2019年第七章離體授粉.doc

1、第七章離體授粉1離體授粉的概念和種類1.1 離體授粉的概念離體授粉(pollination in vitro )是指將未授粉的胚珠或子房 從母體上分離下來，進(jìn)行無菌培養(yǎng)，并以一定的方法授以無菌花粉， 使之在試管內(nèi)實(shí)現(xiàn)受精的技術(shù)，又稱為離體受精(fertilization in vitro )或試管受精(test tube fertilization )。1.2 離體授粉的種類根據(jù)無菌花粉授于離體雌蕊的位置，可將離體授粉分為離體柱頭 授粉、離體子房授粉、離體胚珠授粉三種方式(圖7-1)。進(jìn)行離體 授粉時(shí)，從花粉萌發(fā)到受精形成種子以及種子萌發(fā)和幼苗形成的整個(gè) 過程一般均是在試管內(nèi)完成。圖71離體授

2、粉3種方式示意圖(引自Razdan, 1993)1.2.1 離體柱頭授粉離體柱頭授粉是指通過雌蕊的離體培養(yǎng)，使無菌花粉授于柱頭上，得到含有可育的種子和果實(shí)的技術(shù)( 圖 7 1a) 。離體柱頭授粉的方法通常是在花藥尚未開裂時(shí)切取母本花蕾，消毒后， 在無菌條件下用鑷子剝?nèi)セò旰托廴?，保留萼片，將整個(gè)雌蕊接種于培養(yǎng)基上，當(dāng)天或第二天在其柱頭上授以無菌的父本花粉。離體柱頭授粉是一種接近于自然授粉的試管受精技術(shù)，先后在煙草、金魚草、玉米、小麥等植物上獲得了成功。1.2.2 離體子房授粉通過人工方法將花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔內(nèi)萌發(fā)，并進(jìn)行正常受精，最后獲得具有生活力的種子，這一技術(shù)又稱為子房內(nèi)授

3、粉 (intraovarian pollination) 。把花粉直接送人子房，實(shí)現(xiàn)受精作用是克服受精前障礙的有效途徑。子房內(nèi)授粉可分為兩種類型，即 活體子房內(nèi)授粉和 離體子房內(nèi)授粉。1.2.2.1 活體子房內(nèi)授粉活體子房內(nèi)授粉是指被授粉的子房并不離體，仍然在活體植株上， 對(duì)其用花粉懸浮液進(jìn)行授粉，使活體子房發(fā)育并形成成熟種子的過程。整個(gè)操作步驟包括：確定供試植物的開花和花藥開裂時(shí)間；對(duì)母本花蕾去雄并套袋；采集父本花粉；確定適于父本花粉萌發(fā)的溶液；將花粉引入子房?；ɡ偃バ酆?2d即可將父本花粉引入活體母本的子房中。花粉粒引入子房中的方法有兩種：一是直接引入法，即用鋒利刀片在子房壁或子房頂端上開

4、一切口，把花粉從切口處送進(jìn)子房；二是注射法，即用lOOmJL的硼酸將花粉粒配制成懸浮液，每滴懸浮液含100300 個(gè)花粉粒。母本開花后，將子房用酒精棉進(jìn)行表面消毒。在子房兩側(cè)彼此對(duì)應(yīng)的位置上鉆兩個(gè)小孔，用注射器由一個(gè)小孔向子房內(nèi)注入花粉懸浮液，子房內(nèi)的空氣則由另一個(gè)小孔排出，懸浮液要注滿子房腔，直到開始由另一小孔中流出為止，注射完畢后，將兩個(gè)小孔用凡士林封閉。這種子房內(nèi)授粉方法在虞美人、罌粟、花菱草等植物中已獲得成功。1.2.2.2 離體子房內(nèi)授粉離體子房內(nèi)授粉是指用無菌花粉對(duì)離體培養(yǎng)的子房進(jìn)行授粉，使其發(fā)育成為成熟種子的技術(shù)（ 圖 7-1b） 。取即將開花的花蕾，經(jīng)過表面消毒，剝離花萼和花瓣

