花椰菜畢業(yè)論文

1、目 錄摘要 1引言 11 材料與方法 31.1材料31.2實(shí)驗(yàn)方法3 1.2.1花椰菜無(wú)菌的準(zhǔn)備 31.2.2不同苗齡的外植體的獲得 31.2.3 AgNO3對(duì)不定芽分化的影響 31.2.4不定芽的生根培養(yǎng)及再生植株的移栽 41.3再生頻率與每塊外植體再生芽數(shù)的計(jì)算42 結(jié)果分析42.1激素濃度對(duì)不定芽分化的影響42.2不同基因型和苗齡對(duì)不定芽分化的影響52.3AgNO3對(duì)外植體分化能力的影響53小結(jié)與討論 5謝辭 6參考文獻(xiàn) 7花椰菜下胚軸高頻再生體系的建立摘要：本文就NAA濃度、基因型和外植體苗齡的不同對(duì)花椰菜下胚軸再生的影響進(jìn)行了初步的研究與探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：?jiǎn)为?dú)使用 6-BA 時(shí)，不

2、定芽產(chǎn)生較少，而配合一定濃度的NAA時(shí)，不定芽分化率增加。但當(dāng)NAA濃度大于0.2mg/L時(shí)，外植體分化出大量的不定根并很少有不定芽產(chǎn)生。只有在 2.0mg/L6-BA和 0.05 mg/LNAA 配合使用，才能達(dá)到最佳的誘導(dǎo)效果。關(guān)鍵詞：花椰菜 下胚軸 高頻 再生體系引言花椰菜又稱(chēng)花菜或菜花，屬于十字花科蕓薹屬的栽培植物，原產(chǎn)于地中海北岸，傳入我國(guó)已有二百多年的歷史。目前我國(guó)花椰菜種植面積已達(dá)35.3萬(wàn)km2，居世界第一位?；ㄒ怂瑺I(yíng)養(yǎng)成分極其豐富，每10g花菜含蛋白質(zhì)2.0g，碳水化合物3-4g，還有礦物質(zhì)及維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中Vc含量居十字花科蔬菜之首。更加可貴的是，其含有多種吲

3、哚類(lèi)衍生物，可提高肝臟的芳香羥化酶的活性，能增強(qiáng)分解致癌物質(zhì)的能力。自從首次在花椰菜愈傷組織上得到再生植株以來(lái)，花椰菜組織培養(yǎng)得到迅速發(fā)展，現(xiàn)在可以通過(guò)直接分化再生、愈傷組織再生、胚狀體再生、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和原生質(zhì)體再生等方式得到再生植株，而通過(guò)子葉、下胚軸和子葉節(jié)直接再生可以保持原有品質(zhì)或親本的優(yōu)良性狀，這為轉(zhuǎn)基因的順利進(jìn)行做了充分的準(zhǔn)備。建立高效穩(wěn)定的植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的再生系統(tǒng)是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因的重要前提。本實(shí)驗(yàn)除了激素成分不同，還存在基因型、外植體類(lèi)型及部位、苗齡、苗態(tài)、培養(yǎng)基和AgNO3 對(duì)花椰菜高頻再生的影響。1.基因型的影響植物離體形態(tài)發(fā)生能力與基因型有著密切的關(guān)系，基

4、因型對(duì)再生頻率有很大影響。許多研究表明1-2，甘藍(lán)型油菜較白菜型油菜容易再生與轉(zhuǎn)化，并且甘藍(lán)及其變種較白菜變種容易再生得多。有研究表明，調(diào)控芽形成的基因可能位于C基因組。因此，具有C基因組的甘藍(lán)和花椰菜等容易再生，然而花椰菜再生體系建立的過(guò)程中，始終存在基因型決定問(wèn)題。2.外植體類(lèi)型及部位可實(shí)現(xiàn)再生的花椰菜外植體有子葉、下胚軸、葉片、莖段、大田植株的花蕾、花藥、原生質(zhì)體等，而通過(guò)子葉、下胚軸和子葉節(jié)直接再生可以保持原有品質(zhì)或親本的優(yōu)良性狀，雖然其對(duì)農(nóng)桿菌比較敏感，但因不受時(shí)間的限制，再生率很高，且操作方便，是近年來(lái)組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最多的外植體來(lái)源。3.苗齡和苗態(tài)在進(jìn)行花椰菜離體培養(yǎng)時(shí)，子

