分子生物學(xué)實驗方法與步驟1

1、dna分子的限制性內(nèi)切酶消化 限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱為限制酶識別序列的dna序列位點上并在此切割雙鏈dna。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識別長度為4、5或6個核苷酸且呈二重對稱的特異序列，切割位點相對于二重對稱軸的位置因酶而異。一些酶恰在對稱軸處同時切割dna雙鏈而產(chǎn)生帶平端的dna片段，另一些酶則在對稱軸兩側(cè)相對的位置上分別切斷兩條鏈，產(chǎn)生帶有單鏈突出端（即粘端）的dna片段。1個單位限制性內(nèi)切酶是指在最適條件下，在50l體積1小時內(nèi)完全切開1g噬菌體dna所需的酶量。不同的限制性內(nèi)切酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反應(yīng)條件，甚至對同一種酶也如此。但是，幾乎所有的生產(chǎn)廠家都對其生產(chǎn)的酶制

2、劑優(yōu)化過反應(yīng)條件，因此購買的內(nèi)切酶說明書上均有其識別序列和切割位點，同時提供有酶切緩沖液（buffer，10×、5×）和最適條件，使得酶切反應(yīng)變得日益簡單。一、限制性內(nèi)切酶對dna消化的一般方案1.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。2.20l體積反應(yīng)體系如下： dna 0.2-1 g 10×酶切buffer 2.0 l 限制性內(nèi)切酶 1-2 u（單位） 加ddh2o 至 20 l    限制性內(nèi)切酶最后加入，輕輕混勻，稍加離心，放置于最適溫度水浴并按所需的時間溫育，一般為37水浴消化1hr。3.用于回收酶切片段時，反

3、應(yīng)總體積可達(dá)50-200l，各反應(yīng)組分需相應(yīng)增加。4.多種酶消化時若緩沖液條件相同，可同時加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化。5.酶切結(jié)束時，加入0.5m edta（ph 8.0）使終濃度達(dá)10mm，以終止反應(yīng)。或?qū)⒎磻?yīng)管在65水浴放置10min以滅活限制性內(nèi)切酶活性。6.如消化反應(yīng)體積過大，電泳時加樣孔盛不下，可加以濃縮：終止反應(yīng)后，加入0.6體積的5m乙酸銨（或1/10體積3m naac）和2倍體積無水乙醇，在冰上放置5min，然后于4離心12000g× 5min。傾去含大部分蛋白質(zhì)的上清液。于室溫晾干dna沉淀后溶于適量te中（ph 7.6）。7.如要純

4、化消化后的dna，可用等體積酚/氯仿（11）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。二、電泳檢測 取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物適量，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，以未經(jīng)酶切的質(zhì)?；?和酶切的空載體（如有）作對照，采用 1-5v/cm的電壓，使dna分子從負(fù)極向正極移動，至合適位置取出置紫外燈下檢測，攝片。 三、注意事項1. 濃縮的限制性內(nèi)切酶可在使用前以1×限制酶緩沖液稀釋，切勿用水稀釋以免酶變性。2. 購買的限制性內(nèi)切酶多保存于50%甘油中，于-20是穩(wěn)定的。進行酶切消化時，將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即混勻，再從-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時都應(yīng)更換一個無菌吸頭，以免酶

5、被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回-20冰箱。3.盡量減少反應(yīng)體積，但要確保酶體積不超過反應(yīng)總體積的10%，否則酶活性將受到甘油的抑制。4.通常延長時間可使所需的酶量減少，在切割大量dna時可用。在消化過程中可取少量反應(yīng)液進行微量凝膠電泳以檢測消化進程。5.注意星號酶切活力。dna片段回收與純化 質(zhì)粒、噬菌體等經(jīng)酶切，電泳；pcr產(chǎn)物經(jīng)電泳后，常常需要對一些dna電泳片段進行回收和純化，用于亞克隆、探針標(biāo)記等。dna回收和純化常用方法有壓碎法、低融點瓊脂糖法、凍融法等，也有現(xiàn)成的試劑盒供應(yīng)。一、凍融法1. 紫外燈下仔細(xì)切下含待回收dna的膠條，將切下的膠條（小于0.6g）搗碎，置于