5、，去掉柱頭和花柱，在試管中將異種無菌花粉授于子房頂端的切口處，或?qū)惙N無菌花粉引入子房內(nèi)（ 引入方法同活體子房內(nèi)授粉）， 從而實(shí)現(xiàn)受精過程。Inomata（1979） 進(jìn)行兩性不親和物種油菜和甘藍(lán)的種間雜交中，利用離體子房內(nèi)培養(yǎng)方法成功地獲得了雜種。1.2.3 離體胚珠授粉離體胚珠授粉是指離體培養(yǎng)未受精的胚珠，并在胚珠上授粉，最終在試管內(nèi)結(jié)出正常種子的技術(shù)（ 圖 7-1c） 。離體胚珠授粉既可以將胎座上切下的單個(gè)胚珠（裸露胚珠）接種在培養(yǎng)基上，然后撒播花粉于胚珠表面，實(shí)現(xiàn)受精；也可以將帶有完整胎座或部分胎座的胚珠接種在培養(yǎng)基上，并撒播花粉進(jìn)行受精。在實(shí)際應(yīng)用中，活體子房內(nèi)授粉適用于子房較大的植

6、物，因?yàn)檫@種方法能使花粉萌發(fā)后不需經(jīng)過柱頭和花柱組織進(jìn)入子房，克服柱頭和花柱組織上出現(xiàn)的兩性不親和性。但這種方法仍然是在原植物體上進(jìn)行的， 對(duì)子房易脫落的植物不適用。離體柱頭授粉由于從授粉開始到果實(shí)成熟都是在試管內(nèi)進(jìn)行，同時(shí)培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件也可控制， 解決了子房脫落和因胚乳發(fā)育不良使胚敗育等問題。但由于整個(gè)受精過程仍然是通過柱頭進(jìn)行，所以不能克服因柱頭和花柱組織造成的不親和性的障礙。離體子房和胚珠授粉具有較大的優(yōu)越性，因這兩種方法是將花粉直接授于子房或胚珠上，整個(gè)受精過程都是在人工控制的試管里進(jìn)行的，所以它既可排除柱頭和花柱組織對(duì)于受精的障礙，又可克服活體子房的脫落。2 離體授粉的意義有性

7、雜交是常規(guī)育種的一個(gè)主要手段，通過這個(gè)手段，植物育種家不僅能把同一物種不同品種的性狀結(jié)合在一起，而且還能把同一屬不同種的性狀結(jié)合在一起（ 遠(yuǎn)緣雜交 ） ， 從而創(chuàng)造出優(yōu)良的植物新品種或新類型。有性雜交的做法是，在控制的條件下，用選定父本的花粉人工授給母本柱頭。在被子植物中，包含著卵細(xì)胞（ 雌配子 ） 的雌配子體長在子房腔內(nèi)，受到子房壁和珠被的嚴(yán)密保護(hù)。正常情況下，花粉落在柱頭上以后，與柱頭相互作用而萌發(fā)，由萌發(fā)孔長出花粉管，花粉管穿越柱頭和花柱組織進(jìn)入胚珠以后，在卵細(xì)胞附近釋放出2 個(gè)精子， 1 個(gè)與卵細(xì)胞結(jié)合形成合子，另1 個(gè)與 2 個(gè)極核融合形成初生胚乳核。在自然界，一個(gè)柱頭可能接受到各種

8、各樣的花粉，但并非所有落在柱頭上的花粉都能參與受精作用。柱頭和花柱所具有的特殊機(jī)制，保證只有門當(dāng)戶對(duì)的花粉才能正常地發(fā)揮功能（親和性），其他花粉則被拒之門外。因而， 當(dāng)把一個(gè)親本的有生活力的花粉授給另一個(gè)親本的柱頭時(shí)，并不一定就能受精。造成受精障礙的因素包括：花粉在柱頭上不能萌發(fā)；花粉管不能進(jìn)入胚珠，造成這種現(xiàn)象的原因或是由于花柱太長，或是由于花粉管生長速度太慢，還沒長到花柱基部子房已經(jīng)脫落；花粉管在花柱中破裂。以上這些都屬于受精前障礙（合子期前障礙）。在另外一些情況下，即使受精能正常進(jìn)行，但由于胚和胚乳之間的不親合性或胚乳發(fā)育不良，雜種胚不能發(fā)育成熟。這是屬于 受精后障礙。 因受精后障礙而導(dǎo)