5、葉、下胚軸等外植體的生理年齡也是決定離體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。不同組織由于分化程度、生理狀態(tài)和處理?xiàng)l件等不同，其分化和脫分化的能力不同，再生的難易程度也不一樣。苗齡對(duì)外植體的再生有重要的影響，原因可能是細(xì)胞在特定的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期容易進(jìn)行分化和脫分化。有學(xué)者認(rèn)為幼嫩的外植體更容易誘導(dǎo)再生芽，分化能力隨著苗齡的增加而下降。一般來(lái)說(shuō)無(wú)菌苗苗齡為6-7d的下胚軸為最佳外植體。苗齡太長(zhǎng)，下胚軸導(dǎo)管細(xì)胞的形成不利于芽的誘導(dǎo)；相反，若苗齡太短，則不能獲得大量的下胚軸用于實(shí)驗(yàn)，且不利于實(shí)驗(yàn)操作，容易切到生長(zhǎng)點(diǎn)，形成假陽(yáng)性植株。4.培養(yǎng)基建立良好再生體系的一個(gè)主要工作是篩選出最佳培養(yǎng)基。一般花椰菜組織培養(yǎng)采

6、用MS和MSB（MS+B5有機(jī)）為基本培養(yǎng)基，除此之外用于花椰菜組織培養(yǎng)的使用其他培養(yǎng)基進(jìn)行還未見(jiàn)報(bào)道。5.激素成分對(duì)于芽的分化最重要的是選擇最佳激素組合。一般來(lái)說(shuō)細(xì)胞分裂素有利于芽的分化，生長(zhǎng)素有利于根的分化和愈傷組織的形成，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值高有利于芽的分化3。6-BA是蕓薹屬作物轉(zhuǎn)化中最常用的一種激素，花椰菜、甘藍(lán)等以子葉為外植體時(shí)，單獨(dú)使用以4-5mg/L為宜，與其他激素結(jié)合使用時(shí)濃度應(yīng)適當(dāng)減少4。嚴(yán)慧玲、潘仰星等10用1-3mg/L 6-BA和NAA相配合也得到了花椰菜下胚軸較高的分化率。歐陽(yáng)麗瑩、唐章林認(rèn)為用含2,4-D的培養(yǎng)基對(duì)子葉進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，能顯著增加芽的誘導(dǎo)頻率。對(duì)于部

7、分分化能力差，但存在較高分化潛力的外植體，通過(guò)預(yù)培養(yǎng)中2,4-D的作用，能誘導(dǎo)具分化潛力的細(xì)胞進(jìn)入較強(qiáng)的細(xì)胞分裂狀態(tài)，從而誘導(dǎo)其產(chǎn)生不定芽。添加TDT、CPUU、GA3、ABA等可促進(jìn)芽的分化或提高再生芽的質(zhì)量。一般利用組培篩選得到的最佳培養(yǎng)基可以直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，但王曉峰等通過(guò)多個(gè)甘藍(lán)品種的試驗(yàn)得出子葉柄和下胚軸受農(nóng)桿菌侵染后再生比常規(guī)組培需要較高的生長(zhǎng)素濃度，但在花椰菜組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化中沒(méi)見(jiàn)到類(lèi)似情況。6.AgNO3的影響植物細(xì)胞在離體培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量乙烯，尤其是在密封的培養(yǎng)器中，乙烯的大量積累會(huì)直接影響外植體生長(zhǎng)和芽的分化，增加褐化和死亡幾率。AgNO3對(duì)許多植物的形態(tài)發(fā)生有促進(jìn)作用。

