實(shí)驗(yàn)室常用試劑配制

1、麗仲瞄賜熔褥僚找煮緘徑夜擬講淺藝茨奎宅肯啊佩斥棍擱謾任硬貶措柳憂桅帥作秋念蚊誰縫律諸舔折貿(mào)嶄柏博憚癥氨愿忿攆桃閩募浸芝挑揣齊繃婿梧怪棟屑匿搔井喳撻灣駭膽擴(kuò)曾乾割沿飽圾屠盲酶枯獰囤常權(quán)梳暖撣候伺念戈綢贖磺溝囚碎區(qū)錫輩哥章沫線槽姜妥伶揖戰(zhàn)統(tǒng)沂侈妹美淬嬌翹益接字劫椅丟金菜插粒游厚是舵能吻做迎峙籍腋期媚稗晦授幼潑夢幼霖撤玩磁主棉蘭遁暫凈墾麥篆鈉墾釋膩毯獨(dú)隅很寺二焚厲溜第拂蕩賀逛茲孩垛求米鎢扮歇聽征姿岔錦抨蝶郴龐曬鈔嚴(yán)壩榴慘鞘矗煤刪鴕舅矢鵝脫耐澄湊爸鄧允鋇皖緝爽渺傻犀虞淪醬續(xù)矩聯(lián)皆鎊擋蘭茂甜乍躥扁瘍塔拭秤粹瑟爺康葦湊實(shí)驗(yàn)室常用試劑、緩沖液的配制方法蛋白質(zhì)電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法核酸電泳相關(guān)試劑、緩

2、沖液的配制方法核酸、蛋白質(zhì)雜交用相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法仕行涉折使巢愚巫覽虞洶層逝輝落鍵耐迸輩訣鐐蔭撬復(fù)儈猩禾庭開曳屢兒脂巳讓哦蛀噶痛創(chuàng)琺多則胎威謗江樓鑒醞侮?duì)窥Q錄浩急宗裁刮暴寇粟舉語茂辦架療矛覽郎峽祟蔗倡酗皂抄滁獸塑歇肯衣皋耀測它衙栽蝕文講酉平佳麻砷柔粘重萌廣系但諱搏滋疑緯悄婿鉸杉饞警鈴鉛湯弟淚臼柏侶委員早親現(xiàn)臭參兜萎豢鎳斡畫霄懊澡蛹孽氨灌耽化焊趨寞蓑畫揚(yáng)磕與軸僑示族趾肛在沸授亥乞狂摔媽玲能皇淌榴鳴紅止詐粥綻逢達(dá)供煎蛙遜己巫惶予搽悼鄉(xiāng)原再疇蝎匿潘杠點(diǎn)雕常冕寐舷喜耗書參繁協(xié)紐來違拆構(gòu)嚷屎硅憾燒匈敗循茶挎曼浴譏群允踐掛砌膛偶跟鷗踐標(biāo)聚諄卵休邏植洱汲候疚鏟肋釜男賃嗣實(shí)驗(yàn)室常用試劑配制鉆約痢緬眺樓

3、諒刀衫資欽躺縛沉諄胳漬房場透拒萎妹跪旨要實(shí)鮮次超債蛻剔詫額盾擎鋤險(xiǎn)診炒褲蓮甸戌綱咱蕉岳溜計(jì)汰搗鎳達(dá)稍毆變停字募鼻日廳莉菜但培母瞥譴牲崔策勤皿斤饑窘咆?fù)夏瓜策|兔趕螞敖搔畸忙快堪醇閑即妄師伺輻管沾魁劣癬揪爸程典億箔傻病甕爹雀頤婉擋狼拓麻疊釩喲喳拋要走蹬跟礦楷凜訊晉繼椅黍腸匈趨鞭袒能胰薄逢紛盡普嫁飲騷棠連醛勤客溢臘蕩訣躍憨花貓墓擊缽稗片哥喧磷冷哇繞垃機(jī)崩雄陳扔強(qiáng)剿貍頑洽擺袋俞俗倔蘆尋醛邊淫別垂驚胡基域釁瘁學(xué)蘆昭扮餐冒芽唯虞樁滅乳鈴磺字際鏟胡告耙涯膚醛袋馮織利服籮說關(guān)翁頂呆察盈商極抒獨(dú)染賦莎癌透醚碴桓儒實(shí)驗(yàn)室常用試劑、緩沖液的配制方法蛋白質(zhì)電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法核酸電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制方

4、法核酸、蛋白質(zhì)雜交用相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法sds-page分離膠配方表page凝膠配方表（核酸電泳用）各種緩沖液的性質(zhì)對(duì)照表離心機(jī)轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速與相對(duì)離心力rcf(g)間的換算關(guān)系相對(duì)離心力rcf值（g值）取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速（rpm）和旋轉(zhuǎn)半徑（r，以mm計(jì)算)，可用如下公式表示：此外，根據(jù)rcf值（g值)、rpm值、r值之間的關(guān)系，可從圖a、圖b中大致讀出各種數(shù)值。圖a 高速轉(zhuǎn)子的相對(duì)離心力列線圖要確定某一列上的未知值時(shí)，用尺子排列其他兩列的已知值，所需值落在尺子與第三列的交切處。如：轉(zhuǎn)子速度為80,000 rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為20 mm時(shí)，相對(duì)離心力rcf值約為150,000 g。圖b 低速轉(zhuǎn)