6、1.5ml離心管中；2. 加入等體積的tris-hcl飽和酚（ph 7.6），振蕩混勻；3. -20放置5-10min；4. 4離心10000g×5min，上層液轉(zhuǎn)移置另一離心管中；5. 加入1/4體積h2o于含膠的離心管中，振蕩混勻；6. -20，放置5-10min；7. 4離心10000g×5min，合并上清液；8. 用等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次，取上清；9. 加入1/10體積3m naac（ph 5.2）、2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻；10. -20，靜置30min；11. 4離心13000g×10min，棄上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；1

7、2. 加適量h2o或te溶解沉淀。二、dna回收試劑盒（qiaquick gel extraction kit protocol）1.   紫外燈下仔細(xì)切下含待回收dna的凝膠，置1.5ml離心管中，稱重。2.   加入buffer qg（每100mg凝膠加buffer qg 300l），置50水浴10min。3.   若回收片段小于500bp或大于4kb，則需加入異丙醇（每100mg凝膠加異丙醇100l），混勻。4.   將小柱放在2ml收集管上，將上述溶液加于柱上。5.   4離心13000

8、g×1min，棄去收集管中液體。6.   加入500l buffer qg于柱上，4離心13000g×1min，棄去收集管中液體。7.   加入750l buffer pe于柱上，4離心13000g×1min，棄去收集管中液體。8.   4離心13000g×1min。棄去收集管。9.   將柱放于一新1.5ml離心管上，加50l eb于柱上。放置1min，4離心13000g×1min。10. 取5l 回收dna電泳檢測。三、 注意事項 紫外燈下切下含待回收dna的凝

9、膠時，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無dna污染的新刀片，其目的在于防止外源dna的污染。mrna差別顯示技術(shù)mrna差別顯示技術(shù)也稱為差示反轉(zhuǎn)錄pcr（differential display of reverse transcriptional pcr）簡稱為ddrt-pcr。它是將mrna反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與pcr技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來的一種rna指紋圖譜技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因。差別基因表達(dá)（differential gene express）是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)。mrna差別顯示技術(shù)正是對組織特異性表達(dá)的基因進行分離的一種快速而行之有效的方法。該方法的基本原理是首先選取不

10、同的組織樣品或不同發(fā)育階段的同一組織樣品或同一組織樣品經(jīng)不同藥物處理誘導(dǎo)的樣品，經(jīng)總rna提取后，進行mrna反轉(zhuǎn)錄合成cdna。此cdna的合成是采用oligo（dt）12 mn為引物，其中m為a，c，g中的任意一種，n為a，c，g或t中的任意一種，所以共有12種oligo（dt）12 mn引物，其中m稱為錨定堿基，起增大引物tm值的作用，n稱為分類堿基，對反轉(zhuǎn)錄進行分類。用這12種引物分別對同一總rna樣品進行cdna合成，即進行12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而使反轉(zhuǎn)錄的cdna具有12種類型，也就是對cdna進行12種歸類（目前較為流行的方法是進行4種歸類，即m為簡并堿基的形式存在），在此基

11、礎(chǔ)上對每一類cdna進行隨機引物和反轉(zhuǎn)錄引物pcr擴增，通過對組織樣品的同一類cdna的pcr選擇性擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析，從而反映出不同樣品間基因的時間和空間上組織特異性的表達(dá)。如此眾多種類的mrna反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)pcr選擇擴增后其類型依然為數(shù)眾多，很難用電泳系統(tǒng)加以快速準(zhǔn)確地分離。因而需要對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna進行歸類處理，減輕不同pcr產(chǎn)物電泳分離的難度，提高分離的準(zhǔn)確率。（見示意圖）一、實驗流程：對照組的總rna提取mrna完整性鑒定實驗組的總rna提取mrna完整性鑒定 錨定引物逆轉(zhuǎn)錄成cdna錨定引物逆轉(zhuǎn)錄成cdna 采用隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄引物進行選擇性pcr擴增采用隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄引物進

12、行選擇性pcr擴增 擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析ß差異性條帶的回收與第二次擴增ßnorthern雜交，southern雜交再次確定差異性條帶的真實性ß差異性條帶的克隆、測序、分析，dna及氨基酸序列聯(lián)機檢索ß以差異性條帶為探針克隆出基因組文庫中的基因序列及cdna文庫中的全長cdna序列ß基因功能的鑒定：knock outdominant negative mutation原核系統(tǒng)或真核系統(tǒng)中的表達(dá)翻譯?？贵w的制備，細(xì)胞內(nèi)的定位，抗體抑活等等。one hybrid判斷出該基因的“啟動”基因。two hybrid判斷出該基因的產(chǎn)物的作用途徑。這里以c