8、一般認(rèn)為AgNO3能競(jìng)爭(zhēng)性地作用于乙烯作用部位，從而抑制乙烯活性，進(jìn)而促進(jìn)植物器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生，也有研究者認(rèn)為由于Ag+存在，乙烯不能干擾多胺的合成，Ag+通過(guò)促進(jìn)多胺的合成提高器官和體細(xì)胞胚胎發(fā)生頻率。據(jù)報(bào)道，在外植體誘導(dǎo)再生芽的培養(yǎng)基中添加適量AgNO3，可以顯著提高蕓薹屬作物離體培養(yǎng)時(shí)不定芽的再生頻率5。在花椰菜轉(zhuǎn)化培養(yǎng)不含AgNO3時(shí)，De Block等發(fā)現(xiàn)芽的形成會(huì)受到抑制，而在有選擇壓時(shí)添加2-4mg/LAgNO3對(duì)獲得有效芽是必要。在促進(jìn)再生中AgNO3的最適濃度因不同基因型而不同，一般在篩選條件下AgNO3的常規(guī)用量12-120mg/L，并且AgNO3能顯著降低褐化及玻

9、璃化現(xiàn)象?；ㄒ讼屡咻S的高頻再生雖然影響因素很多，但本實(shí)驗(yàn)已盡量克服，制訂了以下實(shí)驗(yàn)方案，并得出結(jié)論。1 材料與方法1.1 材料花椰菜DH純系，花1、花2、花3。各階段培養(yǎng)基：種子萌發(fā)培養(yǎng)基：1/2MS培養(yǎng)基（MS無(wú)機(jī)鹽和維生素均減半）分化培養(yǎng)基：MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LIAA+0.8 mg/LAgNO3生根培養(yǎng)基：MS或1/2MS培養(yǎng)基，配以0.1 mg/L NAA1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 花椰菜無(wú)菌苗的準(zhǔn)備將花椰菜成熟種子用0.1%HgCl2浸泡4min，然后用無(wú)菌水洗滌4-5次。于無(wú)菌環(huán)境下接種到1/2MS基本培養(yǎng)基上，在25-26下暗培養(yǎng)1-2d待露白后，進(jìn)行（16h

10、光照/8h暗）光照培養(yǎng)，光強(qiáng)為1600-2000lx，并開(kāi)始計(jì)算苗齡。1.2.2 不同苗齡的外植體的獲得取種子露白后苗齡4-10d的無(wú)菌幼苗，在近生長(zhǎng)點(diǎn)處，用鋒利的剪刀切取下胚軸為外植體，放在含有不同激素配比的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)基因型約50個(gè)外植體，設(shè)3次重復(fù)，篩選最佳培養(yǎng)基及最適于分化的植株?duì)顟B(tài)及基因型。1.2.3 AgNO3對(duì)不定芽分化的影響以MS加0.2mg/LIAA、3mg/L6-BA為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度AgNO3(0， 2，4，6, 8 mg/L)，比較不同濃度AgNO3對(duì)外植體不定芽分化的影響。AgNO3的添加采用抽濾滅菌，待培養(yǎng)基冷卻到約60時(shí)加入。1.2.4 不定芽的生根

