限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基

1、寡核苷酸近末端位點(diǎn)的酶切(Cleavage Close to the Endof DNA Fragme nts (olig onu cleotides)為了解不同內(nèi)切酶對(duì)識(shí)別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，NEB 采用了一系列含識(shí)別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于確定雙酶切 順序?qū)?huì)有幫助（比如在多接頭上切割位點(diǎn)很接近時(shí)），或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近 DNA末端時(shí)也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識(shí)別位點(diǎn)兩端至少加 上6個(gè)保護(hù)堿基，以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法：用丫 - 32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記 0.1A26。單位的寡 核苷酸。取1 yg已標(biāo)記了的寡

2、核苷酸與20單位的內(nèi)切酶，在20°C條件下分別 反應(yīng)2小時(shí)和20小時(shí)。反應(yīng)緩沖液含 70 mM Tris-HCl （pH 7.6）, 10 mM MgCl 2 , 5 mMDTT及適量的NaCI或KCl （視酶的具體要求而定）。20%勺PAGE（ 7 M尿素） 凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實(shí)驗(yàn)采用自連接的寡核苷酸作為對(duì)照。 若底物有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則 可能因?yàn)槌霈F(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。11酶寡核苷酸序列鏈長(zhǎng)切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGAC C800CG GTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIICACATGT G8

3、00CCACATGT GG10>90>90CCC ACATGT GGG12>90>90Asc IGGCGCGCC8>90>90AGGCGCGCC T10>90>90TTGGCGCGCC AA12>90>90Ava ICCCCGGG G850>90CCCCCGGG GG10>90>90TCC CCCGGG GGA12>90>90fBamH ICGGATCC G81025CG GGATCC CG10>90>90CGC GGATCC GCG12>90>90廠Bgl IICAGATCT G

4、800GAAGATCT TC1075>90GGA AGATCT TCC1225>90BssH IIGGCGCGC C800AG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA1250>90BstE IIGGGT(A/T)ACC C9010'BstX IAACTGCAGAA CCAATGCATTGG2200AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA242550CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT2725>90'Cla ICATCGAT G800GATCGAT C800CCATCGAT GG10>90>90C

5、CC ATCGAT GGG125050EcoR IG GAATTC C8>90>90CG GAATTC CG10>90>90CCG GAATTC CGG12>90>90LHae IIIGG GGCC CC8>90>90AGC GGCC GCT10>90>90TTGC GGCC GCAA12>90>90Hind IIICAAGCTT G800CCAAGCTT GG1000CCC AAGCTT GGG121075rKpn IGGGTACC C800GG GGTACC CC10>90>90CGG GGTACC CCG

6、12>90>90Mlu IGACGCGT C800CG ACGCGT CG102550rNco ICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075Nde ICCATATG G800CC CATATG GG1000CGC CATATG GCG1200GGGTTT CATATG AAACCC1800GGAATTC CATATG GAATTCC2075>90GGGAATTC CATATG GAATTCCC2275>90Nhe IGGCTAGC C800CG GCTAGC CG101025CTA GCTAGC TAG121050Not ITTGCGGCCGC

7、 AA1200ATTT GCGGCCGC TTTA161010AAATAT GCGGCCGC TATAAA201010ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT242590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA2825>90Nsi ITGC ATGCAT GCA1210>90CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT22>90>90Pac ITTAATTAA800GTTAATTAA C10025CC TTAATTAA GG120>90fPme IGTTTAAAC800GGTTTAAAC C10025GG GTTTAAAC CC

8、12050AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG2475>90Pst IGCTGCAG C800TGCA CTGCAG TGCA141010AACTGCAG AACCAATGCATTGG22>90>90AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA24>90>90CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT2600Pvu ICCGATCG G800ATCGATCG AT101025TCG CGATCG CGA12010Sac ICGAGCTC G81010廠Sac IIGCCGCGG C800TCC CCGCGG GGA1250>

9、;90Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075廠Sea IGAGTACT C81025AAA AGTACT TTT127575Sma ICCCGGG6010CCCCGGG G8010CCCCCGGG GG101050TCC CCCGGG GGA12>90>90Spe IGACTAGT C810>90GG ACTAGT CC1010>90CGG ACTAGT CCG12050廠CTAG ACTAGT CTAG14050Sph IGGCATGC C800CAT GCATGC ATG12025ACAT GCATGC ATGT141050Stu IAAGGCCT T8>90>90GAAGGCCT TC10>90>90AAAAGGCCT TTT12>90>90Xba ICTCTAGA G800GC TCTAGA GC10>90>90TGC TCTAGA GCA1275>90CTAG TCTAGA CTA