9、致遠(yuǎn)緣雜交的失敗，可采用胚培養(yǎng)或子房培養(yǎng)或胚珠培養(yǎng)予以克服。而遠(yuǎn)緣雜交的受精前障礙的克服， 可采用消除柱頭和花柱的障礙，把花粉粒直接送入子房，讓花粉直接與胚珠接觸，從而實(shí)現(xiàn)受精并使種子得到發(fā)育和成熟。這就是離體授粉的意義。為了達(dá)到這個(gè)目的，20 世紀(jì) 60年代初期，在完全人為控制的條件下進(jìn)行了離體授粉（pollination in vitro） 技術(shù)的研究，先后在許多植物上取得了成功。3 離體授粉的方法3.1 試驗(yàn)材料的選擇在進(jìn)行離體授粉實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好選用子房較大并有多個(gè)胚珠的植物，如茄科、罌粟科、石竹科的植物等。在這些植物中，其胎座上著生成百個(gè)胚珠。由于數(shù)量大，在分離過程中會(huì)有許多胚珠完好無損

10、，授粉后容易進(jìn)一步發(fā)育。上述幾科植物的花粉也易于在胚珠上萌發(fā)，花粉管能大量在胚珠和胎座上生長。在單子葉植物中，最先獲得成功的是玉米的離體子房授粉，后來離體胚珠授粉也獲得成功。由于剝除玉米子房壁獲取裸露胚珠時(shí)，易造成胚珠損傷，可用刀片將未授粉玉米果穗上的子房上部1 3切除，使胚珠外露。這種方法操作簡(jiǎn)便，在技術(shù)熟練情況下不易傷害胚珠，而且能在短時(shí)間內(nèi)得到大量正常發(fā)育的玉米胚珠。不論離體柱頭授粉還是胚珠授粉，多保留母體花器官組織有利于離體授粉的成功。如在小麥離體柱頭授粉中，保留穎片有利于子粒發(fā)育； 在水稻試管受精中，可用尚未開花的稻穗作溫湯去雄(45 ， 5min)后， 將父本花藥塞人母本的穎花中，

11、然后將帶有一段枝梗的穎花直插在培養(yǎng)基上，使花穎的基部和培養(yǎng)基接觸。實(shí)驗(yàn)表明，帶枝梗的穎花受精率高。3.2 離體授粉的程序離體授粉的一般程序是：確定開花、花藥開裂、授粉、花粉管進(jìn)入胚珠和受精的時(shí)間；去雄后將花蕾套袋隔離；制備無菌子房或胚珠；制備無菌花粉；胚珠(或子房)的試管內(nèi)授粉。為了避免非實(shí)驗(yàn)要求的授粉，用作母本的花蕾必須在開花之前去雄并套袋。開花之后12d將花蕾取下，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無菌培養(yǎng)。首先將花萼和花瓣去掉，在70酒精中漂洗數(shù)秒后，再用適當(dāng)?shù)臍⒕鷦┻M(jìn)行表面消毒，最后用無菌水沖洗 34次，去掉柱頭和花柱，剝?nèi)プ臃勘冢古咧楸┞冻鰜?。接種時(shí)，可將長著胚珠的整個(gè)胎座進(jìn)行培養(yǎng)，或把胎座切成數(shù)塊，

12、每塊帶有若干個(gè)胚珠，之后再進(jìn)行離體授粉。 在離體柱頭授粉時(shí)，需對(duì)雌蕊進(jìn)行仔細(xì)的表面消毒，但不能使消毒液觸及柱頭，以免影響花粉在柱頭上的萌發(fā)和生長。單子葉植物的每一朵花為一個(gè)子房（胚珠），玉米可用授粉前子房（由于子房有若干層苞葉保護(hù)，不必進(jìn)行表面消毒） ，可將果穗切成小塊，每塊帶有2行共410個(gè)子房，獲得的大量無菌胚珠可用來進(jìn)行離體授粉。為了在無菌條件下采集花粉，需要把尚未開裂的花藥從花蕾中取出，置于無菌培養(yǎng)皿中直到花藥開裂。若從已開放的花中摘取花藥，應(yīng)將花藥進(jìn)行表面消毒，然后將其置于無菌培養(yǎng)皿中直到開裂。將散出的花粉在無菌條件下授于培養(yǎng)的胚珠、胎座、子房、柱頭上或其周圍。如果胚珠表面有水分，則