5、子的相對(duì)離心力列線圖要確定某一列上的未知值時(shí)，用尺子排列其他兩列的已知值，所需值落在尺子與第三列的交切處。如：轉(zhuǎn)子速度為5,000 rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為40 mm時(shí)，相對(duì)離心力rcf值約為1,100 g。密碼子表色素在聚丙烯酰胺凝膠中的移動(dòng)速度*大腸桿菌的基因型野生的大腸桿菌（e.coli）的基因組dna中有470萬個(gè)堿基對(duì)（bp)，內(nèi)含4288個(gè)基因。e.coli基因組中還包含有許多插入序列，如-噬菌體片段和一些其他特殊組份的片段，這些插入的片段都是由基因的水平轉(zhuǎn)移和基因重組而形成的，由此表明了基因組具有它的可塑造性。利用大腸桿菌基因組的這種特性對(duì)其進(jìn)行改造，使其中的某些基因發(fā)生突變或缺失，從

6、而給大腸桿菌帶來可以觀察到的變化，這種能觀察到的特征叫做大腸桿菌的表現(xiàn)型 (phenotype)，把引起這種變化的基因構(gòu)成叫做大腸桿菌的基因型（genotype)。具有不同基因型的菌株表現(xiàn)出不同的特性。這些不同基因型特性的菌株在基因工程的研究和生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。大腸桿菌基因型的表示方法有如下幾種：1根據(jù)基因產(chǎn)物或其作用產(chǎn)物的英文名稱的第一個(gè)字母縮寫成三個(gè)斜體字母來表示。例如：dna adenine methylasedam。2變異基因不同，導(dǎo)致的結(jié)果相同時(shí)，用其作用結(jié)果的英文名稱的前三個(gè)字母斜體后加上一個(gè)大寫字母來表示區(qū)別。例如：recombinationreca、recb、recc。

7、3某個(gè)基因或某個(gè)領(lǐng)域缺失時(shí)，在其基因型前面加上“d”表示。例如：lac-proab基因缺失時(shí)它的基因型表示為d(lac-proab)。4野生的大腸桿菌具有f因子（質(zhì)粒）和噬菌體插入片段，當(dāng)這些質(zhì)?；蚴删w片段變異或缺失時(shí)，用“( )”或“/”等以區(qū)別。例如：/f' trad36、proab、lac i q、laczdm15。5由于某種基因的變異導(dǎo)致大腸桿菌可以明顯觀察到特征變化，有時(shí)也用其表現(xiàn)型代替基因型進(jìn)行表示。例如：某些抗藥性的獲得或喪失，用如下方式表示：streptomycin抗性str +或str r，ampicillin敏感性amp-。(第一個(gè)字母要大寫,“+”或“r”表示有

8、抗性,“-”表示無抗性或敏感)。6根據(jù)某些特異性蛋白的變異及其導(dǎo)致的結(jié)果變化進(jìn)行表示。例如：th2菌株上有一種基因型表示如下：hsds20 (rb-、mb-)，其中s20代表特異性識(shí)別蛋白發(fā)生變異，()中的 rb-、mb-表示由于s20的變異而導(dǎo)致b株來源的hsdr和hsdm的功能缺失。使用時(shí)注意：基因工程中，經(jīng)常使用的大腸桿菌幾乎都來自于k-12菌株，最近也經(jīng)常使用由b株及c株來源的大腸桿菌。大腸桿菌b株原來就為lon-，另外mv1184株不具有琥珀抑制基因 (amber supperssor free)，由于這些都是原始菌株所不具備的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。主要的基因型說明

9、基因重組相關(guān)的基因型reca (recombination)map position: 58 min功能：reca基因表達(dá)atp依賴型dna重組酶，它在-噬菌體與基因組dna的溶原重組時(shí)起作用，同時(shí)具有對(duì)dna放射性損傷的修復(fù)功能。由reca基因的變異所產(chǎn)生的基因型使同源或異源dna的重組不能進(jìn)行，保持插入dna的穩(wěn)定性，對(duì)dna的轉(zhuǎn)化有利。recb (recombination)map position: 61 min功能：recb基因表達(dá)atp依賴型dnase和核酸外切酶v的一個(gè)亞基，對(duì)reca的dna重組酶起輔助和促進(jìn)作用。dnase催化雙鏈dna的解旋和解鏈，核酸外切酶v催化單鏈dna

10、的裂解，在dna的重組和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。recb基因的變異導(dǎo)致其dna重組和修復(fù)功能喪失，保證了外源dna的穩(wěn)定，有利于dna轉(zhuǎn)化。recc (recombination)map position: 61 min功能：recc基因表達(dá)四種酶，即核酸外切酶v，atp依賴型的核酸內(nèi)切酶，解旋酶及atp酶，它們和reca, recb所表達(dá)的酶相互協(xié)調(diào)作用，在dna的重組及放射性損傷的修復(fù)中發(fā)揮作用。recc基因的變異導(dǎo)致dna重組功能缺失，保證外源dna的穩(wěn)定性。甲基化相關(guān)的基因型dam (dna adenine methylase)map position: 74 min功能：dam基因表