11、培養(yǎng)及再生植株的移栽當(dāng)根長(zhǎng)至1.5cm左右，數(shù)量達(dá)到5根以上后，開(kāi)瓶蓋煉苗，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，保濕，10-15d定植至大田，統(tǒng)計(jì)再生苗成活率，并進(jìn)行生物學(xué)性狀觀察。待芽長(zhǎng)到3-4cm時(shí)將其切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上選擇生根，3-4周后產(chǎn)生不定根，根白色，須根發(fā)達(dá)。移栽前2d先打開(kāi)培養(yǎng)容器蓋子煉苗，移栽時(shí)從培養(yǎng)基中輕輕的拔出根系，然后用自來(lái)水沖洗，注意不要傷根， 再將苗栽于滅菌的培養(yǎng)土中，澆上適量的水，并用透明的塑料紙或其他透明的東西罩住以保持葉面濕度，然后逐漸敞開(kāi)，待一定大小后定植于溫室。仔細(xì)管理，成活率可達(dá)98%以上。1.3 再生頻率與每塊外植體再生芽數(shù)的計(jì)算分化頻率% = (再生不定芽的外植體數(shù)/

12、接種外植體總數(shù))×100%平均出芽數(shù) = 外植體不定芽總數(shù)/再生不定芽的外植體總數(shù)2. 結(jié)果與分析2.1 激素濃度對(duì)不定芽分化的影響表1 花1下胚軸在不同激素配比下的再分化率6-BA（mg/L）NAA(mg/L)分化率（%）平均出芽率（%）2050.34.020.0599.49.520.179.33.620.278.83.820.370.24.220.460.63.820.562.43.221.024.41.5注：基本培養(yǎng)基為MS；取苗齡6d的下胚軸為外植體材料。影響外植體再生頻率的主要因素是培養(yǎng)基中的激素濃度及配比。就花1材料而言（見(jiàn)表1），MS在添加6-BA濃度為2.0mg/L和

13、NAA0.05 mg/L時(shí)再生頻率最高，最高可達(dá)100%，每個(gè)外植體分化的叢生芽也較多為9.4個(gè)。在最佳培養(yǎng)基上，其再生方式為直接再生，不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，只是在子葉柄和下胚軸兩端有少許愈傷組織積累繼而有綠色叢生芽從中突出。當(dāng)NAA濃度大于0.2mg/L時(shí)外植體也有分化，但先有根毛產(chǎn)生。2.2不同基因型和苗齡對(duì)不定芽分化的影響將3個(gè)花椰菜DH純系無(wú)菌苗及不同苗齡下胚軸分別接種在分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)其產(chǎn)生不定芽，評(píng)價(jià)各品系的再生能力，為下一步遺傳轉(zhuǎn)化篩選再生能力強(qiáng)的受體品種。結(jié)果表明（見(jiàn)表2），花椰菜不同基因型的再生能力有很大差異。另外，同一品種不同苗齡的外植體再生能力也有差別。以花1DH系、6天

14、苗齡下胚軸分化能力最好，外植體再生芽率近100%。表2 基因型及苗齡對(duì)外植體（下胚軸）分化能力的影響基因型苗齡分化率（%）平均出芽數(shù)（個(gè)）花1498.38.0花1699.49.5花1885.36.6花11068.84.8花2480.22.2花2683.63.2花2872.42.2花21044.42.5花3490.13.8花3692.33.1花3883.53.3花31041.81.82.3 AgNO3對(duì)外植體分化能力的影響植物組織培養(yǎng)過(guò)程中往往伴隨著乙烯的產(chǎn)生，而乙烯的存在對(duì)植物組織的分化有強(qiáng)烈的抑制作用，嚴(yán)重降低外植體的轉(zhuǎn)化頻率。AgNO3可以在某種程度上抑制乙烯的生成。但在本實(shí)驗(yàn)中，AgNO