13、常抑制胚珠上花粉管的生長，因此胚珠接種后，在培養(yǎng)基表面如果出現(xiàn)水層，則應(yīng)用無菌濾紙吸干，然后再進(jìn)行授粉。據(jù)報(bào)道，把花粉授在胚珠或胎座上的效果，比撒在胚珠周圍的培養(yǎng)基上效果好。離體授粉成功的標(biāo)志是授粉后能由胚珠或子房形成有生活力的種子。 一般來講，授粉后胚珠（或子房）可以在適宜其生長的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件也無特殊要求。光照強(qiáng)度一般為1 0001x,光照時(shí)間1012h/d。受精后的胚，有的可發(fā)育成種子，如煙草、矮牽牛、康 乃馨等； 有的是胚原位萌發(fā)，即授粉 5 周后， 子房上可直接長出植株。4 胚珠和子房培養(yǎng)4.1 胚珠培養(yǎng)4.1.1 胚珠培養(yǎng)的概念和意義胚珠培養(yǎng)是將胚珠從母株上分離出來，在人工

14、控制的條件下，進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼苗的技術(shù)。根據(jù)培養(yǎng)目的的不同，可將胚珠培養(yǎng)分為受精胚珠培養(yǎng)和 未受精胚珠培養(yǎng)。胚珠培養(yǎng)的意義為：通過受精前胚珠培養(yǎng)以及未受精的胎座或子房培養(yǎng)，可以作為試管受精的基礎(chǔ)；利用胚珠培養(yǎng)技術(shù)，使雜種盡早 培養(yǎng)，防止雜種胚早期敗育，獲得雜種植株；未受精的胚珠培養(yǎng)能 和花藥培養(yǎng)一樣，誘導(dǎo)出大孢子或卵細(xì)胞增殖，形成單倍體植株，用于單倍體育種。4.1.2 胚珠培養(yǎng)方法( 1)材料的選擇和滅菌培養(yǎng)受精胚珠，可根據(jù)培養(yǎng)的要求，由大田或溫室取回授粉時(shí)間合適的子房；培養(yǎng)未受精胚珠，則應(yīng)在授粉前適當(dāng)時(shí)間摘取子房。用70的酒精表面消毒30s， 5的次氯酸鈉溶液滅菌10min,

15、無菌水沖洗45次，無菌條件下剝離。用解剖刀沿縱軸切開子房，取出一個(gè)個(gè)胚珠，或者將帶有胎座部分的胚珠一起取下接種。(2)培養(yǎng)基 培養(yǎng)基多為 White、Nitsch、M濤，Nitsch使用 更普遍。培養(yǎng)授粉后不久的胚珠，要求附加椰子汁、酵母提取物、水解酪蛋白等，同時(shí)還可添加一些氨基酸，如亮氨酸、組氨酸、精氨酸等。 離體胚珠發(fā)育中，培養(yǎng)基的滲透壓起著重要的作用，特別是對(duì)幼嫩的胚珠。如矮牽牛授粉后 7d,胚珠處于球形胚期，將其剝離置于 蔗糖濃度為4%10%的培養(yǎng)基上，即可發(fā)育為成熟的種子；若胚珠 內(nèi)含有合子和少數(shù)胚乳核，適宜的蔗糖濃度為5%6%,而剛受精后的胚珠應(yīng)為8。不同發(fā)育時(shí)期的胚珠對(duì)培養(yǎng)基的要