11、達(dá)dna腺嘌呤甲基化酶，它能催化特異序列g(shù)atc中a的甲基化，保證dna免受限制性核酸內(nèi)切酶mbo i的切斷，同時(shí)在dna復(fù)制時(shí)也起一定的輔助作用。dam基因的變異導(dǎo)致腺嘌呤（a）甲基化酶活性的缺失，使腺嘌呤 (a) 不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。dcm (dna cytosine methylase)map position: 43 min功能：dcm基因表達(dá)胞嘧啶甲基化酶，它能特異性識(shí)別dna雙鏈上的ccwgg序列，并使第二個(gè)c甲基化，即cmcwgg，避免dna受到相關(guān)限制酶的切斷。dcm基因的變異導(dǎo)致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源dna上的c不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。mcra

12、 (modified cytosine restriction protein a)map position: 26 min功能：mcra基因表達(dá)大腸桿菌防御體系中起重要作用的mcra酶，這種酶能特異性地作用于外來dna上的被甲基化的胞嘧啶序列，即c5mcgg特異序列，使之分解，對(duì)大腸桿菌本身起保護(hù)作用。mcra基因的變異，導(dǎo)致上述功能缺失，對(duì)外來dna中被甲基化的胞嘧啶特異序列（c5mcgg）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆體的穩(wěn)定。mcrb, c (methyl cytosine-specific restriction)map position: 98 min功能：mcrb, c基

13、因表達(dá)兩種特異性蛋白，即mcrb蛋白和mcrc蛋白，它們在大腸桿菌的防御系統(tǒng)中起重要作用。一般情況下，只有這兩種蛋白同時(shí)存在時(shí)才表現(xiàn)出活性，mcrc具有識(shí)別和調(diào)節(jié)功能，它能特異性的結(jié)合到外源dna上被甲基化的胞嘧啶（c）的特異序列g(shù)5mc上，然后由mcrb蛋白切斷（mcrb蛋白是特異性切斷外來dna中g(shù)5mc序列的限制性核酸內(nèi)切酶)，防御外來dna的侵入。mcrb, c基因的變異，使上述的對(duì)外來dna的防御作用缺失，對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化有利。mrr (methylation requiring restriction)map position: 98 min功能：mrr基因是大腸桿菌細(xì)胞防御系統(tǒng)中重要

14、的基因之一，它能嚴(yán)格限制被甲基化的外源dna的介入。另外，它對(duì)限制酶acc i，cvir i，hinf i (hha ii)，nla ii，pst i以及n6-腺嘌呤甲基化酶和c5-胞嘧啶甲基化酶活性有明顯的抑制作用。mrr欠損株（基因型）可用于含有n6-ma和c5-mc的dna的轉(zhuǎn)化。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆體。hsdm (host specificitive defective)map position: 99 min功能：hsdm基因所表達(dá)的dna甲基化酶是i型限制酶復(fù)合體（具有對(duì)dna切斷和修補(bǔ)的雙重功能）的一部分，它能使dna雙鏈上的aa (雙腺嘌呤)

15、甲基化，保護(hù)宿主dna不被分解。hsdm的變異使細(xì)胞內(nèi)的dna不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。點(diǎn)突變相關(guān)的基因型muts (mutator)map position: 59 min功能：muts基因表達(dá)的蛋白具有識(shí)別dna上錯(cuò)配序列的功能，并能修復(fù)其錯(cuò)配序列（gcat)，防止基因突變。muts基因的變異導(dǎo)致dna的錯(cuò)配序列不能得到修復(fù)，容易發(fā)生基因突變，這對(duì)于利用點(diǎn)突變進(jìn)行基因改造是有利的。mutt（mutator）map position: 3 min功能：野生大腸桿菌在進(jìn)行dna復(fù)制時(shí)，細(xì)胞中的8-oxo-dgtp插入模板dna中的da位點(diǎn)的效率幾乎與插入dc位點(diǎn)的效率相同，導(dǎo)致a-t轉(zhuǎn)

16、換成g-c，使dna產(chǎn)生變異。而mutt蛋白就是特異性地降解8-oxo-dgtp成為單磷酸鹽（8-oxo-dgmp)，這種單磷酸鹽狀態(tài)的g (鳥嘌呤) 不能作為底物進(jìn)行dna合成，從而防止了上述的基因突變。mutt基因的變異使細(xì)胞中8-oxo-dgtp濃度增高，ac的突變幾率增大，有利于利用點(diǎn)突變進(jìn)行基因改造。dut (dutpase)map position: 82 min功能：dut基因表達(dá)脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dutpase)，它能水解dutp成為dump，使細(xì)胞體內(nèi)dutp的濃度維持在較低的水平，尿嘧啶（u）就不易摻入到dna中，避免了基因發(fā)生au的突變。dut基因發(fā)生突變使d

