末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶是從小牛胸腺中純化出來(lái)的一種小分子量（來(lái)的一種小分子量（34kD）的堿性蛋白質(zhì)，由一個(gè)）的堿性蛋白質(zhì)，由一個(gè)26kD的大亞基和一個(gè)的大亞基和一個(gè)8kD的小亞基組成。底物是的小亞基組成。底物是dNTP和具有和具有3羥基的單鏈羥基的單鏈DNA或具有或具有3羥基突出羥基突出末端的雙鏈末端的雙鏈DNA。此酶簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶。它將。此酶簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶。它將

34、dNTP加到加到3末端羥基上，可用來(lái)加多聚核苷酸尾。末端羥基上，可用來(lái)加多聚核苷酸尾。 堿性磷酸酶 催化單鏈或雙鏈催化單鏈或雙鏈DNA、RNA 5端的磷酸基團(tuán)端的磷酸基團(tuán)水解，成為水解，成為5OH。它也能催化。它也能催化NTP和和dNTP 5磷酸的水解。磷酸的水解。兩種堿性磷酸酶 有兩種堿性磷酸酶，即來(lái)自大腸桿菌的細(xì)菌堿有兩種堿性磷酸酶，即來(lái)自大腸桿菌的細(xì)菌堿性磷酸酶（性磷酸酶（BAP）和小牛腸堿性磷酸酶（）和小牛腸堿性磷酸酶（CIP）。）。CIP在在SDS中加熱至中加熱至68可完全失活，而可完全失活，而BAP對(duì)去垢對(duì)去垢劑和高溫的耐受性更強(qiáng)，不便于反應(yīng)后除去酶活性。劑和高溫的耐受性更強(qiáng)，不便

35、于反應(yīng)后除去酶活性。用用CIP催化的反應(yīng)一般在催化的反應(yīng)一般在pH9.3進(jìn)行。進(jìn)行。 堿性磷酸酶的用途堿性磷酸酶用于：堿性磷酸酶用于： DNA或或RNA 5端標(biāo)記端標(biāo)記32P時(shí)，除去原有的時(shí)，除去原有的5磷酸；磷酸； 除去載體除去載體DNA的的5磷酸以防自身連接，而不磷酸以防自身連接，而不影響帶有影響帶有5磷酸的外源磷酸的外源DNA片段與載體的連接。片段與載體的連接。 T4 多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶催化的前向反應(yīng)（正向反應(yīng)）是多核苷酸激酶催化的前向反應(yīng)（正向反應(yīng)）是將將ATP的的磷酸轉(zhuǎn)移到磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或或RNA的的5OH上，用上，用于標(biāo)記于標(biāo)記5端（用端（用32PATP）。銨離子和磷

36、酸是此反）。銨離子和磷酸是此反應(yīng)的抑制劑，所以應(yīng)該用應(yīng)的抑制劑，所以應(yīng)該用Tris緩沖液（緩沖液（pH7.48.0）。）。 該酶還可以在高濃度該酶還可以在高濃度ATP和和ADP存在下催化交換存在下催化交換反應(yīng)，使反應(yīng)，使ATP的的磷酸與磷酸與DNA、RNA 5端的磷酸端的磷酸基團(tuán)交換。此反應(yīng)的首選反應(yīng)緩沖液是咪唑緩沖液基團(tuán)交換。此反應(yīng)的首選反應(yīng)緩沖液是咪唑緩沖液（pH6.4）。此法標(biāo)記效率較低，不如正向反應(yīng)常用。）。此法標(biāo)記效率較低，不如正向反應(yīng)常用。 T4 多核苷酸激酶催化的反應(yīng)大腸桿菌DNA連接酶的特點(diǎn) 大腸桿菌大腸桿菌DNA連接酶可催化含互相匹配的連接酶可催化含互相匹配的5突突出端或出端

37、或3突出端的雙鏈突出端的雙鏈DNA之間形成磷酸二酯鍵，之間形成磷酸二酯鍵，還可催化切口的連接。該反應(yīng)需要還可催化切口的連接。該反應(yīng)需要NAD+ 參與催化，參與催化，還需要還需要ATP和和Mg 2+。最初的研究表明，該酶不能催化。最初的研究表明，該酶不能催化平端雙鏈平端雙鏈DNA間的連接，但隨后發(fā)現(xiàn)，在聚乙二醇或間的連接，但隨后發(fā)現(xiàn)，在聚乙二醇或Ficoll（聚蔗糖）的存在下，該酶能催化平端的連接。（聚蔗糖）的存在下，該酶能催化平端的連接。 大腸桿菌大腸桿菌DNA連接酶不能連接連接酶不能連接RNA。 DNA連接酶催化的反應(yīng)T4 DNA連接酶的特點(diǎn) T4 DNA連接酶為一分子量為連接酶為一分子量為