16、求也不同。如罌粟授粉后24d 的胚珠，培養(yǎng)時(shí)所要求的培養(yǎng)基較復(fù)雜，在Nitsch 培養(yǎng)基上即使附加酵母提取物、水解酪蛋白、細(xì)胞分裂素、生長素等，也不能促進(jìn)胚珠的發(fā)育。而采用發(fā)育到球形胚期的胚珠，用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基就能成功。（ 3）胎座和子房對(duì)胚珠培養(yǎng)的影響胚珠授粉后的天數(shù)以及是否帶有胎座，對(duì)培養(yǎng)的胚珠發(fā)育有顯著的影響。如粟授粉后第6 天的胚珠，從胎座上切下，置添加維生素的Nitseh 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，它所經(jīng)歷的發(fā)育過程與正常的胚珠大體相同，培養(yǎng)第20 天的胚珠比自然條件下生長的胚珠大，并可形成成熟的種子，繼續(xù)培養(yǎng)就會(huì)發(fā)芽形成幼苗。對(duì)帶有胎座或子房的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，所需培養(yǎng)基較簡(jiǎn)單，而且受精后的胚珠也

17、容易發(fā)育成種子。由此可以推測(cè)，胎座或子房的某些組織在胚珠發(fā)育初期起著重要的作用。所以， 在進(jìn)行單個(gè)胚珠培養(yǎng)不能成功時(shí)，可考慮連胎座或子房一起進(jìn)行培養(yǎng)。（ 4）胚發(fā)育時(shí)期的影響胚發(fā)育時(shí)期對(duì)胚珠培養(yǎng)成功與否有很大影響。 一般來說，合子和早期原胚期的胚珠較難剖取和培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)基成分也要求嚴(yán)格。培養(yǎng)發(fā)育到球形胚期的胚珠，較容易獲得種子，對(duì)培養(yǎng)基的要求也不高。許多植物在含無機(jī)鹽、蔗糖和維生素的培養(yǎng)基上即能獲得成功，附加水解酪蛋白和椰子汁等，可促進(jìn)其生長發(fā)育。4.2 子房培養(yǎng)4.2.1 子房培養(yǎng)的概念和意義子房培養(yǎng)是指將子房從母體上分離下來，置于培養(yǎng)基上，使其進(jìn)一步發(fā)育成幼苗的技術(shù)。子房是雌蕊基部膨大的部

18、分，由子房壁、胎座、胚珠組成。在進(jìn)行胚珠培養(yǎng)時(shí)，常因?yàn)榉蛛x胚珠困難而改用子房培養(yǎng)， 其培養(yǎng)的 意義 在于： 使未受精胚囊中的單倍性細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)育成單倍體植株；獲得雜種植株；為試管受精提供一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù)。根據(jù)培養(yǎng)的子房是否授粉，可將子房培養(yǎng)分為授粉子房培養(yǎng)和 未授粉子房培養(yǎng) 。4.2.2 子房培養(yǎng)的方法（ 1）子房外植體的制備子房培養(yǎng)的方法與胚珠培養(yǎng)相似。若培養(yǎng)未受精的子房，一般選用開花前15d大田種植植株的子房；若培養(yǎng)受精后的子房，則應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的，選擇不同授粉后天數(shù)的子房作為試材。子房培養(yǎng)與相同胚齡胚培養(yǎng)比較，難度大大降低。單子葉植物的幼齡子房包裹在穎殼里，而穎花又嚴(yán)密包裹在葉鞘里，子房無菌，因

19、此只要在幼穗表面用70的酒精擦拭，即可在無菌條件下剝?nèi)∽臃恐苯咏臃N；雙子葉植物的花蕾可以用飽和漂白粉溶液滅菌15min,無菌水沖洗后備用。對(duì)其他子房裸露的植物則應(yīng)按照常規(guī)表面消毒程序，嚴(yán)格進(jìn)行消毒。之后在無菌條件下，除去花萼、花冠或穎殼，將子房接種于合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。（ 2） 培養(yǎng)基用于子房培養(yǎng)的培養(yǎng)基 有 MS、 White、 B5、 N6、 Nitseh等。此外，培養(yǎng)基的成分對(duì)子房的生長發(fā)育及成熟有很大的影響。如在一種含有無機(jī)鹽和蔗糖的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基上，培養(yǎng)屈曲花授粉后1d 的離體子房，子房生長良好，但形成的胚比自然條件下的小。但在培養(yǎng)基中添加B族維生素后，可獲得正常大小的果實(shí)。若在無機(jī)