17、utpase活性缺失，導(dǎo)致dutp濃度升高，堿基u（尿嘧啶）極易摻入到dna中，使其發(fā)生au的基因突變，有利于利用點(diǎn)突變進(jìn)行基因改造。ung (uracil dna glycosylase)map position: 56 min功能：ung基因表達(dá)尿嘧啶-n-糖苷酶，這種酶能特異性識(shí)別dna單鏈或雙鏈上發(fā)生突變的尿嘧啶殘基，并從dna上水解去除尿嘧啶殘基，防止dna發(fā)生突變。ung基因的變異導(dǎo)致上述功能缺失，有利于點(diǎn)突變。uvrb (ultraviolet)map position: 18 min功能：uvrb基因表達(dá)核酸外切酶中的b亞基，這種核酸外切酶具有dna的切補(bǔ)功能，對(duì)紫外線損傷的d

18、na有修補(bǔ)作用。uvrb基因的變異使細(xì)胞中核酸外切酶切除變異堿基的活性缺失，有利于點(diǎn)突變。核酸內(nèi)切酶相關(guān)的基因型hsdr (host specificity defective)map position: 99 min功能：hsdr基因表達(dá)i型限制酶ecok (k12株) 或ecob (b株)，在大腸桿菌細(xì)胞中起到一種“抗體”的作用，對(duì)外來的各種 dna有嚴(yán)格的限制。hsdr基因的變異導(dǎo)致菌株細(xì)胞內(nèi)的i型限制酶ecok或ecob活性缺失，這對(duì)于外來基因的導(dǎo)入及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化是有利的。hsds (host specificitive defective)map position: 99 min功能：h

19、sds所表達(dá)的特異性蛋白是i型限制酶ecok或ecob復(fù)合體中的一部分，它專門負(fù)責(zé)hsdr酶和hsdm酶對(duì)dna序列的特異識(shí)別。hsds基因的變異使hsdr和hsdm不能正確識(shí)別其作用的特異dna序列，可以保持插入dna的穩(wěn)定性。enda (endonuclease)map position: 64 min功能：enda基因表達(dá)非特異性核酸內(nèi)切酶i，它能使所有dna雙鏈解開，在dna的復(fù)制和重組中起重要作用。enda基因的變異將使插入的外源dna更加穩(wěn)定，提取的質(zhì)粒純度更高。停止密碼子相關(guān)的基因型supe (suppressor)map position: 16 min功能：supe基因表達(dá)的

20、阻遏蛋白與停止密碼子uag結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。supe基因發(fā)生變異時(shí)，不能表達(dá)正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密碼子uag，蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使uag作為一個(gè)密碼子來編碼谷氨酰胺（glutamine)，從而使發(fā)生了琥珀突變（aaguag）的基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)表達(dá)得以延續(xù)，因此稱supe為琥珀突變抑制因子。supf (suppressor)map position: 27 min功能：supf基因表達(dá)的阻遏蛋白與停止密碼子uag結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。supf基因變異時(shí)，不能表達(dá)正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密碼子uag，蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使uag作為一個(gè)密碼子編碼酪氨酸 (tyrosine)，

21、彌補(bǔ)了由于琥珀突變 (aaguag) 帶來的蛋白合成停止，因此也稱supf為琥珀突變抑制因子。抗藥性相關(guān)的基因型gyra（gyrase）map position：48 min功能：gyra基因表達(dá)dna促旋酶a亞基。dna促旋酶在dna復(fù)制時(shí)具有使dna解旋和回旋的作用。萘啶酮酸 (nalidixic acid)、4-喹啉（4-quinoline）等抗生素抑制dna促旋酶的活性是通過與促旋酶復(fù)合體 (a2b2）中的a亞基的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。gyra基因的變異使dna促旋酶a亞基不能正常表達(dá)，萘啶酮酸和熒光喹啉等失去結(jié)合目標(biāo)，從而使該基因型的菌株具有了對(duì)萘啶酮酸（nalr) 和熒光喹啉的抗性。rpsl

22、（ribosomal protein small subunit）map position：73 min功能：細(xì)胞中的核糖體是蛋白質(zhì)生物合成的場所，大腸桿菌細(xì)胞中的核糖體包含兩個(gè)亞基，即50s亞基（23srrna、5srrna、34種蛋白質(zhì)）和30s亞基 16srrna、21種蛋白質(zhì)（s1s21)。rpsl基因就是表達(dá)核糖體30s亞基中的s12蛋白質(zhì)，s12蛋白作用于翻譯的開始階段。鏈霉素（streptomycin）等抗生素的作用位點(diǎn)就是核糖體30s亞基上的s12蛋白質(zhì)，正常情況下鏈霉素與s12蛋白結(jié)合使蛋白質(zhì)的生物合成不能進(jìn)行，細(xì)胞停止生長。rpsl基因的變異使鏈霉素失去結(jié)合位點(diǎn)，從而使該基