13、lontech公司生產(chǎn)的deltatm differential display kit為例，介紹具體的實驗步驟。該試劑盒中含有10種任意引物和9種oligo(dt)引物。操作步驟1總rna的提?。ㄒ妌orthern 雜交）2第一鏈合成：(1)總rna樣品 2g；cdna合成引物 1l；加ddh2o補至5l。將管標(biāo)號為1a,2a,pc a等。pc為陽性對照。(2)混勻后稍離心。(3）70孵育3min，冰浴2min后稍離心。(4）準(zhǔn)備dntp mix (以5管為例 ) 每管 5管 5×第一鏈緩沖液 2l 10l dntpmix（各5mm） 2l 10l mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶（200u/l）

14、 1l 5l 總體積 5l 25l(5）每管加入5l，混勻后稍離心。(6）42孵育1hr。(7）75 10min終止反應(yīng)后置冰上，稍離心。(8)將2l反應(yīng)液分別轉(zhuǎn)至新管中（新管標(biāo)號為1b,2b,pc b等）。(9) 將78l ddh2o分別加入b管中,混勻。(10)將72l ddh2o分別加入a管中，混勻。(11）將所有cdna稀釋液 -20保存待用。3dd-pcr: 以 引物p1,t9為例說明 （0.5ml pcr管,1代表對照組,2代表實驗組） 管號 cdna樣品 引物 (1) 1a p1,t9 (2) 1b p1,t9 (3) 2a p1,t9 (4) 2b p1,t9 (5) h2o

15、p1,t9 (6) rna1 p1,t9 (7) rna2 p1,t9 以下為陽性對照反應(yīng)體系 (8) pc 1a p10,t8 (9) pc 1b p10,t8 (10) pc 2a p10,t8 (11) pc 2b p10,t8 (12) h2o p10,t8 (13) pc rna1 p10,t8 (14) pc rna2 p10,t8 在pcr 管中加入: cdna樣品 1l p引物 1l t 引物 1l 準(zhǔn)備其它 pcr試劑的混合液: (在另一管中加入) 成分 每管(l) 所需管數(shù)( n=14) 10×buffer 2.0 2n ddh2o 14.0 14n dntpmi

16、x 0.2 0.2n -32p datp 0.4 0.4n taq酶 0.4 0.4n 終體積 17.0 17 n 混勻后稍離心。 將17lpcr混合液加入各反應(yīng)管，則各管總體積為20l。 開始pcr擴增。 pcr循環(huán)參數(shù)： 在geneamp pcr systems 2400 & 9600 擴增儀上執(zhí)行以下程序： 94 5min 1 cycles 40 5min 68 5min 94 30sec 2 cycles 40 30sec 68 5min 94 20sec 23 cycles 40 30sec 68 2min 1 cycles 68 7 min。 反應(yīng)結(jié)束后置-20保存?zhèn)溆谩?

17、4電泳和放射自顯影(1）配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠，灌注測序板。(2）預(yù)電泳30min。(3）每個dd-pcr反應(yīng)取出5l于一新微量離心管中，加5l loading buffer，混勻，離心，置94變性2min。立即置冰浴。(4)停止預(yù)電泳，沖洗加樣孔。(5)加樣2l。70w電泳2.75hr至二甲苯青到達(dá)膠的底部。(6）下膠：（同測序膠）(7）干膠：在膠表面覆上保鮮膜，80干膠30min。(8)x光片-70曝光過夜或更長時間(根據(jù)射線強度而定)。圖2-6顯示了dd-pcr放射自顯影的x光片5差異條帶回收再擴增(1）x光片經(jīng)d72顯影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置x光片燈上比較尋找差異條帶。用

18、一次性手術(shù)刀片在膠上切割差異條帶，加ddh2o 20l，沸水浴15min，離心取上清為模板。(3) 以原引物擴增： 回收dna 7 l 10×pcr buffer 5 l 5mm dntpmix 0.5 l 引物p 2.5 l 引物t 2.5 l taq酶 2 l 加ddh2o至總體積為50l執(zhí)行pcr程序: 933min；931min601min682min，20次循環(huán)；685min。取pcr產(chǎn)物10l 2%瓊脂糖電泳檢測。pcr產(chǎn)物乙醇沉淀，10lddh2o溶解。6以pcr產(chǎn)物為探針，標(biāo)記后進行northern雜交，證實基因的真實性。7pcr產(chǎn)物的ta克隆。8dna序列測定。9檢