20、鹽、蔗糖、 維生素的培養(yǎng)基中再附加IAA,在離體條件下形成的果實(shí)比自然條件 下形成的果實(shí)更大。（ 3）培養(yǎng)子房的發(fā)育由于在子房中存在兩種細(xì)胞，即性細(xì)胞和體細(xì)胞，它們都可產(chǎn)生胚狀體或愈傷組織，進(jìn)一步發(fā)育成植株。因此，這些植株可以來源于性細(xì)胞，也可能來源于體細(xì)胞。來源于性細(xì)胞的植株是單倍體植株；而來源于體細(xì)胞，即由珠被和子房壁表皮二倍體組織產(chǎn)生的植株，則屬二倍體。正是由于胚狀體或愈傷組織有兩種不同倍性的起源，其后代會(huì)出現(xiàn)不同倍性的植株，若想通過子房培養(yǎng)從大孢子產(chǎn)生單倍體植株，必須設(shè)法控制不同倍性組織中的細(xì)胞分裂， 為大孢子的細(xì)胞分裂創(chuàng)造良好條件。若培養(yǎng)子房中卵細(xì)胞已受精的合子，則可通過胚狀體或愈傷

21、組織再分化途徑，產(chǎn)生二倍體植株，以獲得雜種植株。（ 4）影響子房培養(yǎng)的因素由于子房培養(yǎng)的目的不同，要求子房的發(fā)育途徑也不一樣，可以通過控制培養(yǎng)基及激素條件調(diào)節(jié)子房發(fā)育的方向。受精后的子房通過離體培養(yǎng)，可形成果實(shí)，并得到成熟的種子。這種培養(yǎng)方式所要求的培養(yǎng)基也較簡(jiǎn)單，常用的培養(yǎng)基有N6、MS、 BN 等。然而，要想誘導(dǎo)子房中的性細(xì)胞和體細(xì)胞形成胚狀體或愈傷組織，并分化成植株，則對(duì)培養(yǎng)基的成分有一定的要求。如誘導(dǎo)未受精子房胚囊核單倍體組織發(fā)生，就需要在培養(yǎng)基中加人一定量的外源激素。水稻不加外源激素，子房不膨大，也不產(chǎn)生愈傷組織；當(dāng)加入微量的生長素，可明顯促進(jìn)子房的膨大，并產(chǎn)生愈傷組織。大麥子房培養(yǎng)

22、中，加入 2, 4D 0.5mg/L+NAAl.0mg/L+KTl.Omg/L,可誘導(dǎo)其產(chǎn)生胚狀體，并進(jìn)一步形成單倍體植株。有些禾本科植物，在有IAA的培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)胚產(chǎn)生根，在含有IAA和腺喋吟的培養(yǎng)基上可產(chǎn)生幼苗。此外， 離體培養(yǎng)的研究表明，花被的功能不是僅僅充做性器官的保護(hù)結(jié)構(gòu)，在果實(shí)和胚胎的發(fā)育中它也起著重要的作用。如在培養(yǎng)普通小麥和斯卑爾脫小麥?zhǔn)诜酆蟛痪玫淖臃繒r(shí)，只有小花的花被( 內(nèi)外稃 ) 完整無缺，胚才能正常發(fā)育。若把花被去掉，原胚的生長就要受到損害。 在大麥中La Croix 等 (1962) 也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，并由此斷定“花被因子”是胚的正常發(fā)育所必需的。在雙子葉植物中，

