實(shí)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)

1、1實(shí)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基本概念細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個(gè)細(xì)胞，也可以是細(xì)胞群。細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途1、科學(xué)研究：藥物研究開發(fā)與基礎(chǔ)研究藥物研究與開發(fā)(1) 新藥篩選：如化學(xué)合成藥物藥效研究、中藥有效成分篩選與鑒定等。(2) 疫苗研究與開發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開發(fā)（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。(3) 基因工程藥物研究與開發(fā)：如干擾素研究與開發(fā)，細(xì)胞生長因子研究與開發(fā)等。(4) 細(xì)胞工程藥物研究與開發(fā)：生物活性多肽研究與開發(fā)，人參皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究與

2、開發(fā)。(5) 單克隆抗體制備：包括診斷用單克隆抗體，治療用單克隆抗體?；A(chǔ)研究(1) 藥物作用機(jī)理(2) 基因功能(3) 疾病發(fā)生機(jī)理2、生物制藥(1) 疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。(2) 基因工程藥物生產(chǎn)：如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價(jià)值的一些細(xì)胞生長因子如干擾素、粒細(xì)胞生長因子、胸腺肽等(3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)(4) 細(xì)胞工程藥物生產(chǎn)：生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽，生物活性物質(zhì)等細(xì)胞培養(yǎng)基本條件1、合適的細(xì)胞培養(yǎng)基合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞

3、生長和繁殖的生存環(huán)境。2、優(yōu)質(zhì)血清目前，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細(xì)胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分。23、無菌無毒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞由于缺乏對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，必須保持細(xì)胞生存環(huán)境無菌無毒，及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物。4、恒定的細(xì)胞生長溫度維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。5、合適的氣體環(huán)境氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。細(xì)胞

4、培養(yǎng)基種類與基本成分細(xì)胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基），按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基需由實(shí)驗(yàn)者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直接使用，非常方便。每種細(xì)胞都有其合適的培養(yǎng)基，詳見附表1。1、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無機(jī)鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)氨基酸氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長不良而死亡

5、。因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲(chǔ)存2 周以上時(shí)，還應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。碳水化合物碳水化合物是細(xì)胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。無機(jī)鹽培養(yǎng)液中無機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡。此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素, 細(xì)胞通?？赡褪?60mOsm/kg .320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng)。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它

6、物質(zhì)有可能會(huì)明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加HEPES 時(shí)需按以下方法調(diào)節(jié)鈉離子濃度。緩沖系統(tǒng)大多數(shù)細(xì)胞所需pH 在7.2 - 7.4。但是，細(xì)胞培養(yǎng)最適pH 值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類不同而不同。成纖維細(xì)胞喜歡較高pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與CO2 體系進(jìn)行緩沖，因此，氣相中的CO2 濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2 濃度設(shè)定在5，培養(yǎng)3液中NaHCO3 的加入量為1.97g/L；如果CO2 濃度維持在10，培養(yǎng)液中NaHCO3 的

7、加入量為3.95g/L。細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋不應(yīng)擰得太緊，以保證氣體交換。HEPES 是一種非離子緩沖液，在pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時(shí)對(duì)一些細(xì)胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH 指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。維生素在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長。其它成分在一些較為復(fù)雜的培養(yǎng)液

8、中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM 培養(yǎng)液，使用時(shí)還需要補(bǔ)加丙酮酸鈉和2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 對(duì)細(xì)胞生長有很重要的作用。有人認(rèn)為它相當(dāng)于胎牛血清，有直接刺激細(xì)胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基，其中一個(gè)重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時(shí)避免過氧化物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的損害。另一個(gè)重要作用是促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，已廣泛應(yīng)用于雜交瘤技術(shù)，另外，也開始用于一些難以培養(yǎng)的細(xì)胞。2-Me 是一種小分子還原劑，極易氧化。分子量為78.