19、索分析。mrna的分離與純化 真核細(xì)胞的mrna分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5端帽子結(jié)構(gòu)（m7g）和3端的poly(a)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細(xì)胞mrna的3端存在20-30個腺苷酸組成的poly（a）尾，通常用poly（a+）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mrna的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dt）纖維素或寡聚（u）瓊脂糖親合層析分離純化mrna的理論基礎(chǔ)就在于此。    mrna的分離方法較多，其中以寡聚（dt）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mrna 3末端含有poly（a+）的特點，在rna流經(jīng)寡聚（dt）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用

20、下，mrna被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mrna被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dt）纖維柱后，即可得到較高純度的mrna。寡聚(dt)纖維素柱純化mrna一、試劑準(zhǔn)備13m醋酸鈉（ph 5.2）20.1m naoh31×上樣緩沖液：20mm tris-hcl(ph 7.6)；0.5m nacl；1m edta（ph 8.0）；0.1%sls(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制tris-hcl(ph 7.6)、nacl、edta（ph 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65時，加入經(jīng)65溫育（30min）的10%sls

21、至終濃度為0.1%。4洗脫緩沖液：10mm tris-hcl(ph 7.6)；1mm edta(ph 8.0)；0.05% sds5無水乙醇、70%乙醇6depc二、操作步驟1將0.5-1.0g寡聚（dt）-纖維懸浮于0.1m的naoh溶液中。2用depc處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)奈?，將寡聚（dt）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的depc h2o洗柱。3使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液ph值小于8.0。4將rna溶解于depc h2o中，在65中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng)rna上樣液全部進入柱床后，

22、再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。5將所有流出液于65加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，od260測定rna含量。前部分收集管中流出液的od260值很高，其內(nèi)含物為無poly(a)尾的rna。后部分收集管中流出液的od260值很低或無吸收。7用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫poly(a+)rna，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。8od260測定poly(a+)rna分布，合并含poly(a+)rna的收集管，加入1/10體積3m naac（ph5.2）、2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混

23、勻，-20放置30min。94離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。注意：此時poly(a+)rna的沉淀往往看不到。4離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。10. 用適量的depc h2o溶解rna。三、注意事項1整個實驗過程必須防止rnase的污染。2步驟（4）中將rna溶液置65中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞rna的二級結(jié)構(gòu)，尤其是mrna poly(a+)尾處的二級結(jié)構(gòu)，使poly(a+)尾充分暴露，從而提高poly(a+)rna的回收率；另一個目的是能解離mrna與rrna的結(jié)合，否則會導(dǎo)致rrna的污染

24、。所以此步驟不能省略。3十二烷基肌氨酸鈉鹽在18以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫低于18最好用licl替代nacl。4寡聚（dt）-纖維素柱可在4貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用naoh、滅菌 ddh2o、上樣緩沖液洗柱。5一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5g poly(a+)rna，約相當(dāng)于上柱總rna量的1%-2%。northern blot繼分析dna的southern雜交方法出現(xiàn)后，1977年alwine等人提出一種與此相類似的、用于分析細(xì)胞總rna或含poly a尾的rna樣品中特定mrna分子大小和豐度的分子雜交技術(shù)，這就是與southern相對應(yīng)而定名的n

25、orthern雜交技術(shù)。這一技術(shù)自出現(xiàn)以來，已得到廣泛應(yīng)用，成為分析mrna最為常用的經(jīng)典方法。 與southern雜交相似，northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的rna分離開來，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的dna或rna探針，依據(jù)其同源性進行雜交，最后進行放射自顯影（或化學(xué)顯影），以目標(biāo)rna所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強度則可提示目標(biāo)rna在所測樣品中的相對含量（即目標(biāo)rna的豐度）。但與soughern雜交不同的是，總rna不需要進行酶切，即是以各個rna分子的形式存在，可直接應(yīng)用于電泳；此外，由于

