1.1DNA重組技術(shù)的基本工具學(xué)習(xí)課程

1、第1頁/共31頁第一頁，編輯于星期四：二十點 四十分。 DNADNA是遺傳物質(zhì)的證明是遺傳物質(zhì)的證明 DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立 遺傳密碼的破譯遺傳密碼的破譯 基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn) 工具酶的發(fā)明工具酶的發(fā)明 DNADNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明合成和測序技術(shù)的發(fā)明 DNADNA體外重組的實現(xiàn)體外重組的實現(xiàn) 重組重組DNADNA表達(dá)實驗的成功表達(dá)實驗的成功 第一例轉(zhuǎn)基因動物問世第一例轉(zhuǎn)基因動物問世 PCRPCR技術(shù)的發(fā)明技術(shù)的發(fā)明基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)理論技術(shù)發(fā)明技術(shù)發(fā)明第2頁/共31頁第二頁，編輯于星期四：二十點 四十分。重組重組DNA導(dǎo)入導(dǎo)入拼接拼接

2、普通棉花不具有抗蟲性，科學(xué)普通棉花不具有抗蟲性，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌能夠產(chǎn)生一家發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌能夠產(chǎn)生一種毒蛋白，對棉鈴蟲有一定的殺傷種毒蛋白，對棉鈴蟲有一定的殺傷作用。作用。試設(shè)計一個簡單的方案，使棉花對試設(shè)計一個簡單的方案，使棉花對棉鈴蟲也有抵抗作用棉鈴蟲也有抵抗作用. .第3頁/共31頁第三頁，編輯于星期四：二十點 四十分。第4頁/共31頁第四頁，編輯于星期四：二十點 四十分。第5頁/共31頁第五頁，編輯于星期四：二十點 四十分。 第一節(jié) DNA重組技術(shù)的基本工具第6頁/共31頁第六頁，編輯于星期四：二十點 四十分。DNA重組技術(shù)的基本工具 準(zhǔn)確切割DNA的工具（“分子手術(shù)刀”）

3、 DNA片段的連接工具（“分子縫合針”） 基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運輸車”）基因的大小以納米計算，要對它進(jìn)行剪切、拼基因的大小以納米計算，要對它進(jìn)行剪切、拼接等操作，沒有非常精細(xì)的工具是不行的。進(jìn)行基接等操作，沒有非常精細(xì)的工具是不行的。進(jìn)行基因操作最少需要以下三種工具：因操作最少需要以下三種工具：第7頁/共31頁第七頁，編輯于星期四：二十點 四十分。第8頁/共31頁第八頁，編輯于星期四：二十點 四十分。來源來源種類種類作用作用作用結(jié)作用結(jié)果果閱讀課本4-54-5頁“限制性核酸內(nèi)切酶分子手術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)自主學(xué)習(xí)主要從原核生物中分離純化而來已經(jīng)分離出大約40004000種1 1、

4、識別雙鏈DNADNA分子的某種特定核苷酸序列2、使每一條鏈中使每一條鏈中特定部位特定部位的兩個核苷酸的兩個核苷酸之間的之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵斷開。斷開。第9頁/共31頁第九頁，編輯于星期四：二十點 四十分。12345脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)第10頁/共31頁第十頁，編輯于星期四：二十點 四十分。 G1234512345 A3,5-3,5-磷磷酸二酯鍵酸二酯鍵3端5端3端5端磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵第11頁/共31頁第十一頁，編輯于星期四：二十點 四十分。12仔細(xì)觀察各限制酶仔細(xì)觀察各限制酶 識別的特定序列有何識別的特定序列有何 特點？特點？限制酶的識別序列限制酶的識別序列限制酶所識別的

5、序列的特限制酶所識別的序列的特點是：點是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6 6個堿基還是4 4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNADNA上的堿基是反反向?qū)ΨQ重復(fù)向?qū)ΨQ重復(fù)排列的 ，稱為回文序列第12頁/共31頁第十二頁，編輯于星期四：二十點 四十分。中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoR)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用第13頁/共31頁第十三頁，編輯于星期四：二十點 四十分。黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切開的被限制酶切開的DNA兩條單兩條單鏈的切口，帶

6、有幾個鏈的切口，帶有幾個伸出的核伸出的核苷酸苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫這樣的切口叫黏性末端黏性末端。第14頁/共31頁第十四頁，編輯于星期四：二十點 四十分。SmaISmaI只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。中軸線SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G與C之間切割第15頁/共31頁第十五頁，編輯于星期四：二十點 四十分。SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割當(dāng)限制酶當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，從識別序列的中心軸線處切開時，切開的切開的DNADNA兩兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端平

7、末端。第16頁/共31頁第十六頁，編輯于星期四：二十點 四十分。你能推測限制酶存在于原核生物中的你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？作用是什么嗎？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。制，以防止外來病原物的侵害。限制酶限制酶就是細(xì)就是細(xì)菌的一種菌的一種防御性工具，防御性工具，當(dāng)外源當(dāng)外源DNA侵入時，會侵入時，會利用限制酶利用限制酶將外源將外源DNA切割掉，切割掉，以保證自身的以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切安全。所以