9、13，純的2-Me 是一種無色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為5×10-5M。常配制成0.1M 的儲(chǔ)存液，用時(shí)每升培養(yǎng)液加0.5ml。液體培養(yǎng)基保存：液體培養(yǎng)基應(yīng)于4冰箱避光保存，實(shí)驗(yàn)前放入37預(yù)熱。未加血清液體培養(yǎng)基有效期為12 個(gè)月。液體培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長而慢慢分解。如果細(xì)胞生長不良，可以再添加適量L-谷氨酰胺。干粉培養(yǎng)基保存：4冰箱避光保存，有效期36 個(gè)月。血清細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價(jià)格昂

10、貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點(diǎn)，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細(xì)胞的生長，而不同批次的血清支持細(xì)胞生長的能力也不同，尤其是對(duì)克隆細(xì)胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細(xì)胞生長的物質(zhì)。因此，在購買大量血清之前，必須對(duì)血清支持細(xì)胞生長能力進(jìn)行檢測，然后4再，然后大量購買質(zhì)量好的同一批號(hào)的血清，并注意以下幾點(diǎn)：（1）需要長期保存的血清必須儲(chǔ)存于-20 70 低溫冰箱中。4冰箱中保存時(shí)間切勿超過1 個(gè)月。

11、由于血清結(jié)冰時(shí)體積會(huì)增加約10，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。（2）一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾，切勿直接過濾血清。（3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 至-70 低溫冰箱中的血清放入4冰箱中溶解1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20進(jìn)入37解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。（4）熱滅活是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過程中須規(guī)則搖

12、晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補(bǔ)體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉淀物顯著增多，而且還會(huì)影響血清的質(zhì)量。補(bǔ)體參與反應(yīng)有：細(xì)胞毒作用, 平滑肌細(xì)胞收縮, 肥大細(xì)胞和血小板釋放組胺, 增強(qiáng)吞噬作用, 促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化。（5）切勿將血清在37放置太久，否則血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中的有效成分會(huì)破會(huì)而影響血清質(zhì)量。（6）血清中的沉淀物絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量。可用離心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過熱處理過的血清，

13、沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號(hào)的血清。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。2、常用設(shè)施及設(shè)備（1）超凈工作臺(tái)：也稱凈化工作臺(tái)，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。（2）無菌操作間：

14、一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺(tái)及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。5（3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、定時(shí)鐘、普通天平及日常分析處理物（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。（5）分析間：顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。3、培養(yǎng)器皿常用細(xì)胞培養(yǎng)器皿有培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿等。常準(zhǔn)備量是使用量的三倍。器皿應(yīng)選擇透明度好、無毒、利于細(xì)胞粘附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面幾種。（1）液體儲(chǔ)存瓶：用于儲(chǔ)存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常用規(guī)格有500ml、2

15、50ml、100ml 等幾種。（2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位，規(guī)格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等幾種。（3）培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm 等幾種。（4）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動(dòng)液體。常用1ml 和10ml 兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。（5）離心管：離心管是細(xì)胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿，

16、根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用于細(xì)胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者則多為10ml 和5ml。（6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。4、細(xì)胞培養(yǎng)溫度維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定而適宜的溫度。不同種類的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)溫度要求也不同。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5±0.5，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較對(duì)高溫強(qiáng)，溫度上升不超過39時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比；人體細(xì)胞在39-401 小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-411 小時(shí)，細(xì)胞會(huì)普遍受到損傷，僅小半

17、數(shù)有可能恢復(fù)；41-421 小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43以上1 小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。相反，溫度不低于0時(shí)，對(duì)細(xì)胞代謝雖有影響，但并無傷害作用；把細(xì)胞放入2535時(shí)，細(xì)胞仍能生存和生長，但速度減慢；放在4數(shù)小時(shí)后，再回到37培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長。細(xì)胞代謝隨溫度降低而減慢。當(dāng)溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞可因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。但是，如果向培養(yǎng)液中加入一定量的冷凍保護(hù)劑（二甲亞砜或甘油），可在深低溫下如80或196（液氮）長期保存。5、合適的氣體環(huán)境氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長增