26、堿性溶液可使rna水解，因此不進行堿變性，而是采用甲醛等進行變性電泳。雖然northern也可檢測目標(biāo)mrna分子的大小，但更多的是用于檢測目的基因在組織細(xì)胞中有無表達(dá)及表達(dá)的水平如何。一、 試劑準(zhǔn)備1.    0.5m edta: edta 16.61g加ddh2o至80ml, 調(diào)ph至8.0, 定容至100ml。2 50mm naac: naac 3.4g 加ddh2o至500ml, 加depc 0.5ml, 振蕩, 37過夜，高壓滅菌。3 5×甲醛凝膠電泳緩沖液: mops 3-(n-瑪琳代)丙磺酸 10.3g加50mm naac 400ml, 用

27、2n naoh調(diào)ph至7.0, 再加入0.5m edta 10ml, 加depc h2o至500ml。無菌抽濾，室溫避光保存。4 20×ssc: nacl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加ddh2o至800ml，用2n naoh調(diào)ph至7.0，再用ddh2o定容至1000ml。depc處理、高壓滅菌。5. 6×ssc: 20×ssc 300ml加ddh2o至1000ml。depc處理,高壓滅菌。650×denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(bsa)0.5g加dd h2o至50ml,無菌抽濾、分裝。71m na2

28、hpo4: na2hpo4·12h2o 35.81g, 加dd h2o至100ml。8. 1m nah2po4: nah2po4·2h2o 15.6g, 加dd h2o至100ml。9. 0.1m 磷酸鈉緩沖液(ph 6.6): na2hpo4 35.2ml加nah2po4 64.8ml 。10.ste緩沖液: 1m tris-hcl(ph 8.0) 2.5ml,0.5m edta, 0.5ml,5m nacl 5ml，加dd h2o至250ml。11.預(yù)雜交液: 20×ssc 5ml,甲酰胺10ml,50×denhardt 4ml,1m磷酸鈉緩沖液0.

29、2ml（ph6.6）,10%sds 1ml, 總體積 20ml。臨用前加入變性鮭魚精dna（10mg/ml）,使終濃度為4l/ml。12. depc h2o: 1000mldd h2o中加入depc 1ml，充分振蕩，37過夜，高壓滅菌。二、操作步驟1. 總rna提?。阂娤嚓P(guān)內(nèi)容。2.  變性膠的制備：取瓊脂糖0.2g，加入depc h2o 12.4ml，加熱熔化，于保溫狀態(tài)下加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混勻、制膠。待膠凝固后，置1×甲醛凝膠電泳緩沖液中預(yù)電泳5min。3. 樣品制備：取總rna4.5l(約20-30g) ，加入5&

30、#215;甲醛凝膠電泳緩沖液 4.0l、37%甲醛3.6l、甲酰胺10l，65溫育15min、冰浴5min。加入eb（1g/l）1l、上樣緩沖液2l。4. 電泳：上樣，50v電泳（電泳時間約2hr左右）。電泳結(jié)束后將膠塊置紫外燈下，觀察rna的完整性，記錄18s、28s條帶的位置（離加樣孔的距離）。5.    將rna從變性膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜：(1) 按膠塊大小剪取膜一張，用depc水中浸濕后，置于20×ssc中浸泡1hr。剪去膜一角。(2)將膠塊切去一角，并在20×ssc浸泡15min×2次。(3)用長和寬均大于凝膠的一塊

31、有機玻璃板作為平臺，將其放入大的干烤皿上，上面放一張whatman 3mm濾紙，倒入20×ssc使液面略低于平臺表面，當(dāng)平臺上方的3mm濾紙濕透后，用玻棒趕出所有氣泡。(4)將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺上濕潤的3mm濾紙中央，3mm濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡。(5)用parafilm膜圍繞凝膠四周，以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至膠上方的紙巾。(6) 在凝膠上方放置預(yù)先已浸濕的尼龍膜，排除膜與凝膠之間的氣泡。(7) 將二張已濕潤的、與凝膠大小相同的3mm濾紙置于膜的上方，排除濾紙與濾膜之間的氣泡。(8) 將一疊（5-8cm厚）略小于3mm濾紙的紙巾置于3mm濾紙的上方，并在紙巾上方放一塊

