解讀個體化醫(yī)學(xué)檢測與實(shí)驗(yàn)室自建試劑方法

1、解讀個體化醫(yī)學(xué)檢測與實(shí)驗(yàn)室自建試劑方法 李金明個體化醫(yī)學(xué)（personalized medicine）通俗顧講，就是疾病的治療“因人而異”的醫(yī)學(xué)，確切地說，是根據(jù)每個患者的個體特征制定相應(yīng)的治療策略的醫(yī)學(xué)，但并不意味著對每個病人都準(zhǔn)備一套藥物或設(shè)立一套治療設(shè)備，而是根據(jù)患者對特定疾病的易感性以及對特定治療的應(yīng)答程度進(jìn)行分類治療，使得預(yù)防或治療性的干預(yù)措施能集中于確定會受益的人群，從而為那些不會受益的人群節(jié)省醫(yī)療開支并減少藥物的副反應(yīng)。個體化醫(yī)學(xué)檢測則是為疾病的個體化治療決策服務(wù)的，也就是通過實(shí)驗(yàn)室檢測，確定患者是否會對特定的治療產(chǎn)生有效的應(yīng)答。2003年人類基因組計(jì)劃基本完成后，進(jìn)入到后基因組

2、時代，功能基因組的研究，揭示了占人類基因組約1%的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）不但決定個體的“高矮胖瘦”等外在特征，也決定了個體對外在刺激應(yīng)對能力以及進(jìn)入機(jī)體的化學(xué)物質(zhì)如藥物等的代謝能力，于是產(chǎn)生了藥物基因組學(xué)。各種細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的深入基出研究，產(chǎn)生了疾病的靶向治療概念，各種靶向治療藥物研發(fā)的跟進(jìn)，使得靶向治療成為現(xiàn)實(shí)，但靶向治療的有效性又與相應(yīng)基因結(jié)構(gòu)的改變、表達(dá)以及代謝密切相關(guān)。因此，進(jìn)行相應(yīng)基因及結(jié)構(gòu)改變以及基因表達(dá)等的檢測是相關(guān)檢測的基礎(chǔ)，在分子水平上做出臨床診斷，從而增加診斷的準(zhǔn)確性并根據(jù)患者的遺傳特征選擇合適的治療方法，這就是個體化醫(yī)學(xué)檢測，其意義通俗地講，就是決定特定的治療藥物或

3、方法是否能用或用多用少。個體化醫(yī)學(xué)檢測目前國內(nèi)既有經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的商品試劑，也有實(shí)驗(yàn)室自建試劑方法（laboratory developed tests， LDTs） ， 但實(shí)驗(yàn)室對LDTs 、性能驗(yàn)證（verification）和性能確認(rèn)（validation）等概念通常比較模糊，如何去做性能驗(yàn)證和性能確認(rèn)，以及在什么情況下做，性能驗(yàn)證的合格判決斷標(biāo)準(zhǔn)等，也不清楚。本文特就上述方面談一點(diǎn)個人的理解和思考。一、國內(nèi)個體化醫(yī)學(xué)檢測現(xiàn)狀及特點(diǎn)近幾年來，國內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室已開展了一些涉及腫瘤靶向治療基因突變和藥物代謝基因多態(tài)性檢測等個體化醫(yī)學(xué)檢測項(xiàng)目，并呈快速增加之勢

4、，有以下幾個方面的特點(diǎn)。1、 采用的技術(shù)平臺多以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的技術(shù)為主，如實(shí)時熒光PCR方法（包括擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)法Amplification Refractory Mutation System，ARMS、PCR-高分辨溶點(diǎn)曲線分析HRM等）、PCR-雜交法（如膜上、芯片基因芯片 、乳膠顆粒Luminex）、PCR-質(zhì)譜、PCR-Sanger測序、PCR-焦磷酸測序、PCR-新一代高通量測序等，其它較為常用的還有熒光原位雜交（FISH）和免疫組化等。2、 涉及的臨床科室多目前國內(nèi)開展個體化醫(yī)學(xué)檢測的臨床實(shí)驗(yàn)室所涉及的科室非常多，因?yàn)閭€體化藥物治療研究進(jìn)展日新月異，可考慮采用基