18、殖的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。二氧化碳既是細(xì)6胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH 值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH 為7.2-7.4，偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長。但有一些細(xì)胞也喜歡偏堿環(huán)境中生長，如成纖維細(xì)胞最適合pH 是7.4-7.6。每種細(xì)胞都有其最適pH 值。細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作基本技術(shù)無菌操作技術(shù)分為三個(gè)部分：工作環(huán)境及表面的處理，細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理及培養(yǎng)液與培養(yǎng)細(xì)胞的處理。工作環(huán)境的處理使用層流

19、超凈工作臺(tái)是最經(jīng)濟(jì)有效的手段。超凈工作臺(tái)正常工作時(shí)，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進(jìn)入超凈臺(tái)。（1）實(shí)驗(yàn)前，無菌室及無菌操作臺(tái)用紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，用70% 酒精擦拭無菌操作臺(tái)面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才可開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)。如需要繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)，則用70% 酒精擦拭無菌操作臺(tái)面，再讓無菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才可進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)操作。（2）無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完后應(yīng)及時(shí)移出，以利氣體流通。實(shí)驗(yàn)用品要用70%

20、酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中央無菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。（3）小心取出無菌實(shí)驗(yàn)用品，避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要在打開的容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺(tái)面上。（4）工作人員應(yīng)注意自身的安全，必須穿戴實(shí)驗(yàn)衣與手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)的無菌操作臺(tái)（至少兩級(jí)）。操作過程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳物品傷人等。（5）定期檢查下列項(xiàng)目：CO2 鋼瓶內(nèi)的CO2

21、壓力；CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)的CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染；無菌操作臺(tái)內(nèi)氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及HEPA 過濾器濾膜，預(yù)濾網(wǎng)300 小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA）。培養(yǎng)細(xì)胞生長過程：潛伏期指數(shù)增生期停滯期潛伏期(latent phase)細(xì)胞接種后,先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時(shí),細(xì)胞質(zhì)回縮, 胞體呈圓球形.然后細(xì)胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結(jié)束. 細(xì)胞貼壁速度與細(xì)胞種類, 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下，原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁速度慢,可達(dá)10-24 小7時(shí)或更多, 而傳代細(xì)胞系貼壁速度快, 通常10-30 分鐘即可貼壁。細(xì)胞貼壁后還需經(jīng)過

22、一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期.原代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約24-96 小時(shí)或更長, 連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅需6-24 小時(shí)。(2) 指數(shù)增生期(logarithmic growth phase)這是細(xì)胞增殖最旺盛的階段，分裂相細(xì)胞增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長是否旺盛的一個(gè)重要標(biāo)志。通常以細(xì)胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI）表示，即細(xì)胞群中每1000 個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%-0.5%，原代細(xì)胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂相指數(shù)可高達(dá)35。指數(shù)增生期的細(xì)胞活力最好時(shí)期，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最佳時(shí)期，也是凍存細(xì)胞的最好時(shí)機(jī)

23、。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)35 天后，隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間減少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。正常細(xì)胞相互接觸后能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（piled up）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)仍然在增多。但是，當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。

24、（3）停滯期(Stagnate phase)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，如不及時(shí)進(jìn)行傳代，細(xì)胞就會(huì)停止增殖，進(jìn)入停止期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)持平，故也稱平臺(tái)期（Plateau phase）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)。如不進(jìn)行分離傳代，細(xì)胞會(huì)因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH 下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細(xì)胞會(huì)脫落，嚴(yán)重的會(huì)發(fā)生死亡，因此，應(yīng)及時(shí)傳代。培養(yǎng)細(xì)胞基本形態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，最常見的是貼附于平面支持物細(xì)胞。在一般光鏡下生存中的細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。細(xì)胞在生長期常有1-2 個(gè)核仁。在細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞輪廓會(huì)增強(qiáng)，反差增大。若胞質(zhì)中時(shí)而出現(xiàn)顆粒、