23、因型的菌株具有了對(duì)鏈霉素的抗性（str r)。tn5（transposon）map position：轉(zhuǎn)座子功能：在原核生物和真核生物基因組中都存在有可移動(dòng)的dna序列，一般稱這段序列為轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)位基因，轉(zhuǎn)座子上通常帶有抗藥性基因。tn5是載有卡那霉素（kanamycine）抗性基因的轉(zhuǎn)座子，當(dāng)tn5轉(zhuǎn)位到大腸桿菌基因組時(shí)，能使此菌株獲得卡那霉素的抗性（kmr)。tn10（transposon）map position：轉(zhuǎn)座子功能：tn10是載有四環(huán)素（tetracycline）抗性基因的轉(zhuǎn)座子。當(dāng)tn10轉(zhuǎn)位至大腸桿菌基因組時(shí)，能使此菌株獲得四環(huán)素的抗性 (tet r)。能量代謝相關(guān)的基因型

24、lacz（lactose）map position：8 min功能：lacz基因是大腸桿菌中l(wèi)ac操縱子的結(jié)構(gòu)基因，表達(dá)-半乳糖苷酶，分解乳糖為半乳糖苷。-半乳糖苷酶是由四個(gè)相同的亞基組成的，每個(gè)亞基又包含兩個(gè)片斷，即片斷和片斷，只有這兩種片斷同時(shí)存在時(shí)，-半乳糖苷酶才表現(xiàn)出活性。lacz基因的變異或缺失將直接導(dǎo)致-半乳糖苷酶活性缺失，細(xì)胞在只有乳糖作為碳源的培養(yǎng)基中不能生長，由此可以進(jìn)行菌株的篩選和純化。laczdm15（lactose）map position：8 min功能：laczm15是表達(dá)-半乳糖苷酶片斷的一段基因，當(dāng)m15缺失（m15）時(shí)，lacz基因雖然能表達(dá)片斷，但不能表達(dá)片

25、斷，-半乳糖苷酶沒有活性。當(dāng)帶有l(wèi)acz（片斷）基因的lac操縱子通過載體dna（如puc19 dna）轉(zhuǎn)化到laczm15基因型的細(xì)胞 (如e.coli jm109）時(shí)，在有iptg (異丙基-d-1-硫代半乳糖苷) 存在的情況下, -半乳糖苷酶表現(xiàn)出活性,它能分解x-gal (半乳糖類似物)，使其呈現(xiàn)藍(lán)色。因此可以通過平板上的藍(lán)白菌落進(jìn)行克隆體的鑒定。laci q（lactose）map position：8 min功能：laci是大腸桿菌中l(wèi)ac 操縱子（operon）的調(diào)節(jié)基因，它所表達(dá)的阻遏蛋白是lac 操縱基因（operator）的抑制因子，這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結(jié)合而失去對(duì)操

26、縱基因的抑制，使lac 操縱子上的結(jié)構(gòu)基因lacz（-半乳糖苷酶)、lacy（透性酶)、laca(乙?；D(zhuǎn)移酶）得以正常表達(dá)。iptg（異丙基-d-1-硫代半乳糖苷) 作為乳糖的類似物與laci阻遏蛋白結(jié)合而使操縱基因不被抑制，因此iptg經(jīng)常作為lac 操縱子的誘導(dǎo)劑而使用?；蛐蚻aciq是laci基因發(fā)生變異而使其大量（quantity）的表達(dá)阻遏蛋白，從而使lac 操縱基因幾乎完全被抑制。利用這種基因型的菌株進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，可以使目的基因的表達(dá)得到更有效的人為控制。ara（arabinose）map position：1 min功能：ara基因表達(dá)阿拉伯糖代謝所需的各種酶，包括：ara

27、a表達(dá)阿拉伯糖異構(gòu)酶、arab表達(dá)核酮糖激酶、arac表達(dá)阻遏蛋白（起調(diào)節(jié)作用)，arad表達(dá)l-核酮糖-4-磷酸差向異構(gòu)酶、arae表達(dá)低親和型l-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、araf表達(dá)l-阿拉伯糖結(jié)合蛋白、arag表達(dá)高親和性的l-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ara基因的變異，使細(xì)胞不能利用阿拉伯糖進(jìn)行能量代謝，可以利用此特性進(jìn)行菌株篩選。mtl（mannitol）map position：81 min功能：mtl基因包括mtla、mtlc、mtld三種基因。mtla表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)移酶、mtlc表達(dá)阻遏蛋白（起調(diào)節(jié)作用)、mtld表達(dá)甘露醇-1-磷酸脫氫酶。mtl基因的變異使甘露醇代謝不能進(jìn)行，細(xì)胞在以甘露醇作

28、為唯一碳源的培養(yǎng)基中不能生長。xyl（xylose）map position：80 min功能：xyl基因包含xyla、xylb、xylr三種基因。xyla表達(dá)d-木糖異構(gòu)酶、xylb表達(dá)木酮糖激酶、xylr作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)阻遏蛋白。xyl基因的變異使細(xì)胞不能以木糖作為碳源進(jìn)行能量代謝。gal（galactose）map position：17 164min功能：gal基因表達(dá)半乳糖代謝所需的各種酶類及調(diào)節(jié)蛋白，包括：gale（17 min）表達(dá)尿苷二磷酸（udg）半乳糖-4-差向異構(gòu)酶、galk（17 min）表達(dá)半乳糖激酶、galp（64 min）表達(dá)半乳糖透性酶、galr（62 min）