38、68kD的蛋白，它催的蛋白，它催化互補(bǔ)粘性末端的連接或切口的連接。它還可以催化互補(bǔ)粘性末端的連接或切口的連接。它還可以催化平端的連接，連接平頭末端所需的酶量為連接粘化平端的連接，連接平頭末端所需的酶量為連接粘性末端的性末端的1020倍。加入倍。加入150200mmol/L的的NaCl及低及低濃度的濃度的PEG可大大提高平端連接的速率?？纱蟠筇岣咂蕉诉B接的速率。T4 DNA連連接酶催化連接反應(yīng)也需要接酶催化連接反應(yīng)也需要ATP和和Mg2+。 37有利于有利于DNA連接酶的活性，但對(duì)粘性末端連接酶的活性，但對(duì)粘性末端的結(jié)合來(lái)說(shuō)溫度太高，兩者折衷，一般以的結(jié)合來(lái)說(shuō)溫度太高，兩者折衷，一般以415下下

39、進(jìn)行連接反應(yīng)為宜。進(jìn)行連接反應(yīng)為宜。 T4 RNA連接酶 T4 RNA連接酶催化單鏈連接酶催化單鏈DNA或或RNA與另一單與另一單鏈鏈DNA或或RNA連接。連接。 S1核酸酶（米曲霉） S1核酸酶是單鏈內(nèi)切酶，切割單鏈核酸酶是單鏈內(nèi)切酶，切割單鏈DNA或或RNA，產(chǎn)生帶產(chǎn)生帶5磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。雙鏈磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。雙鏈DNA、雙鏈雙鏈RNA及及DNA:RNA雜交體對(duì)此酶相對(duì)不敏感，但雜交體對(duì)此酶相對(duì)不敏感，但如果所用如果所用S1核酸酶的酶量非常大，則雙鏈核酸可被完核酸酶的酶量非常大，則雙鏈核酸可被完全消化。中等量的全消化。中等量的S1核酸酶可在缺口或切口處作用核酸酶可在缺口或

40、切口處作用（第二式）。該酶在酸性條件下作用，以（第二式）。該酶在酸性條件下作用，以Zn2+為活化為活化劑。劑。 Bal 31核酸酶（Alteromonas espejiana Bal 31） Bal 31核酸酶既是單鏈內(nèi)切酶，與核酸酶既是單鏈內(nèi)切酶，與S1核酸酶有同核酸酶有同樣的作用，又是雙鏈外切酶，可以從雙鏈樣的作用，又是雙鏈外切酶，可以從雙鏈DNA的兩的兩端有節(jié)制地降解雙鏈端有節(jié)制地降解雙鏈DNA，產(chǎn)生縮短的雙鏈，產(chǎn)生縮短的雙鏈DNA。后一功能可用于產(chǎn)生不同缺失程度的突變體。后一功能可用于產(chǎn)生不同缺失程度的突變體。 Bal31核酸酶催化的反應(yīng) DNase （牛胰） DNA內(nèi)切酶，內(nèi)切酶，M

41、g 2+存在時(shí)可在雙鏈存在時(shí)可在雙鏈DNA上造成上造成隨機(jī)切口，隨機(jī)切口，Mn2+存在時(shí)可在兩條鏈的大致同一位置存在時(shí)可在兩條鏈的大致同一位置上切割上切割DNA，產(chǎn)生平端，產(chǎn)生平端DNA片段，或產(chǎn)生只帶有片段，或產(chǎn)生只帶有12個(gè)核苷酸單鏈突出的片段。個(gè)核苷酸單鏈突出的片段。外切酶（大腸桿菌） 此酶從雙鏈此酶從雙鏈DNA的兩個(gè)的兩個(gè)3端逐個(gè)切下核苷酸，端逐個(gè)切下核苷酸，可作用于平端及可作用于平端及3凹端的雙鏈凹端的雙鏈DNA，不作用于單，不作用于單鏈鏈DNA及帶有及帶有3突出端的雙鏈突出端的雙鏈DNA。該酶持續(xù)作。該酶持續(xù)作用不強(qiáng)，因此產(chǎn)物一般為一個(gè)被切割程度不相上下用不強(qiáng)，因此產(chǎn)物一般為一個(gè)被