5、因檢測來決定藥物使用的藥物名單越拉越長，幾乎涉及所有臨床科室，只要相應(yīng)科室的主任有相應(yīng)知識和意識，也有實(shí)驗(yàn)室，就有可能去開展相關(guān)檢驗(yàn)項(xiàng)目。因此，國內(nèi)目前開展個體化醫(yī)學(xué)檢測項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室大部分在非檢驗(yàn)科的其它科室或臨床科室的研究實(shí)驗(yàn)室，如病理科、藥劑科、婦產(chǎn)科、腫瘤科、心胸外科、眼科、耳鼻喉科、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心、中心實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療機(jī)構(gòu)研究所和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所等。3、自配試劑多個體化醫(yī)學(xué)檢測盡管已有一些國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的檢測試劑，涉及約30余個檢驗(yàn)項(xiàng)目，但仍有許多實(shí)驗(yàn)室所使用的試劑為自配試劑或方法為自建方法，即LDTs，如幾乎所有PCR-Sanger測序、PCR-限制性長度片段多態(tài)性分析

6、（RFLP）、PCR-質(zhì)譜和PCR-高通量測序等。此外，有許多實(shí)驗(yàn)室對商品試劑盒的組份及操作進(jìn)行了改變，一旦出現(xiàn)這種改變，所用試劑即應(yīng)被視為LDTs。還有，如果使用無證商品試劑，也屬于LDTs。所以LDTs目前應(yīng)可以分為三類：（1）實(shí)驗(yàn)室通過購買試劑盒原材料如引物、探針、擴(kuò)增緩沖液、酶等，配制的自用試劑；（2）實(shí)驗(yàn)室購買的是經(jīng)過批準(zhǔn)的商品試劑，但對試劑盒組份或操作過程進(jìn)行了改變；（3）實(shí)驗(yàn)室購買的是未經(jīng)過批準(zhǔn)的無證商品試劑。二、國內(nèi)外對體外診斷產(chǎn)品和LDTs管理在北美和歐洲，涉及人類基因的個體化醫(yī)學(xué)檢測，極少有經(jīng)過批準(zhǔn)的商品試劑盒或檢測系數(shù)統(tǒng)，絕大部分都是由醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過使用LDTs來完成的。在

7、美國，1976年的聯(lián)邦食品、藥品和化妝品醫(yī)學(xué)產(chǎn)品法案修正案（The 1976 Medical Device Amendments to the Federal Food，Drug and Cosmetic Act，F(xiàn)D&CA)授權(quán)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）監(jiān)管包括體外診斷產(chǎn)品（in vitro diagnostic devices，IVDs）在內(nèi)的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。IVDs定義為用于疾病診斷或包括為治療或預(yù)防疾病確定患者健康狀態(tài)的其它目的的試劑、儀器和系統(tǒng)，為作為商品銷售。根據(jù)其對患者的風(fēng)險(xiǎn)評估分為三類，I類為低風(fēng)險(xiǎn)，用于患者前，不需要評估或批準(zhǔn)；類為中度風(fēng)險(xiǎn)，而進(jìn)行一般和特定的控制，常

8、需通過進(jìn)入市場前的告知方式或者510（K）過程由FDA進(jìn)行評估；類為高風(fēng)險(xiǎn)，則需要進(jìn)入市場前的批準(zhǔn)（premarket approval，PMA）程序。一般的藥物遺傳檢測屬于類。加拿大則將IVDs的風(fēng)險(xiǎn)分為四級，遺傳檢測歸為類，即對公眾健康有中等風(fēng)險(xiǎn)或?qū)€體有高風(fēng)險(xiǎn)。歐盟則制定了“體外診斷醫(yī)學(xué)產(chǎn)品指令”（the In Vitro Diagnostic Medical Devices DirectiveCouncil Directive 98/79/EC），作為歐盟的IVDs監(jiān)管的要求，設(shè)定了最低安全、質(zhì)量和性能標(biāo)準(zhǔn)，但具體評價由成員國的監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行，一旦通過一個國家的批準(zhǔn)，則全歐盟成員國通行有