23、去掉花萼也會(huì)導(dǎo)致果實(shí)發(fā)育不良。因此， 當(dāng)在離體條件下進(jìn)行柱頭授粉的時(shí)候，保留花冠是十分重要的。5 離體授粉中影響結(jié)實(shí)的因子5.1 外植體5.1.1 柱頭和花柱的影響柱頭是 某些 植物受精前的障礙，要克服這種障礙，必須去掉柱頭和花柱。但葉樹茂(1978) 在煙草實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，保留柱頭和花柱，試管受精良好，平均有80的子房能結(jié)種子。去掉部分柱頭，對(duì)產(chǎn)生種子影響不大。但全部去掉柱頭和花柱，子房結(jié)實(shí)率則較低。5.1.2 胎座的影響在試管受精中，子房或胚珠上帶有胎座，有利于離體受精的成功。至今試管受精成功的大部分例子，都是用帶胎座的子房或胚珠材料。同時(shí)多胚珠子房的離體受精也易成功。在玉米中，連在穗軸組織上

24、的子房比單個(gè)子房離體授粉效果好。減少每個(gè)外植體上的子房數(shù)目雖然 并不影響受精，但對(duì)籽粒的發(fā)育會(huì)產(chǎn)生有害的影響。5.1.3 外植體的生理狀態(tài)由雌蕊上剝離胚珠的時(shí)間對(duì)于離體授粉后的結(jié)實(shí)率有明顯影響。如開花后12d剝離的胚珠比開花當(dāng)天剝離的胚珠結(jié)實(shí)率高。 玉米果穗進(jìn)行離體授粉的適宜時(shí)期是抽絲后 34d。在剝離胚珠或雌蕊時(shí)，雌蕊的生理狀態(tài)對(duì)離體授粉后的結(jié)實(shí)率也有影響。 如煙草授粉后剝離的未受精胚珠比未授粉雌蕊上剝離的胚珠離體授粉的結(jié)實(shí)率高。這是因?yàn)榛ǚ墼谥^上萌發(fā)或花粉管穿越花柱會(huì)影響子房內(nèi)代謝活動(dòng)，刺激子房中蛋白質(zhì)的合成。因此，在離體授粉中， 可以把剝離胚珠的時(shí)間選擇在雌蕊授粉后和花粉管進(jìn)入子房之前

25、 ，從而增加離體授粉成功的機(jī)會(huì)。在進(jìn)行柱頭授粉的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)避免弄濕胚珠和柱頭的表面，否則將會(huì)影響花粉萌發(fā)，導(dǎo)致花粉管破裂，造成結(jié)實(shí)不良。5.2 培養(yǎng)基離體授粉方法涉及到兩個(gè)主要過程：花粉粒的萌發(fā)和花粉管的生長，結(jié)果導(dǎo)致受精；受精的胚珠發(fā)育為成熟的種子，里面有一個(gè)有生活力的胚。這項(xiàng)技術(shù)的效率在很大程度上取決于能夠促成這兩個(gè)過程的培養(yǎng)基的成分。要想實(shí)現(xiàn)花粉萌發(fā)和花粉管生長并不困難。在胎座授粉中，當(dāng)花粉粒撒落在胚珠上以后，若能在胚珠表面萌發(fā)，花粉管隨即長入胚珠，與培養(yǎng)基并無接觸。若花粉粒不能在胚珠表面萌發(fā)，就需要在一種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上單獨(dú)培養(yǎng)花粉粒，然后把花粉管置于胚珠表面。培養(yǎng)基最重要的作用在于促進(jìn)

26、受精胚珠的正常發(fā)育。因此， 在進(jìn)行離體授粉試驗(yàn)之前，先要對(duì)準(zhǔn)備用做母本的植物的幼齡胚珠( 含有合子或幾個(gè)細(xì)胞的原胚) 在培養(yǎng)中所需的最適營養(yǎng)成分和激素組成有所了解。常用于離體授粉的培養(yǎng)基為Nitsch、White、MS等。研究發(fā)現(xiàn)Ca2 具有刺激花粉萌發(fā)和花粉管生長的作用(如十字花科植物的三細(xì)胞成熟花粉不易在離體條件下萌發(fā)，因而對(duì)這種植物難于進(jìn)行離體授粉，如先將離體胚珠在1氯化鈣溶液中蘸一下，然后立即用花粉進(jìn)行授粉，再把授粉的胚珠轉(zhuǎn)到Nitsch 培養(yǎng)基上。通過這種方法，獲得了具有萌發(fā)力的種子。如不用氯化鈣處理，則不能形成種子)。培養(yǎng)基中蔗糖的濃度一般為4%5%,而玉米適合的蔗糖濃度為 7。關(guān)