32、玻璃，然后用一個重約500克的重物壓在玻璃板上。其目的是建立液體自液池經(jīng)凝膠向膜上行流路，以洗脫凝膠中的rna并使其聚集在膜上。6.使上述rna轉(zhuǎn)移持續(xù)進行15hr左右。在轉(zhuǎn)膜過程中，當(dāng)紙巾浸濕后，應(yīng)更換新的紙巾。7.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的紙巾和3mm濾紙。將膜在6×ssc中浸泡5 min，以去除膜上殘留的凝膠。8.將凝膠置紫外燈下，觀察膠塊上有無殘留的rna。9.膜置80，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4保存?zhèn)溆谩?0. 探針標(biāo)記(prime-a-gene labeling system, promega公司)：（1）  取模板dna 25ng于0.5m

33、l離心管中，95-100變性5min，冰浴5min。（2）  dntpmix的制備: 取dgtp 1l、datp 1l、dttp 1l混勻。（3）將下列反應(yīng)成份混合，加入上述微量離心管中： dntpmix 2.0l bsa(10mg/ml ) 2.0l 5×buffer 10.0l klenow 酶(5u/l) 1.0l -32p-dctp 5.0l 加入適量dd h2o使反應(yīng)總體積達(dá)50l，輕輕混勻。室溫下反應(yīng)1hr。11.預(yù)雜交：將膜的反面緊貼雜交瓶，加入預(yù)雜交液5ml，42預(yù)雜交3hr。12.雜交：將變性的探針（95-100變性5min，冰浴5min）加入到預(yù)雜交液中

34、，42雜交16hr。13.洗膜： (1)傾去雜交液。 (2)2×ssc/0.1%sds室溫洗15min。 (3)0.2×ssc/0.1%sds，55洗15min×2次。14.壓片：將膜用dd h2o漂洗片刻，用濾紙吸去膜上水份。用薄型塑料紙將膜包好，置于暗盒中，在暗室中壓上x光片。暗盒置-70放射自顯影37天左右。三、注意事項1操作時必須仔細(xì)、小心，嚴(yán)格按同位素操作規(guī)程進行，以防止同位素污染。2必要時，可采用sephades g-50柱層析法純化標(biāo)記的探針（見本節(jié)附錄），以去除標(biāo)記反應(yīng)中未結(jié)合的（游離的）核苷酸。3膜的重復(fù)使用：結(jié)合了待測rna的膜與探針雜交后，可

35、經(jīng)堿或熱變性方法將探針洗脫，膜可反復(fù)使用與其它探針雜交。方法如下：雜交的膜（注意：雜交過的膜在保存過程中不能干燥，否則探針將會與膜形成不可逆的結(jié)合）置 100 0.5% sds中煮沸3min，自然冷卻至室溫后，將膜放入雙蒸水中漂洗2-3遍。取出膜，用濾紙吸去膜表面的水份。將膜直接進行另一種探針的雜交或用保鮮膜包好，室溫下真空保存。pcr產(chǎn)物的克隆 pcr產(chǎn)物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。    平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的pcr產(chǎn)物直接進行連接。載體可用ecor v或sma i切成平頭；pcr產(chǎn)物純化后，可以在22用dna聚合酶i作用30m

36、in（利用該酶所具有的35外切酶活性和53的聚合酶活性）。如果要求不高，pcr產(chǎn)物也可不加處理。如果使用stratagene公司的pfu dna聚合酶或new england biolabs公司的vent dna聚合酶，這兩種酶有53校對能力，擴增出來的pcr產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入peg 8000，也只能很有限地提高效率。    粘頭連接也可以大致分為兩類，一類粘頭連接是用某種方法，在載體和pcr產(chǎn)物上產(chǎn)生長的可互補的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5端加入一段某種

37、限制酶的識別序列。如果兩個引物選用不同的限制性內(nèi)切酶識別序列，就可以做到定向連接。另一類利用部分pcr產(chǎn)物3端帶有一個凸出的damp的特性，構(gòu)建3端帶有凸出的dtmp的載體。一般采用的方法是先把載體用某種限制性內(nèi)切酶消化成平頭，在70或72下在只加入一種dntp、即dttp的反應(yīng)體系中用taq dna聚合酶處理半小時（也有人報道處理12小時能提高克隆效率，這樣加t反應(yīng)會更徹底）。也可以用末端轉(zhuǎn)移酶來完成加t反應(yīng)。載體自連、pcr產(chǎn)物串連可以忽略。如果使用ddttp，效果會更好。這種方法一般稱為加t/a法克隆，比平頭連接效率高50100倍。一、pcr產(chǎn)物的ta克隆 1. ta克隆構(gòu)建原理：ta克