9、效。在國內(nèi)，IVDs的監(jiān)管由國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）負(fù)責(zé)，管理法規(guī)是以國務(wù)院令形式發(fā)布醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例，同樣，IVDs按低、中和高風(fēng)險(xiǎn)分為三類，第一類實(shí)行產(chǎn)品備案管理，第二類、第三類實(shí)行產(chǎn)品注冊管理。二類由省級藥監(jiān)部門負(fù)責(zé)注冊，三類由CFDA負(fù)責(zé)注冊。相對于IVDs，臨床實(shí)驗(yàn)室為疾病診斷和治療進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測及報(bào)告結(jié)果，在美國應(yīng)遵循“1988年的臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988，CLIA)，具體由美國醫(yī)療保險(xiǎn)和醫(yī)療補(bǔ)助中心（the Centers for Medicare&

10、Medicaid Services，CMS）監(jiān)管，遵循CLIA要求對實(shí)驗(yàn)室檢查、認(rèn)證和認(rèn)可由CMS或獨(dú)立的授權(quán)機(jī)構(gòu)如病理學(xué)家協(xié)會（the College of American Pathologists，CAP）負(fù)責(zé)。CLIA關(guān)注的是檢測過程的準(zhǔn)確性和可靠性，以及質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評價（能力驗(yàn)證）、實(shí)驗(yàn)室檢測人員的證書、報(bào)告結(jié)果的要求和標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）文件，實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人起著核心作用。作為CLIA的一部分，F(xiàn)DA將實(shí)驗(yàn)室檢測根據(jù)其復(fù)雜程度分為豁免、中度和高度復(fù)雜三類，CLIA再針對這三類檢測提出不同的管理要求。CLIA允許臨床實(shí)驗(yàn)室修改FDA批準(zhǔn)的診斷產(chǎn)品以及研發(fā)其自己實(shí)驗(yàn)室的檢測，亦即L

11、DTs。在CLIA規(guī)則下的定期檢查確保LDTs遵循必要的程序，并且LDTs檢測只能是在執(zhí)業(yè)醫(yī)生、實(shí)驗(yàn)室科學(xué)家、遺傳學(xué)家和分子病理學(xué)家等實(shí)驗(yàn)室專家的指導(dǎo)下進(jìn)行。在美國絕大部分的基因遺傳相關(guān)檢測均采用LDTs，歐洲亦如此，但歐洲LDTs只適用于政府的公共醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室，可免于IVD Directive監(jiān)管，只能在自己實(shí)驗(yàn)室使用，如要提供給其它機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室，則需要走監(jiān)管程序。國內(nèi)針對LDTs在2000年發(fā)布的醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例（國務(wù)院令第276號）中的第十條規(guī)定，醫(yī)療機(jī)構(gòu)根據(jù)本單位的臨床需要，可以研制醫(yī)療器械，在執(zhí)業(yè)醫(yī)師指導(dǎo)下在本單位使用。2014年新發(fā)布的醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例（國務(wù)院令第650號）

12、刪去了這一條，但并沒有規(guī)定不允許自制醫(yī)療器械。近些年來，在美國一些商業(yè)實(shí)驗(yàn)室開展了直接針對消費(fèi)者的檢測項(xiàng)目（direct to consumer，DTC），主要是一些疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的項(xiàng)目，均為LDTs。因?yàn)槠湟饬x的不明確和結(jié)果解讀的問題，對被檢者有可能造成不可預(yù)知的困惑或傷害。例如，美國好萊塢著名女演員茱莉2013年5月14日在美國紐約時報(bào)發(fā)表了“My Medical Choice（我的醫(yī)療選擇）”一文，她表示自己由于攜帶乳腺癌1號基因（BRCA1），已經(jīng)接受預(yù)防性的雙側(cè)乳腺切除手術(shù)，以降低罹癌風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)茱莉介紹，自己的母親曾經(jīng)與癌癥作斗爭了近十年，于56歲時去世。由于媽媽給她遺傳了BRCA1基因