15、3對(duì)花椰菜外植體再生芽率沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，而當(dāng)其濃度增加到5mg/l時(shí)，大大降低外植體芽再生效率。3. 小結(jié)與討論植物外植體再生能力是影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化能否成功的重要因7。植物材料的苗齡、外植體部位、培養(yǎng)基及激素配比濃度等均可能影響芽的分化效率。供試苗狀態(tài)是影響花椰菜再生的重要因素。不同苗齡的外植體分化能力有明顯差異。苗齡對(duì)外植體再生影響的原因可能是細(xì)胞在特定的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期容易進(jìn)行分化和脫分化。有學(xué)者認(rèn)為幼嫩的外植體更容易誘導(dǎo)再生芽，分化能力隨著苗齡的增加而下降。一般來(lái)說(shuō)無(wú)菌苗苗齡為6-7d的下胚軸為最佳外植體。在植物的離體培養(yǎng)過(guò)程中，基因型的依賴(lài)性是一種普遍現(xiàn)象?；ㄒ耸鞘|薹屬中難馴

16、服的品種之一，在離體培養(yǎng)時(shí)也存在基因型依賴(lài)問(wèn)題。本研究對(duì) 3 個(gè)花椰菜品種進(jìn)行不定芽再生實(shí)驗(yàn)也表明，花椰菜各品種之間再生能力有一定差異。其中花1的再生能力最強(qiáng)，最高可達(dá)100%，而花2僅為80%左右。細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素對(duì)于離體組織的培養(yǎng)和細(xì)胞增殖、分化、芽和根的誘導(dǎo)起著關(guān)鍵的作用8。一般來(lái)說(shuō)，生長(zhǎng)素促進(jìn)不定根的形成，而細(xì)胞分裂素則促進(jìn)不定芽的分化。關(guān)于花椰菜下胚軸再生培養(yǎng)中激素組合及配比的研究很多，結(jié)論也不相同。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用 6-BA 時(shí)，不定芽產(chǎn)生較少，而配合一定濃度的NAA時(shí)，不定芽分化率增加。但當(dāng)NAA濃度大于0.2mg/L時(shí)，外植體分化出大量的不定根并很少有不定芽產(chǎn)生。只有在

17、2.0mg/L6-BA和 0.05 mg/LNAA 配合使用，才能達(dá)到最佳的誘導(dǎo)效果。謝辭我要深深地感謝我的兩位導(dǎo)師-劉健老師和盛小光老師。本論文正式在她們的指導(dǎo)和幫助下完成的。在論文選題、收集數(shù)據(jù)和理論研究方面，兩位老師給了我不同的幫助。這篇論文從選題到結(jié)構(gòu)大綱再到初稿修改最后定稿，劉老師都給予了我很多寶貴的建議。感謝我的父母，謝謝你們賦予我生命和健康的體格，使我有機(jī)會(huì)經(jīng)歷這美好而精彩的人生；謝謝你們的無(wú)私的愛(ài)和奉獻(xiàn)，在我的一步步成長(zhǎng)中你們?nèi)找嫔n老，永遠(yuǎn)不變的卻是那關(guān)注的眼神和無(wú)論何時(shí)都在身后的堅(jiān)定的支持和鼓勵(lì)；謝謝你們的尊重，使我更好的選擇自己人生要走的道路。謝謝我的室友們，你們是我最珍貴的朋友。生病時(shí)不離不棄細(xì)致入微的照顧，因?yàn)橛心銈?，我們學(xué)習(xí)上相互鼓勵(lì)，生活上相互照顧，無(wú)話(huà)不談的親密無(wú)所顧忌的開(kāi)懷，我的生活才充滿(mǎn)了一種叫做幸福的色彩。畢業(yè)在即，無(wú)論我們以后身在何處，我 的心永遠(yuǎn)與你們?cè)谝黄?，留在這珞珈山下的某個(gè)地方。還要感謝我的可愛(ài)的同學(xué)朋友們，有你們的參與，我的人生才如此的多彩。謝謝你們！參考文獻(xiàn)1 張鵬，凌定厚. 提高離體植株再生頻率的研究J.植物學(xué)報(bào)，1995，37（11）：902-9082 張鵬，傅愛(ài)根，王愛(ài)國(guó). AgNO3在植物離體培養(yǎng)中的作用及可能的機(jī)制J.植物生理學(xué)通報(bào), 1997，33（5）：376-3793