27、于各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他補(bǔ)加物對(duì)胚珠培養(yǎng)中種子發(fā)育的效果，資料十分貧乏。常用的有機(jī)附加物是水解酪蛋白、椰子汁、酵母提取液等。煙草胎座授粉后加入這些附加物和少量的細(xì)胞分裂素、生長素，能顯著提高子房的結(jié)實(shí)數(shù)。5.3 培養(yǎng)條件在離體授粉中，培養(yǎng)物一般都是在黑暗或光照較弱的條件下培養(yǎng)的。 Zenkteler(1969 ， 1980)發(fā)現(xiàn)，無論培養(yǎng)物是在光照下培養(yǎng)還是在黑暗中培養(yǎng)，離體授粉的結(jié)果沒有任何差別。Balatkova 等 (1977)指出， 在某些實(shí)驗(yàn)中溫度可以影響結(jié)實(shí)率。離體授粉培養(yǎng)的溫度一般為2025C,但水仙屬(Narcissus)植物中，15c比25c更能顯著增加子房的結(jié)實(shí)數(shù)。而罌粟由

28、于是在較溫暖的條件下開花的植物，低溫培養(yǎng)并不能提高結(jié)實(shí)率。5.4 基因型離體子房培養(yǎng)與結(jié)實(shí)之間的效應(yīng)取決于植物的種類。如十字花科的植物花粉粒在培養(yǎng)條件下萌發(fā)困難，需改進(jìn)試管受精技術(shù)，以期獲得可萌芽的種子；有證據(jù)表明，離體授粉的玉米子房對(duì)培養(yǎng)的反應(yīng)存在著基因型差異。6 離體授粉的應(yīng)用當(dāng)在離體情況下進(jìn)行胚珠或胎座授粉時(shí)，必須把柱頭、花柱和子房壁組織幾乎完全去掉，以排除花粉管進(jìn)入胚珠的障礙，因而當(dāng)自交不親合區(qū)域是處在柱頭、花柱或子房中時(shí)，這項(xiàng)技術(shù)在自交或雜交實(shí)驗(yàn)中將會(huì)是非常有用的?，F(xiàn)在已經(jīng)證明，胎座授粉方法至少可用于以下幾個(gè)不同的領(lǐng)域：6.1 克服自交不親合性如腋花矮牽牛是一個(gè)自交不親合物種，在自花

29、授粉的雌蕊中，花粉萌發(fā)的情況雖然很好，但在子房區(qū)域存在障礙，花粉管不能進(jìn)入胚珠受精。在這類植物中，當(dāng)以自身花粉進(jìn)行胎座授粉以后，受精和結(jié)實(shí)都能正常進(jìn)行。6.2 克服雜交不親合性離體胎座授粉方法最重要的應(yīng)用潛力，是在那些由于受精前不親合性障礙從未形成過雜種的植物間建立雜種。通過遠(yuǎn)緣雜交可以得到一個(gè)雜種合子或幼齡原胚，其中結(jié)合了兩個(gè)各具不同優(yōu)良特性的親本染色體組。然后，再對(duì)雜種胚進(jìn)行精心培養(yǎng)，使之成熟，或誘導(dǎo)雜種原胚愈傷組織分化器官，這在育種上是很有價(jià)值的。6.3 通過孤雌生殖產(chǎn)生單倍體能通過未受精子房培養(yǎng)產(chǎn)生孤雌生殖單倍體的植物已知有大麥、煙草和小麥等。6.4 培育抗逆性植物如高溫下離體授粉，可以培育耐熱的玉米植株。Petoline 等（ 1990）觀察到，高溫（38）下只有耐熱的花粉能有效受精，產(chǎn)生表達(dá)耐熱形狀的玉米植株。這一研究表明，離體授粉對(duì)培育抗環(huán)境脅迫植物也有應(yīng)用潛力。7 單個(gè)雌雄配子的體外受精20 世紀(jì) 90 年代，植物生物技術(shù)領(lǐng)域中一項(xiàng)里程碑式的進(jìn)展