25、脫滴和腔泡等，表明細(xì)胞代謝不良。體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們?cè)谂囵B(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類。貼附型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)能貼附在支持物表面生長。如羊水細(xì)胞為貼附型細(xì)胞，常表現(xiàn)為成纖維型細(xì)胞和上皮細(xì)胞生長。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長。（1）成纖維型細(xì)胞在培養(yǎng)中的細(xì)胞凡形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似時(shí)，皆可稱之為成纖維細(xì)胞。本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細(xì)胞中央有卵園形核，胞質(zhì)向外伸出2-3 厘米個(gè)長短不同的突起，除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細(xì)胞常呈本類形態(tài)生長。（2）上皮型細(xì)胞此類型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿支持物

26、上生長具有扁平不規(guī)則多角形特征，細(xì)胞中央有園形8核，細(xì)胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，皆呈上皮型形態(tài)生長。（3）游走型細(xì)胞本型細(xì)胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時(shí)亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細(xì)膩包形態(tài)。常見于羊水細(xì)胞培養(yǎng)的早期。細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的清洗與消毒清洗在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細(xì)胞殘留物及非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)，均能影響培養(yǎng)

27、細(xì)胞的生長。因此對(duì)新使用玻璃器皿和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴(yán)格徹底的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法。玻璃器皿的清洗組織細(xì)胞培養(yǎng)中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個(gè)步驟。清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。（1）浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)等。新瓶使用前應(yīng)先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿

28、性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會(huì)損害器皿表面光澤度。（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對(duì)玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。清潔液去污能力很強(qiáng)。是清洗過程中關(guān)鍵的一環(huán)。浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時(shí)間一般為過夜，不應(yīng)少于6 小時(shí)。清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強(qiáng)度，常用的下列三種：

29、重鉻酸鉀（g） 濃硫酸（ml） 蒸餾水（ml） （A）強(qiáng)清潔液631000200000 （B）次強(qiáng)清洗液1202001000 （C）弱清潔液100100100。清潔液配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染9或潔液的殘跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。如

30、用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5 次，晾干備用。膠塞的清洗細(xì)胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30 分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20 分鐘，晾干備用。塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時(shí)用2% NaOH 浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30 分鐘，最后用自來水

31、和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。消毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底。由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線、濕熱、干烤、過濾等），化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消毒劑）和抗生素。（1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時(shí)間照射后，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌，培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過2.5 米，且消毒進(jìn)物

32、品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對(duì)人皮膚也有傷害，不宜近照射。（2）溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀?，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫?zé)嵯緯r(shí)，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險(xiǎn)，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，同時(shí)檢驗(yàn)安全閥活動(dòng)自如，繼后開始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時(shí)，開始記算消毒時(shí)間。消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時(shí)檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發(fā)生。常用物品消毒壓力及時(shí)間：培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：1

33、21, 15 磅, 20 分鐘；布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先121, 15 磅, 20 分鐘，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干熱滅菌170, 4 小時(shí)。（3）化學(xué)消毒法：最常見的是70%酒精及1的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒?；瘜W(xué)消毒法操作簡單、方便有效。（4）抗生素消毒：主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。10細(xì)胞培養(yǎng)常用物品細(xì)胞培養(yǎng)基目前，市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜。缺點(diǎn)是配制過程繁瑣，質(zhì)量不易控制。液體培養(yǎng)基是由專業(yè)產(chǎn)家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn)

34、，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便。常用的培養(yǎng)基種類及其應(yīng)用見下表：培養(yǎng)基種類應(yīng)用細(xì)胞RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型） 主要用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）IMDMMcCoys 5AM199F10血清平衡鹽液體PBS（Phosphate-Buffered Sallines）DPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）標(biāo)準(zhǔn)型成分含量（g/L）CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣) 0.10KCl 0.20KH2PO4 0.20MgCl2·6H2O 0.10NaCl 8.00Na2HPO4·7H2O 2.