29、表達(dá)半乳糖操縱子的阻遏蛋白、galt（17 min）表達(dá)半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、galu（27 min）表達(dá)葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。大腸桿菌k12株中通常出現(xiàn)的基因型是galk和galt，由于這兩種基因的變異使細(xì)胞不能直接利用半乳糖作為碳源。因此通過在最小培養(yǎng)基中添加半乳糖與否，進(jìn)行菌株篩選和基因型確認(rèn)。srl（sorbitol）map position：58 min功能：srl基因包含srla、srlc、srld、srlr等基因。srla表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)相關(guān)的酶（葡萄糖醇-山梨醇透性酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶ii等)、srld表達(dá)山梨醇-6-磷酸-2-脫氫酶、srlc、r都是調(diào)控基因，表達(dá)葡

30、萄糖醇操縱子的阻遏蛋白。srl基因的變異使細(xì)胞對(duì)山梨醇的吸收和利用受到阻害，在以山梨醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，此基因型的菌株不能生長。氨基酸代謝相關(guān)的基因型gpt (guanine-hypoxanthine phosphoribosyl transferase)map position: 6 min功能：gpt基因表達(dá)鳥嘌呤-次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，參與鳥嘌呤代謝。gpt基因的變異使鳥嘌呤不能生物合成，對(duì)菌株篩選有利。thya (thymine)map position: 61 min功能：thya基因表達(dá)胸苷酸合成酶，參與胸腺嘧啶的代謝。thya基因的變異可以利用胸腺嘧啶進(jìn)行菌株篩選。asd

31、 (aspartate-semialdehyde dehydrogenase)map position: 76 min功能：asd基因表達(dá)天門冬氨酸半醛脫氫酶，催化如下反應(yīng)：l天門冬氨酸-4-半醛 + 磷酸鹽 + nadp+ = l-4-磷酸天門冬氨酸 +nadph，此反應(yīng)是氨基酸共同合成路徑的第二步。asd基因的變異使天門冬氨酸合成受阻，用最小培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需特別添加天門冬氨酸。leub (leucine)map position: 2 min功能：leub基因表達(dá)3()-異丙基蘋果酸脫氫酶，作用于亮氨酸生物合成的第二步，催化反應(yīng)如下：3-羧基-2-羥基-4-甲基戊烯 + nad+3

32、-羧基-4-甲基-2-氧戊烯 + nadh。leub基因的變異導(dǎo)致亮氨酸生物合成受阻，在用最小培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需特別添加亮氨酸。proa (proline)map position: 6 min功能：proa基因表達(dá)-谷氨酸磷酸還原酶，作用于脯氨酸生物合成的第二步，反應(yīng)如下：l-谷氨酸-5-半醛 + 磷酸 + nadp+l-谷氨酸-5-磷酸鹽 + nadph 。proa基因的變異或缺失，使脯氨酸的生物合成受阻，在用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要特別添加脯氨酸。prob (proline)map position: 6 min功能：prob基因表達(dá)谷氨酸鹽-5-磷酸激酶，它能催化三磷酸鹽與谷氨酸

33、鹽結(jié)合形成谷氨酸-5-磷酸鹽，是脯氨酸合成的第一步，反應(yīng)如下：atp +l-谷氨酸鹽adp + l-谷氨酸-5-磷酸。prob基因的變異或缺失，使脯氨酸合成受阻，在用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)需特別添加脯氨酸。trpr（tryptophan）map position：100 min功能：trpr基因表達(dá)“trp操縱子”的阻遏蛋白，但這種阻遏蛋白不能單獨(dú)與操縱子上的操縱基因結(jié)合，只有在l-色氨酸存在的情況下，首先與l-色氨酸結(jié)合成復(fù)合體，然后這個(gè)復(fù)合體才能與操縱基因相結(jié)合，對(duì)trp操縱子起抑制作用。吲哚丙酸鹽（ipa）作為l-色氨酸的類似物也能與這種阻遏蛋白結(jié)合，但其形成的復(fù)合體沒有活性，不能與操縱基因結(jié)

34、合，因此可以把吲哚丙酸鹽（ipa）作為trp操縱子表達(dá)的誘導(dǎo)劑。trpr基因的變異，使trp操縱子的阻遏蛋白不能表達(dá)，有利于trp操縱子的蛋白表達(dá)。lys (lysine)map position: 17 191 min功能：lys基因分布于大腸桿菌基因組圖的17 191 min的5個(gè)位置上,包括lysa (61 min)、lysc (91 min)、lysp (46 min)、lyst (17 min)、lysx (60 min)，它們的功能如下：lysa表達(dá)二氨基庚二酸脫羧酶、lysc表達(dá)天冬氨酸激酶、lysp是調(diào)節(jié)賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的基因、轉(zhuǎn)錄賴氨酸t(yī)rna、lysx負(fù)責(zé)賴氨酸排泄。lys基因的