38、隆系統(tǒng)由invitrogen公司（san diego，ca）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于pcr產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用taq酶能夠在pcr產(chǎn)物的3末端加上一個非模板依賴的a，而t載體是一種帶有3t突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把pcr產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點（mcs）中。2.操作步驟 連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。 10l體積反應(yīng)體系如下：取t載體1l (50ng)，加入等摩爾數(shù)pcr產(chǎn)物 。  加入含atp的10×buffer 1l，t4 dna連接酶合適單位，用ddh2o 補足至10l 。 稍加離心，通常為14-16

39、水浴連接8-14hr，或4過夜。 轉(zhuǎn)染，藍(lán)白斑篩選同前。二、注意事項1.要獲得目的基因的ta克隆，pcr產(chǎn)物的特異性要好。2.pcr產(chǎn)物在ta克隆前要通過純化。3.在pcr產(chǎn)物回收、純化過程中防止外來dna污染。rna操作中的一般要求在所有rna實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的rna。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（rna酶）的污染。由于rna酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而rna制劑中只要存在少量的rna酶就會引起rna在制備與分析過程中的降解，而所制備的rna的純度和完整性又可直接影響rna分析的結(jié)果，所以rna的制備與分析操作難度極大。  

40、0; 在實驗中，一方面要嚴(yán)格控制外源性rna酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的rna酶。rna酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。    外源性的rna酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實驗中使用的rna酶也會造成污染。這些外源性的rna酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的rna酶。一、 防止rna酶污染的措施1.   所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6hr或更長時間。2.   塑料器皿可用0.

41、1% depc水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3.   有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% h2o2 室溫10min，然后用0.1% depc水沖洗，晾干。4.   配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% depc，在37處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的depc。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用depc處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22m濾膜過濾除菌。5.   操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6.   設(shè)置rna操作專

42、用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。二、常用的rna酶抑制劑1.  焦磷酸二乙酯（depc）：是一種強烈但不徹底的rna酶抑制劑。它通過和rna酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。2.  異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的rna酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使rna酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對rna酶有強烈的變性作用。3.  氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和rna酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制rna酶的活性。4.  rna酶的蛋白抑制劑（rnasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得

43、來的酸性糖蛋白。rnasin是rna酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種rna酶結(jié)合，使其失活。5.  其它：sds、尿素、硅藻土等對rna酶也有一定抑制作用。rna酶保護試驗     rna酶保護試驗(rnase protection assay,rpa)是通過液相雜交的方式,用反義rna探針與樣品雜交，以檢測rna表達(dá)的技術(shù)。與northern雜交和rt-pcr比較，rpa有以下幾個優(yōu)點：1 檢測靈敏度比northern雜交高。由于northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而rpa將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高

44、了靈敏度。2 由于pcr擴增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺”問題，基于pcr產(chǎn)物量進行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而rpa沒有擴增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實性較高。3 由于與反義rna探針雜交的樣品rna僅為該rna分子的部分片段，因此，部分降解的rna樣品仍可進行分析。4 步驟較少，耗時短。與northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。5 rna-rna雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復(fù)性問題，無須封閉。6 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7 檢測分子長度可以任意設(shè)置，靈活性大。    rpa的缺點是需要同位素標(biāo)記探針。一、試劑準(zhǔn)備1 gacu

45、 pool：取100mm atp、ctp、gtp各2.78l、100mm utp 0.06l，加depc h2o至100l。2.    雜交緩沖液:pipes 0.134g、0.5m edta（ph8.0）20l、5m nacl 0.8ml、甲酰胺8ml，加depc h2o至10ml。3.    rnase消化液：5m nacl 120l、1m tris-hcl(ph7.4) 20l、0.5m edta（ph8.0）20l、rnase a(10mg/ml) 8l、rnase t1(250u/l) 1l，加depc h2o至2ml二、操

46、作步驟1反義rna可由含t7或sp6啟動子的重組質(zhì)粒為模板制備，也可以用含啟動子的pcr產(chǎn)物為模板制備，本文介紹后者。（1）設(shè)計含t7啟動子的pcr引物 由于pcr產(chǎn)物將作為合成反義rna的模板，所以一對引物中的下游引物5-端要含t7啟動子序列: t7啟動子序列為：5-taatacgactcactataggg 引物設(shè)計的其他要求與一般pcr引物的設(shè)計相同。pcr產(chǎn)物的長度決定了反義rna探針的長度，具體設(shè)計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式pcr，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示： 上游引物下游引物 t7 啟動子序列下游引物