8、，限制酶在原核生物中主要起到切割外源割外源DNA、使之失效，使之失效，從而達(dá)到從而達(dá)到保護(hù)自身保護(hù)自身的的目的。目的。尋根問底尋根問底為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其的細(xì)胞，其DNADNA分子中分子中不具備這種限制酶的不具備這種限制酶的識別切割序列識別切割序列，或者或者通過甲基化酶將甲基通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會使自身的制酶也不會使自身

9、的DNADNA被切斷，并且可以被切斷，并且可以防止外源防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 第17頁/共31頁第十七頁，編輯于星期四：二十點 四十分。類型來源功能相同點差別EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)閱讀課本第5頁“分子縫合針”DNA連接酶的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)第18頁/共31頁第十八頁，編輯于星期四：二十點 四十分。把切下來的把切下來的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA，即將，即將脫脫氧核糖氧核糖和和磷酸磷酸連接起來催化形成連接起來催化形成磷酸二酯鍵DNADNA連接酶的作用連接酶的作用第1

10、9頁/共31頁第十九頁，編輯于星期四：二十點 四十分。兩兩DNADNA片段要具有片段要具有互補(bǔ)的互補(bǔ)的黏性末端黏性末端才能拼起來才能拼起來DNADNA連接酶的縫合作用連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的可把黏性末端之間的縫隙縫隙“縫合縫合”起來起來，注意：注意：DNADNA連接酶可連接雙鏈連接酶可連接雙鏈DNADNA中的中的DNADNA單鏈缺口，但不能連接單鏈單鏈缺口，但不能連接單鏈DNADNA！第20頁/共31頁第二十頁，編輯于星期四：二十點 四十分。DNADNA連接酶與DNADNA聚合酶是一回事嗎？T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNADNA連接酶的縫合作用連

11、接酶的縫合作用第21頁/共31頁第二十一頁，編輯于星期四：二十點 四十分。DNA連接酶連接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同點點作用實質(zhì)作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不不同同點點模板模板作用對象作用對象 作用結(jié)果作用結(jié)果用途用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與連接酶與DNA聚合酶的比較聚合酶的比較只能將單個核苷酸連接只能將單個核苷酸連接到已有的到已有的DNADNA片段片段上，上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵在兩個兩個DNADNA片段片段之間之間形成磷酸二酯鍵第22頁/共31頁第二十二頁，編輯于星期四：二十點 四十分。限制性

12、內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點是的識別序列和切點是GGATCCGGATCC，限制，限制性內(nèi)切酶性內(nèi)切酶的識別序列和切點是的識別序列和切點是GATCGATC。在質(zhì)粒上有酶。在質(zhì)粒上有酶的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有一個酶的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有一個酶的切點。的切點。（1 1）請畫出質(zhì)粒被限制酶）請畫出質(zhì)粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（2 2）請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶）請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶切割后所形成的黏性末切割后所形成的黏性末端。端。（3 3）在）在DNADNA連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的

13、黏性末端能否連接？為什么？的黏性末端能否連接？為什么？可以連接。因為由兩種不同限制酶切割后形成可以連接。因為由兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互補(bǔ)的）的黏性末端是相同的（或是可以互補(bǔ)的） 第23頁/共31頁第二十三頁，編輯于星期四：二十點 四十分。載體的作載體的作用用載體的必要條件載體的載體的種類種類閱讀課本第6 6頁“分子運輸車”運載體的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)自主學(xué)習(xí)細(xì)菌的質(zhì)粒細(xì)菌的質(zhì)粒病毒：病毒：、動植物病毒等、動植物病毒等。 第24頁/共31頁第二十四頁，編輯于星期四：二十點 四十分。有標(biāo)記基因的存有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別素的培養(yǎng)基

14、鑒別。有切割位點有切割位點能復(fù)制并帶能復(fù)制并帶著插入的目著插入的目的基因一起的基因一起復(fù)制復(fù)制質(zhì)粒質(zhì)粒裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細(xì)菌染色體（即擬核DNADNA）之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNADNA分子。最常用運載體最常用運載體質(zhì)粒質(zhì)粒 實際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。第25頁/共31頁第二十五頁，編輯于星期四：二十點 四十分。隨堂練習(xí)：1、關(guān)于限制酶的說法中，正確的是（ ）A、限制酶是一種酶，只識別GAATTC堿基序 列B、EcoRI切割的是GA之間的氫鍵C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切 割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中答案答案：C第26頁/共31頁第二十六頁，編輯于星期四：二十點 四十分。2. （多選）答案：答案：BD第27頁/共31頁第二十七頁，編輯于星期四：二十點 四十分。3.3.下列四條DNADNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是 A A B B C C D D答案：答案：D第28頁/共31頁第二十八頁，編輯于星期四：二十點 四十分。DNA連接酶連接酶“分子縫合針分子縫合針” 作用作用把兩條把兩條DNADNA末端之間的縫隙末端之間的縫隙“縫合縫合”起來。起來。G A A T T C C T T A A G 即脫氧核糖