臨床PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)設(shè)計(jì)及工作流程

1、臨床臨床PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)設(shè)計(jì)及工作流程設(shè)計(jì)及工作流程衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心 李金明TelEmail: 2010.1.12-13福州臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)l依據(jù)：衛(wèi)生部頒發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法（衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號(hào)）臨床標(biāo)本的接收臨床標(biāo)本的接收 l通常的工作流程：標(biāo)本采集 血清分離 編號(hào) 保存或檢測(cè)l應(yīng)在四個(gè)測(cè)定區(qū)域之外的地方或區(qū)域內(nèi)接收 l接收的標(biāo)本應(yīng)收集在原始容器中l(wèi)在核酸提取時(shí)帶入至標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本的接收區(qū)的儀器設(shè)備要求標(biāo)本的接收區(qū)的儀器設(shè)備要求l如果在標(biāo)本接收區(qū)分離血清（漿）標(biāo)本，有1臺(tái)分離血清（漿）用

2、離心機(jī)、1臺(tái)生物安全柜、1臺(tái)冰箱、加樣器及相應(yīng)一次性經(jīng)高壓處理的消耗品如帶濾芯吸頭、標(biāo)本接收編號(hào)記錄本以及記號(hào)筆等即可。l如果不在標(biāo)本接收區(qū)分離血清（漿）標(biāo)本，只是簡(jiǎn)單的接收，則就不需要分離血清（漿）用離心機(jī)、生物安全柜、加樣器及其消耗品。理想的理想的PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)模式實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)模式A產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專(zhuān)用走廊專(zhuān)用走廊工作流向工作流向擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖

3、間緩沖間緩沖間緩沖間專(zhuān)用走廊專(zhuān)用走廊工作流向工作流向擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)理想的理想的PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)模式實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)模式B門(mén)門(mén)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)外走廊外走廊門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò) 增 及 產(chǎn) 物擴(kuò) 增 及 產(chǎn) 物分析區(qū)分析區(qū)外走廊外走廊門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)AB試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò) 增 及 產(chǎn) 物擴(kuò) 增 及 產(chǎn) 物分析區(qū)分析區(qū)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)門(mén)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向走廊走廊走廊走廊試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增和產(chǎn)

4、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室門(mén)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò) 增 及 產(chǎn)擴(kuò) 增 及 產(chǎn)物分析區(qū)物分析區(qū)門(mén)門(mén)門(mén)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向+空氣流向空氣流向+走廊走廊試 劑 準(zhǔn) 備試 劑 準(zhǔn) 備區(qū)區(qū)標(biāo) 本 制 備標(biāo) 本 制 備區(qū)區(qū)擴(kuò)增和產(chǎn)擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)物分析區(qū)空氣流向空氣流向+空氣流向+其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室空氣流向臨床臨床PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則

5、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則l各區(qū)獨(dú)立l注意風(fēng)向l因地制宜l方便工作“十六字口訣十六字口訣”產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專(zhuān)用走廊專(zhuān)用走廊工作流向工作流向擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞窗傳遞窗傳遞窗符合基本要求的臨床符合基本要求的臨床PCR實(shí)驗(yàn)室的條件實(shí)驗(yàn)室的條件l（1）試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)和擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)等三個(gè)或四個(gè)區(qū)域在物理空間上，必須是完全相互獨(dú)立的，各區(qū)域無(wú)論是在空間還是在使用中，應(yīng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。l（2）各區(qū)的可移動(dòng)的儀器設(shè)備及各種物品包括實(shí)驗(yàn)

6、記錄本、記號(hào)筆、試管架及清潔用具等必須專(zhuān)用。l（3）應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)等相對(duì)有可能出現(xiàn)“污染物”的區(qū)域安裝排風(fēng)扇或其它排風(fēng)和有效的裝置，以使空氣按試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增（及產(chǎn)物分析）區(qū)方向流動(dòng)。臨床臨床PCR實(shí)驗(yàn)室的工作流程實(shí)驗(yàn)室的工作流程試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)lPCR實(shí)驗(yàn)室中最為“潔凈”的區(qū)域，不應(yīng)有任何核酸的存在，包括試劑中所帶的標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照。l所有實(shí)驗(yàn)用潔凈物品如離心管、吸頭等的存放和準(zhǔn)備處。l商品試劑盒： 75%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水、NaOH等可能需要自配l自制試劑：一次較大量配制

7、，然后分裝成小瓶保存，每次檢測(cè)時(shí)，取出一小瓶使用，未用完的即棄掉，不再使用。l儀器設(shè)備主要有加樣器、天平、離心機(jī)和冰箱等，最好配備超凈工作臺(tái)。標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)l儀器設(shè)備主要有生物安全柜、超凈臺(tái)、加樣器、高速臺(tái)式（冷凍）離心機(jī)、加熱模塊或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不應(yīng)放在實(shí)驗(yàn)室門(mén)口等易受人員走動(dòng)影響的地方，也不應(yīng)直對(duì)分體式空調(diào)。l主要是用于核酸樣本的提取，標(biāo)本的制備應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，可防止標(biāo)本氣溶膠的擴(kuò)散。l加樣器吸頭必須帶濾芯。l使用加熱模塊時(shí)，如在模塊孔中填入二氧化硅細(xì)砂，然后將標(biāo)本管置于細(xì)砂中溫育，可得到較為一致的溫育溫度。標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)l經(jīng)高溫溫育后的標(biāo)本，應(yīng)冷至室溫后再離

8、心。l標(biāo)本制備的全過(guò)程中都應(yīng)戴一次性手套，并經(jīng)常更換（感覺(jué)有污染時(shí)）。l設(shè)備都應(yīng)定期或在有明顯已知污染后，使用中性消毒劑如異丙醇、戊二醇等或10%次氯酸鈉溶液消毒，使用10%次氯酸鈉溶液消毒后，應(yīng)再用70%乙醇洗滌去除殘留的次氯酸鈉。l生物安全：洗眼器，并配備一個(gè)急救箱，箱內(nèi)可放置75%酒精、絡(luò)合碘、棉簽、創(chuàng)可貼等必要的急用藥具。擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)l擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制和提取核酸的加入，可在標(biāo)本制備區(qū)也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行，關(guān)鍵是要防止產(chǎn)物的污染。如果空間允許的話，也可在一個(gè)獨(dú)立的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。l采用“巢式”P(pán)CR方法的第二輪擴(kuò)增的加樣，必須在本區(qū)進(jìn)行。l加樣時(shí)，先加提取的核酸模板樣本，每加完一個(gè)即蓋好蓋子，然后加陽(yáng)性質(zhì)控核酸模板，再就是標(biāo)本制備陰性質(zhì)控和僅含按樣本一樣稀釋的主反應(yīng)混合液的擴(kuò)增陰性質(zhì)控，這樣做的目的是，最大可能地測(cè)出以前擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)l熱循環(huán)儀的電源應(yīng)專(zhuān)用，并配備一個(gè)不間斷電源（UPS）或穩(wěn)壓電源。l每次擴(kuò)增后，可使用可移動(dòng)紫外燈對(duì)擴(kuò)增熱循環(huán)儀進(jìn)行照射。l擴(kuò)增儀應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)。產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)l產(chǎn)物分析區(qū)是臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的最后一個(gè)工作區(qū)域，也是需要打開(kāi)擴(kuò)增后反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物分析檢測(cè)的地方。是PCR實(shí)驗(yàn)