47、60;   （2）pcr 先用上游引物和下游引物進行pcr，再以pcr 產(chǎn)物為模板,用上游引物和下游引物-t7進行二次pcr(具體操作參見pcr章節(jié))。（3）探針合成標(biāo)記與純化 在0.5ml 離心管中加入下列試劑：rnasin （40u/l） 0.5l gacu pool gac （含gtp、ctp、atp各2.75 mm,utp 61m） 2l -32putp(10ci/l) 2.5l dtt (二硫蘇糖醇，0.1m) 1l 5×轉(zhuǎn)錄 buffer 2l 模板（50ng/l） 1l t7 rna 聚合酶 (15u) 1l 混合后，短暫離心，37oc保溫1hr。 加入dna

48、se（10u/l）1l, 37oc 15min, 然后75 oc 10min以滅活dnase和t7 rna 聚合酶。 加入：飽和酚 50l 氯仿 50l 酵母trna（2g/l） 4l depc h2o 100l 室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100l氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉(zhuǎn)移至另一0.5ml 離心管中，再加入3m naac 10l、預(yù)冷無水乙醇250l，混勻后，-20oc靜置30min。4oc離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100l洗滌，4oc離心13500g

49、×2min, 棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入50l雜交緩沖液溶解沉淀，4oc下保存待用?？捎媚蛩?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質(zhì)量。（參見本節(jié)電泳步驟）。 2雜交 （1）        rna提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1g/l。 （2）取8l rna加入1-3l探針（根據(jù)探針檢測結(jié)果調(diào)整）于0.5ml 離心管中。 （2）        80oc保溫2min，然后40-45oc下雜交12-18hr。 3. 消化 (1) 雜交管于37 oc保

50、溫15min，加入rnase消化液，37 oc保溫30min。 (2) 加入10%sds 10l、10g/l蛋白酶k 20l，混勻，37 oc保溫10min。 (3) 加入65l飽和酚和65l氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。 (4) 轉(zhuǎn)移上層液到另一0.5離心管中，加入10l酵母trna和3m naac 15l，再加入200l異丙醇，混勻后，置-20oc 30min，4 oc離心,135000g×10min。 (5)   棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8l上樣緩沖液溶解沉淀。 4、電泳與放射自顯影 （1）配制凝膠：(50ml) 40%丙

51、烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1） 6.25ml 5×tbe 10ml 尿素 24g加h2o至50ml 溶解后加入25%過硫酸胺50l，temed 50l，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。（2）預(yù)電泳 以1×tbe為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進行預(yù)電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應(yīng)達(dá)2000v以上，功率設(shè)定為100w，溫度設(shè)為50 oc。待膠板溫度達(dá)50 oc時，暫停電泳，準(zhǔn)備加樣。 （3）加樣 將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 oc加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預(yù)電泳）。 （3）     

52、;   電泳結(jié)束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張x片，蓋上暗盒，-70oc曝光1-3天。暴光結(jié)束后，將x光片顯影、定影、水洗、晾干。   三、注意事項   1本實驗大部分為rna操作，注意rna酶的污染。 2rnase消化液消化未雜交的單鏈rna和探針rna，當(dāng)探針與樣品之間有堿基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產(chǎn)生片段較小的雜交片段。因此進行pcr時，采取盡量減少錯配的措施。3、 同位素對rna合成有一定影響，有時會產(chǎn)生非全長的探針。因此，標(biāo)記時間不宜過長。4、 rnase消化液有時會產(chǎn)生過度消化而無檢測

53、信號，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。southern 雜交 southern 雜交是分子生物學(xué)的經(jīng)典實驗方法。其基本原理是將待檢測的dna樣品固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相dna的位置上顯示出雜交信號。通過southern雜交可以判斷被檢測的dna樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。該項技術(shù)廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測、dna指紋分析和pcr產(chǎn)物判斷等研究中。但由于該技術(shù)的操作比較煩瑣、費時，所以現(xiàn)在有一些其他的方法可以代替southern 雜交。但該技術(shù)也有它的獨特之處，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多態(tài)性(rflp)的檢測等。一、基因組dna的制備（前述）二、基因組dna的