42、切割程度不相上下的的DNA分子集群。分子集群。 分子雜交 用帶有標(biāo)記的已知核酸片段（稱為探針）與用帶有標(biāo)記的已知核酸片段（稱為探針）與變性的未知核酸退火配對(duì)的過(guò)程就是分子雜交。變性的未知核酸退火配對(duì)的過(guò)程就是分子雜交。雜交有雜交有DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA雜交。雜交。通過(guò)分子雜交可以在許多不同核酸片段中尋找或通過(guò)分子雜交可以在許多不同核酸片段中尋找或探測(cè)出特定的核酸片段。探測(cè)出特定的核酸片段。 印 跡 分子雜交中的印跡，是將核酸分子從凝膠或細(xì)胞分子雜交中的印跡，是將核酸分子從凝膠或細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到膜上的過(guò)程。雜交必須在膜上進(jìn)行，所以電中轉(zhuǎn)移到膜上的過(guò)程。雜交必須在膜上進(jìn)行，所以

43、電泳分離的核酸或培養(yǎng)基上的菌落或噬菌斑必須先印跡泳分離的核酸或培養(yǎng)基上的菌落或噬菌斑必須先印跡到膜上。常用的膜有硝酸纖維素膜（到膜上。常用的膜有硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，NC膜）和尼龍（膜）和尼龍（nylon）膜。）膜。NC膜膜結(jié)合能力較強(qiáng)，雜交信號(hào)本底較低，缺點(diǎn)是膜質(zhì)脆易結(jié)合能力較強(qiáng)，雜交信號(hào)本底較低，缺點(diǎn)是膜質(zhì)脆易破，高溫下結(jié)合核酸分子不夠牢固。尼龍膜結(jié)合能力破，高溫下結(jié)合核酸分子不夠牢固。尼龍膜結(jié)合能力比比NC膜強(qiáng)，柔性好可反復(fù)使用，但有時(shí)雜交信號(hào)本膜強(qiáng)，柔性好可反復(fù)使用，但有時(shí)雜交信號(hào)本底較高。底較高。 分子雜交1Southern 印跡

44、印跡2Northern 印跡印跡3斑點(diǎn)印跡和狹線印跡斑點(diǎn)印跡和狹線印跡印跡種類雜交種類1 1濾膜雜交濾膜雜交2 2原位雜交原位雜交 菌落或噬菌斑原位雜交菌落或噬菌斑原位雜交 組織、細(xì)胞空間定位原位雜組織、細(xì)胞空間定位原位雜交交Sothern 雜交 Sothern blotting是是1975年由年由Southern建立并以建立并以他的名字命名的一種他的名字命名的一種DNA轉(zhuǎn)移方法。其基本方法是轉(zhuǎn)移方法。其基本方法是先將待測(cè)先將待測(cè)DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使DNA按片段按片段大小分開成帶，再用大小分開成帶，再用NaOH溶液處理電泳后的凝膠，溶液處理電泳后的凝膠，使其中的使

45、其中的DNA變性成單鏈，然后通過(guò)毛細(xì)作用將單變性成單鏈，然后通過(guò)毛細(xì)作用將單鏈鏈DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）或尼龍膜上，膜）或尼龍膜上，膜晾干后在膜晾干后在80（真空）烘烤（真空）烘烤2小時(shí)，使核酸片段結(jié)小時(shí)，使核酸片段結(jié)合得更牢固，再用標(biāo)記探針去雜交，通過(guò)放射自顯合得更牢固，再用標(biāo)記探針去雜交，通過(guò)放射自顯影或其他顯色方法找出雜交帶。影或其他顯色方法找出雜交帶。 Southern 印跡Southern雜交過(guò)程 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳堿變性堿變性中和中和印跡到膜上印跡到膜上80（真空）烘烤（真空）烘烤2小時(shí)小時(shí)預(yù)雜交預(yù)雜交雜交雜交顯帶顯帶 尼龍膜可用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和

46、電轉(zhuǎn)移，還可以用真尼龍膜可用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和電轉(zhuǎn)移，還可以用真空轉(zhuǎn)移裝置進(jìn)行真空轉(zhuǎn)移。在以尼龍膜為固相載體空轉(zhuǎn)移裝置進(jìn)行真空轉(zhuǎn)移。在以尼龍膜為固相載體時(shí)，采用雙鏈時(shí)，采用雙鏈DNA轉(zhuǎn)移到膜上后再堿變性。轉(zhuǎn)移到膜上后再堿變性。 Northern印跡 將將RNA進(jìn)行變性和凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到膜上的進(jìn)行變性和凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到膜上的過(guò)程稱為過(guò)程稱為Northern blotting。此法的基本原理與。此法的基本原理與Southern blotting相同，只是不能采用堿變性，因?yàn)橄嗤?，只是不能采用堿變性，因?yàn)閴A會(huì)破壞堿會(huì)破壞RNA。RNA的分離采用變性凝膠電泳，變的分離采用變性凝膠電泳，變性劑為甲醛或乙二醛。提取、純化和分離性劑