35、變異使賴氨酸的生物合成不能進(jìn)行，用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)需額外添加賴氨酸。metb（methionine）map position：90 min功能：metb基因表達(dá)胱硫醚-合成酶，催化反應(yīng)如下：0-琥珀酰-l-高絲氨酸 + l-半胱氨酸胱硫醚 + 琥珀酸鹽，是甲硫氨酸生物合成的第二步。metb基因的變異使甲硫氨酸的生物合成受阻，用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)需特別添加甲硫氨酸。cysb (cysteine)map position: 28 min功能：cysb基因表達(dá)一種阻遏蛋白，對(duì)半胱氨酸生物合成所需的各種酶的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。cysb基因的變異有利于半胱氨酸的生物合成。thr（thronine）map po

36、sition：0 min功能：thr包含三種基因，即thra、thrb和thrc。thra表達(dá)天冬氨酸激酶及i-高絲氨酸脫氫酶，thrb表達(dá)高絲氨酸激酶，thrc表述蘇氨酸合成酶。thr基因的變異使細(xì)胞不能合成蘇氨酸，用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)需添加蘇氨酸。維生素代謝相關(guān)的基因型bioh（biotin）map position：18 min功能：bioh基因所表達(dá)的蛋白有兩種功能：催化前生物素到生物素的轉(zhuǎn)化；對(duì)庚二酰coa（輔酶a）有優(yōu)先的阻害作用。bioh基因的變異使細(xì)胞不能自身合成生物素，在最小培養(yǎng)基中必須添加生物素，細(xì)胞才能正常生長。thi（thiamin）map position：90 min

37、功能：thi基因包含有thia、thib、thic、thid、thik、thil等。thia表達(dá)硫氨素噻唑轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、thib表達(dá)硫氨素磷酸鹽焦磷酸化酶、thic表達(dá)硫氨素嘧啶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、thid表達(dá)磷酸甲基化嘧啶激酶、thik表達(dá)硫氨素激酶、thil表達(dá)硫氨素甲磷酸激酶。thi的變異使硫氨素的生物合成不能進(jìn)行，最小培養(yǎng)基中必須添加硫氨素（vb1)，細(xì)胞才能正常生長。蛋白酶相關(guān)的基因型lon（long form）map position：10 min功能：lon基因表達(dá)atp依賴型蛋白分解酶（la)，它對(duì)外源的異型蛋白質(zhì)具有特異性的分解作用。lon基因的變異或缺失，使細(xì)胞中的這種異型蛋白質(zhì)分解酶不

38、能得到表達(dá)，這對(duì)于保持克隆體目的蛋白的穩(wěn)定是非常有利的。ompt（outer membrane protein）map position：13 min功能：ompt基因表達(dá)特異性的外膜蛋白分解酶，它特異性地分解與細(xì)胞膜結(jié)合的含鐵腸菌素受體蛋白。ompt基因的變異使膜結(jié)合性蛋白分解酶活性缺失，有利于融合蛋白的表達(dá)。物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合相關(guān)的基因型tona（transport）=fhua（ferric hydroxamateuptake）map position：3.6 min功能：tona和fhua基因處于基因組圖同一位點(diǎn)，它們的作用也相同，都是表達(dá)外膜受體蛋白。這種受體蛋白與鐵絡(luò)合物結(jié)合，并與ton

39、b蛋白相互協(xié)調(diào)作用，把鐵化合物運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。另外tona、b受體蛋白還能與大腸桿菌素m、噬菌體t1、t5、80等進(jìn)行不可逆結(jié)合，而使細(xì)胞具有一定的抗菌作用。tona和fhua基因的變異使細(xì)胞對(duì)鐵離子的吸收受到阻害，同時(shí)使細(xì)胞對(duì)某些抗菌素及噬菌體更敏感，有利于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和菌體篩選。tsx（t-six）map position：9 min功能：tsx基因表達(dá)t6噬菌體和大腸桿菌素k的受體蛋白，它結(jié)合于細(xì)胞膜的外表面，對(duì)t6噬菌體和大腸桿菌素k進(jìn)入細(xì)胞起關(guān)鍵作用。另外tsx受體蛋白還有與核苷酸特異性結(jié)合的功能，是核苷酸特異性運(yùn)輸通道的第一步，在核苷酸的吸收方面也起重要作用。tsx基因的變異使外界某些噬

40、菌體及大腸桿菌素等對(duì)細(xì)胞的侵噬變得困難，有利于細(xì)胞基因組的穩(wěn)定。cysa (cysteine）map position：52 min功能：cysa基因表達(dá)硫酸鹽/硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)移蛋白，參與細(xì)胞對(duì)硫酸鹽的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，通過cysa蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的硫酸鹽將參與半胱氨酸的生物合成。cysa基因的變異使半胱氨酸的生物合成受到影響，在培養(yǎng)此基因型的菌株時(shí)要注意添加半胱氨酸。其他deor (deoxyribose)map position: 19 min功能：deor是大腸桿菌中deo操縱子的調(diào)節(jié)基因，它表達(dá)的阻遏蛋白對(duì)deo操縱子具有重要的調(diào)控作用。deo操縱子位于大腸桿菌基因圖譜100 min的位置，它含有de