13、，因此患乳腺癌和卵巢癌的幾率比較高，分別是87%和50%。因此，美國FDA試圖對LDTs進(jìn)行有限的監(jiān)管，2014年7月再次向美國國會提交議案，在這份提案中FDA計(jì)劃按照LDT類型分為I級低風(fēng)險(xiǎn)；II級中度風(fēng)險(xiǎn)，III級高風(fēng)險(xiǎn)，分別對應(yīng)告知（reporting）、注冊（registration）、510(k)認(rèn)證等監(jiān)管要求。對于罕見疾病，以及有巨大的臨床需求，且安全性被證實(shí)的診斷技術(shù)，F(xiàn)DA把它劃為I級低風(fēng)險(xiǎn)，仍然由CMS監(jiān)管。但也有眾多學(xué)者反對，提出FDA是管診斷產(chǎn)品的，而臨床實(shí)驗(yàn)室研發(fā)LDTs提供的只是一種醫(yī)學(xué)服務(wù)，并非產(chǎn)品。但強(qiáng)調(diào)LDTs在臨床應(yīng)用前，應(yīng)有嚴(yán)格的性能確認(rèn)程序，使用中有嚴(yán)格的

14、質(zhì)量控制和使用情況監(jiān)控。國內(nèi)LDTs如何能有效地為臨床服務(wù)，如何進(jìn)行管控是值得業(yè)界思考的一個問題。三、性能驗(yàn)證和性能確認(rèn) 為保證檢驗(yàn)質(zhì)量，臨床實(shí)驗(yàn)室在正式開展日常檢測之前，應(yīng)對其檢測試劑方法或系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證（verification）或性能確認(rèn)（validation）。性能驗(yàn)證在廣義上的概念是指通過提供客觀證據(jù)證明特定的要求得到滿足。而美國的CLIA中的性能驗(yàn)證術(shù)語特指使用某特定檢測試劑或系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室按照所提供的試劑盒或檢測系統(tǒng)說明書使用時，能復(fù)現(xiàn)生產(chǎn)廠家所宣稱的檢測性能。說明性能驗(yàn)證特指針對經(jīng)批準(zhǔn)的商品試劑或檢測系統(tǒng)，其所要驗(yàn)證的是在特定的實(shí)驗(yàn)室條件（環(huán)境、人員、標(biāo)準(zhǔn)操作程序）下

15、的檢測性能指標(biāo)是否與試劑盒說明書上所標(biāo)示的是一致的。因此，對各項(xiàng)檢測性能指標(biāo)如精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性等的驗(yàn)證是否合格的判斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)以試劑盒說明書為準(zhǔn)，如何進(jìn)行性能驗(yàn)證也可按試劑盒說明書中相應(yīng)性能指標(biāo)確立時的方法進(jìn)行，但可以適當(dāng)簡化。而性能確認(rèn)（validation），美國FDA和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）均將其定義為，通過檢查和提供客觀證據(jù)證明，對一特定預(yù)期用途（intended use）的要求始終能得到滿足。性能驗(yàn)證和性能確認(rèn)在美國FDA和ISO術(shù)語相似，差異在后者的“預(yù)期用途”。比如說，某實(shí)驗(yàn)室自制了一個表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）1821號外顯子基因突變檢測試劑，也就是其預(yù)期用途是檢測上述基因突變，性能確認(rèn)就是通過實(shí)驗(yàn)所提供的客觀證據(jù)證明該試劑是否能正確的且可重復(fù)地檢測到相應(yīng)基