35、16Hanks 平衡鹽溶液（Hanks Balanced Salt Solutions，HBSS）成分含量（g/L）CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣) 0.14KCl 0.40KH2PO4 0.06MgCl2·6H2O 0.1011MgSO4·7H2O 0.10NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01D-Hanks 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)成分含量（g/L）KCl 0.40KH2PO4 0.06NaCl 8.00NaCO

36、3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01消化液：分離組織和分散細(xì)胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液?？梢詥为?dú)使用，也可以混合使用。（1）胰蛋白酶溶液胰蛋白酶（簡稱胰酶）是一種黃白色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗干燥處保存。目前應(yīng)用的胰蛋白酶主要來自?；蜇i的胰腺。胰酶的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散。胰酶對(duì)細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的種類和細(xì)胞的特性有密切關(guān)系。一般來講，胰酶濃度大、作用溫度高、作用時(shí)間長，對(duì)細(xì)胞分離能力也大，但超過一定的限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰酶溶液在pH8.0，溫度為37時(shí)，作用能力最強(qiáng)。注意：鈣離

37、子、鎂離子和血清蛋白的存在會(huì)降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks 平衡鹽溶液配制成0.25%溶液。消化細(xì)胞時(shí)，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，或胰蛋白酶抑制劑能終止胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的消化作用。胰蛋白酶溶液配制：（1）稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許D-Hanks 平衡鹽溶液（pH7.2 左右）調(diào)成糊狀，然后再補(bǔ)足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時(shí)或冰箱過夜，并不斷攪拌振蕩；（2）次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存?zhèn)溆?，常用濃度?.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調(diào)用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右。

38、保存條件：配制好的胰蛋白酶溶液必須保存在-20冰箱中，以免分解失效。EDTA·4Na 溶液EDTA 是一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離觧作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便。常用工作液濃度為0.02%。通常與0.25%的胰蛋白酶溶液按1：1 混合使用（混合液）。注意：使用EDTA 處理細(xì)胞后，一定要用Hanks 液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會(huì)影響細(xì)胞生長。EDTA 溶液配制：用無鈣、鎂的D-HBSS 平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，室溫或4冰箱保存。12胰蛋白酶EDTA·4Na 溶液（0.05%胰蛋白酶, 0.53mM EDTA·4Na）0.5g 胰

39、蛋白酶0.2gEDTA·4Na1L D-HBSS。-20冰箱中保存。pH 調(diào)整液（1）NaHCO3 溶液常用濃度為7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，過濾除菌，分裝，4冰箱或室溫保存。當(dāng)pH 值超過后，可用高壓滅菌的10醋酸溶液或通入CO2 氣體方法調(diào)節(jié)。（2）HEPES（分子量238.31）溶液HEPES 使用終濃度一般為10-50mM, 但通常配成1M 儲(chǔ)存液：用200ml 雙蒸水溶解47.6克HEPES，用1N NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.5-8.0;然后過濾除菌，分裝小瓶，室溫或4保存。抗生素溶液酚紅：大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH 指示劑。紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色

40、表示堿性pH。但是，在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅，因?yàn)橐延幸恍┭芯勘砻鳎悍蛹t能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用。丙酮酸鈉：是細(xì)胞液中細(xì)胞的另一種碳源。D-葡萄糖是細(xì)胞優(yōu)選碳源，但是當(dāng)培養(yǎng)液中D-葡萄糖耗盡時(shí)，細(xì)胞可以代謝丙酮酸鈉獲取碳源。抗生素哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存主要目的：（1）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。這是保存細(xì)胞的最主要目的。（2）減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。（3）減少細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性。（4）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。（5）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。(6) 降低人力和物力。冷凍保存要點(diǎn)：（1）冷凍過程要緩慢。需要冷凍保存的細(xì)胞先在4冰箱中放置3060 分鐘；然后轉(zhuǎn)入-20，放置30 分鐘；然后再轉(zhuǎn)