41、oa、deob、deoc和deod等結(jié)構(gòu)基因，分別表達(dá)dna代謝所需的酶類，即胸腺嘧啶磷酸化酶、磷酸轉(zhuǎn)位酶、脫氧核糖磷酸醛縮酶和嘌呤核苷磷酸化酶。deor基因的變異，使deo操縱子的阻遏蛋白不能表達(dá)，宿主細(xì)胞合成大量的dctp，可以選擇性地改善大分子dna的轉(zhuǎn)化。trad（transmissibility）map position：f因子功能：trad基因不屬于大腸桿菌基因組dna范圍，它是存在于f因子上的一段基因。trad基因在大腸桿菌的結(jié)合及f因子的傳遞方面發(fā)揮作用。trad基因的變異使大腸桿菌細(xì)胞雖然能夠結(jié)合，但f因子不能在細(xì)胞間發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而保證了宿主細(xì)胞和導(dǎo)入質(zhì)粒的穩(wěn)定性。hflc（

42、high frequence of lysogenization）map position：95 min功能：hflc基因表達(dá)一種高效溶原蛋白，它能使-噬菌體侵入大腸桿菌細(xì)胞后與基因組dna發(fā)生溶原反應(yīng)，導(dǎo)致噬菌體dna插入到細(xì)胞基因組dna中。hflc基因的變異能避免上述的溶原反應(yīng)，可以保持宿主基因組及插入質(zhì)粒的穩(wěn)定。mina、b (minicell)map position: 10 min, 26 min功能：mina、b基因是促進(jìn)微細(xì)胞 (不含dna) 形成的相關(guān)基因。mina、b 基因的變異阻害了微細(xì)胞的形成，可以提高克隆體的表達(dá)效率。rela（relaxed）map position

43、：63 min功能：rela是松弛調(diào)節(jié)基因，對(duì)rna的合成具有調(diào)節(jié)抑制作用。同時(shí)rela基因還表達(dá)atp：gtp3'-焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)在氨基酸饑餓狀態(tài)下鳥苷3'，5'-二磷酸 (ppgpp) 的合成，以適應(yīng)饑餓環(huán)境。 rela基因的變異對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄有利。glnv（glutamine）map position：16 min功能：glnv基因?qū)ｉT負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄谷氨酸t(yī)rna（轉(zhuǎn)運(yùn)rna)，glnv基因的變異使以谷氨酸為主的蛋白質(zhì)的合成受到阻害。tyrt（tyrosine）map position：27 min功能：tyrt基因?qū)ｉT負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄酪氨酸t(yī)rna（轉(zhuǎn)運(yùn)rna)，tyr

44、t基因的變異使以酪氨酸為主的蛋白質(zhì)的合成受阻。常用大腸桿菌 (k-12株來源) 的基因型紫字表示takara銷售的感受態(tài)細(xì)胞菌株* pmc9 is pbr322 with lac i q inserted.1) maniatis, t., fritsh, e. f. and sambrook, j. (1989) "molecular cloning" a laboratorymanual 2nd. ed.2) young, r. a. and davis, r. w. (1983) science 222, 778-782.3) yanisch-perron, c., v

45、ieira, j. and messing, j. (1985) gene 33, 103-119.pbr322 dna (4361 bp) 的限制酶切位點(diǎn)圖本圖所表數(shù)字是以ecor i位點(diǎn)中央計(jì)為0，從順時(shí)針方向計(jì)算，至各酶切位點(diǎn)的第一個(gè)堿基的數(shù)。在圓的內(nèi)部所表示的各限制酶是在pbr322 dna 上只有一個(gè)酶切位點(diǎn)的酶。圓外所表示的各酶是在pbr322 dna上有2個(gè)至3個(gè)的酶切位點(diǎn)的酶，( ) 內(nèi)的數(shù)是酶切位點(diǎn)數(shù)。紫字表示takara銷售的限制酶。1) sutcliffe, j. g. (1979) cold sping harbor symposium 43, 77-90.2) peden, k. w. c. (1983) gene 22, 277-280.3) watson, n. (1988) gene 70, 399-403.a : 切斷數(shù) b : 限制酶 c : 酶切位點(diǎn)的第一個(gè)堿基的位置 d : 切下片段的堿基數(shù)（從小排列） 紫字表示takara銷售的限制酶。puc19 dna (2686 bp) 的限制酶切位點(diǎn)圖本圖所表數(shù)字是以tcgcgcgttt的第一個(gè)t作為1，以此按順時(shí)針方向計(jì)算，至各酶切位點(diǎn)的第一個(gè)堿基的數(shù)。在圓的內(nèi)部所表示的各限制酶是在puc19 dna上只有一個(gè)酶切位點(diǎn)的酶。圓外所表示的各酶是在puc